（开平市中心医院胸外科 广东 开平 529300）
【摘要】目的：为了探讨lncRNA PCAT19在人肺癌细胞株A549中的作用，通过shRNA敲低lncRNA PCAT19的表达，之后再观察lncRNA PCAT19对肺癌细胞的增值与侵袭作用。方法：首先将人肺癌细胞株A549细胞培养后分为研究组和对照组，研究组转染lncRNA PCAT19 shRNA，对照组转染control-shRNA，之后采用qRT-PCR的方法分别检测研究组和对照组中肿瘤细胞的lncRNA PCAT19的表达量，并且，通过采用MTT和侵袭实验的方法来分别观察两组肿瘤细胞的增殖能力和侵袭能力。结果：我们通过qRT-PCR检测发现，研究组A549肿瘤细胞中lncRNA PCAT19的表达量为0.421±0.030，而对照组中lncRNA PCAT19的表达量为1.116±0.078比较，两组间的差异具有统计学意义（t=7.036，P＜0.01），说明通过shRNA可以减低lncRNA PCAT19在肺癌A549细胞中的表达；MTT结果显示，研究组A549细胞的OD值为0.542±0.029，而对照组A549细胞的OD值为0.719±0.065，两组间的差异同样具有统计学意义（t=3.242，P＜0.01），说明lncRNA PCAT19表达下调具有明显抑制肺癌A549细胞的增值能力；侵袭实验结果显示，研究组中的A549细胞穿过基质胶的数量为71.2±9.1，而对照组中的A549细胞穿过基质胶的数量为149.6±12.8比较，两组间的差异具有统计学意义（t=6.813，P＜0.01），说明lncRNA PCAT19表达下调具有明显抑制肺癌A549细胞的侵袭能力。结论：敲低lncRNA PCAT19的表达具有明显抑制人肺癌细胞株A549的细胞增殖与侵袭的作用。
【关键词】肺癌；lncRNA PCAT19；增殖；侵袭
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）20-0106-02
虽然目前在肺癌的诊断和治疗中已经进行了大量的研究，如靶向治疗和免疫治疗等，但患者的长期预后仍然不理想，复发和转移是肺癌相关死亡的主要原因[1]。因此，我们迫切需要深入研究肺癌发生发展的潜在分子机制，并探索新的生物标志物和治疗方式供临床转化。
长链非编码RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）属于非蛋白质编码核苷酸，是一类新的快速出现的转路子大家族，其长度大多超过200个核苷酸，其不但可以影响正常生理过程，而且也参与人类肿瘤的发生、发展和转移，目前已经引起了人们的极大关注并成为了肿瘤领域深入研究的热点之一[2]。目前已经有部分lncRNAs被证明通过在转录、转录后和表观遗传水平等层面参与了癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程。并且，有研究表明，靶向癌症或肿瘤转移相关的lncRNAs可以阻断癌细胞的增值和存活、逆转肿瘤的耐药和转移[2-3]。因此，lncRNAs对癌症的发生和疾病进展至关重要，有望成为新的治疗靶点。lncRNA PCAT19是lncRNAs中的一个重要成员，其在前列腺癌细胞中的表达出现明显上调，且其高表达与肿瘤的发展及患者的不良预后存在明显的相关性[3]，然而其在肺癌中的作用至今未见报道。本研究为了探讨lncRNAs在肺癌中的临床应用价值，通过沉默lncRNA PCAT19在人肺癌细胞株A549中的表达，探讨lncRNA PCAT19表达下调对人肺癌细胞株A549的增值与侵袭的作用。
1.资料与方法
1.1 主要材料和试剂
control-shRNA和lncRNA PCAT19-shRNA通过英伟创津公司设计并构建，转染试剂Lipofectamine 2000从美国英伟创津公司购入，MTT粉通过美国西格玛公司购入，RNA抽提试剂盒购于美国应用生物系统公司，Transwell小室从美国Becton Dickinson公司购入。
1.2 细胞转染方法
首先将生长状态良好的肺癌A549细胞培养后分为两组：研究组和对照组。待培养的细胞密度达50%～60%左右后开始转染，转染开始前分别用不含血清的Opti-MEM培养液稀释100pmol候选转染质粒与5μl的转染试剂lipofectamin2000，将其两者混匀后，放在室温孵育约5min后开始转染。对照组转染control-shRNA，研究组转染lncRNA PCAT19-shRNA，约48h后再收集细胞进行后续实验。
1.3 细胞增殖（MTT法检测）
同时消化上述两组细胞，在96孔板中分别加入200μl约5×103个细胞，培养细胞约48h后取出，每孔加20μl MTT液，再培养约4h后取出，每孔中再加入150μl DMSO，低速振荡10min后检测吸光值。选择酶标仪波长为570nm后测定各孔吸光值，实验重复3次。
1.4 Transwell侵袭实验
分别从上述两组细胞（研究组和对照组）中吸取100ul（1×105个细胞/ml）的细胞悬液至transwell小室的上室，在下室中加入RPMI-1640培养液500μL（含10%胎牛血清），将其放在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24～36h后，擦弃小室中上层未穿过基质胶的细胞，用1X PBS液轻洗1～3遍，之后再用4%的多聚甲醛将transwell小室固定，待其结晶祡染色后再用1X PBS液反复冲洗，倒置，晾干。最后使用光学显微镜进行肿瘤细胞的计数（取平均值），实验重复3次。
