拟态弧菌毒素共调菌毛的检测及其生物学特性研究

胡守奎^[1]2004年在《拟态弧菌毒素共调菌毛的检测及其生物学特性研究》文中研究表明拟态弧菌（Vibrio mimicus）是弧菌属常见的病原菌之一，广泛分布于自然水域和水产动物体内。当水质恶化或机体免疫力下降时拟态弧菌大量生长繁殖产生多种毒力因子，不仅能引起鱼类、甲壳类等水产动物严重的弧菌病[1~4 ]，给水产养殖业造成巨大经济损失[5,6]。还可通过水产动物和水产品感染人类，引发季节流行性肠道传染病，危及人类健康。因此，对拟态弧菌的生物学特性、致病机理和疫苗研制等方面的研究具有重要意义。目前人们对霍乱弧菌（Vibrio Cholera）的致病机理研究得最为透彻，霍乱弧菌首先依靠其表面的毒素共调菌毛（Toxin　Coregulated Pilus，TCP）在小肠粘膜表面粘附定居，然后大量生长繁殖，产生毒力因子作用于靶细胞而引起腹泻。TCP作为一种重要毒力因子，广泛存在于古典型、ELTOr型和O139型霍乱弧菌表面，通过介导细菌粘附组织细胞和协同毒素基因的表达参与致病过程。关于拟态弧菌是否表达TCP，TCP在拟态弧菌致病过程中的作用及其生物学特性等方面的研究，国内尚未见有报道，国外的研究也主要集中在对不同来源的拟态弧菌进行TCP检测[7]。本研究室从省内养蟹场发病河蟹体内分离鉴定到一株毒力较强的拟态弧菌（HX4菌株），并对其外毒素进行了研究。本课题拟在应用PCR技术和电镜技术证实拟态弧菌HX4菌株为TCP+株的基础上，进一步优化TCP最佳表达条件，建立TCP提取方法和系统研究TCP的生物学特性。旨在全面揭示拟态弧菌HX-4菌株的致病机理，同时也为研制TCP疫苗预防水产动物