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1.5 统计学方法
本研究所有数据均采用SPSS22.0软件进行统计学分析。其中所有的实验结果均以x-±s表示。组间采用双侧t检验比较分析。当P＜0.05时，为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 研究组A549细胞中lncRNA PCAT19的表达水平明显下调
通过qRT-PCR检测发现，研究组A549细胞中lncRNA PCAT19的mRNA表达量为（0.421±0.030），与对照组（1.116±0.078）进行比较，差异具有统计学意义（t=7.036，P＜0.01），说明通过shRNA可以减低lncRNA PCAT19的在肺癌细胞中的表达。
2.3 研究组A549细胞的增殖能力明显降低
MTT实验结果显示，对照组的A549细胞的OD值为0.719±0.065，而研究组的A549细胞的OD值0.542±0.029，两组间的差异具有统计学意义（t=3.242，P＜0.01），结果提示，与对照组相比，研究组A549细胞的增值能力明显降低。
2.4 研究组A549细胞的侵袭能力明显减弱
通过Transwell侵袭实验，我们发现，研究组穿过基质胶的A549细胞数量为（71.2±9.1），而对照组穿过基质胶的A549细胞数量达（149.6±12.8），两组间的差异均具有统计学意义（t=6.813，P＜0.01）。结果提示，与对照组相比，研究组A549细胞的侵袭能力明显减弱。
3.讨论
我们在肺癌细胞中通过shRNA敲减沉默lncRNA PCAT19的表达量，可以抑制肺癌细胞的增值和侵袭作用。徐帅等人[4]发现lncRNA PCAT19在喉癌组织中的表达较癌旁组织中明显升高，且其在晚期患者的肿瘤组织中表达亦升高，且与患者预后呈正相关；lncRNA PCAT19亦可通过PCAT19/miR-182/PDK4轴诱发Warburg效应而促进喉癌的增值与侵袭。另外，lncRNA PCAT19也可以靶向结合HNRNPAB促进肿瘤的生长和转移[3]。这些结果均表明，lncRNA PCAT19是促进肿瘤增值和恶性进展的因子。
近年来lncRNAs在人类癌症中的生物学功能引起了人们的广泛关注，其在肿瘤中的差异性表达不但参与了肿瘤的发生，也可以作为肿瘤疗效预测标志物指导临床决策。lncRNA DSCAM-AS1和MIR31HG不仅可通过靶基因分别调控肺癌细胞的进展，还可预测肿瘤的预后[5-6]。然而，我们未检测lncRNA PCAT19在肺癌组织中的表达，无法评估其预后作用，因此，深入研究肺癌患者组织标本中lncRNA PCAT19的表达和生物学作用及其可能的分子机制，具有潜在的临床应用价值。
【参考文献】
[1] Hirsch FR1,Scagliotti GV2,Mulshine JL3,et al.Lung cancer:current therapies and new targeted treatments[J]. Lancet,2017 Jan 21;389(10066):299-311.
[2] Kim J,Piao HL,Kim BJ,et al.Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis[J].Nat.Genet,2018 Dec;50(12):1705-1715.
[3] Hua JT,Ahmed M,Guo H,et al.Risk SNP-Mediated Promoter-Enhancer Switching Drives Prostate Cancer through lncRNA PCAT19[J].Cell,2018 Jul 26;174(3):564-575.
[4] Shuai Xu,Jie Guo,Wei Zhang.lncRNA PCAT19 promotes the proliferation of laryngocarcinoma cells via modulation of the miR-182/PDK4 axis[J].J Cell Biochem,2019 Mar 13.doi: 10.1002/jcb.28552.
[5] Liao J,Xie N.Long noncoding RNA DSCAM-AS1 functions as an oncogene in non-small cell lung cancer by targeting BCL11A[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2019 Feb;23(3):1087-1092.
[6] Dandan W,Jianliang C,Haiyan H,et al.Long noncoding RNA MIR31HG is activated by SP1 and promotes cell migration and invasion by sponging miR-214 in NSCLC[J].Gene,2019 Apr 15;692:223-230.
基金项目：江门市科技局医疗卫生科技计划项目（2017A2006）
论文作者:付春利
论文发表刊物:《医药前沿》2019年20期
论文发表时间:2019/9/6
标签：细胞论文; 肺癌论文; 转染论文; 肿瘤论文; 统计学论文; 小室论文; 对照组论文; 《医药前沿》2019年20期论文;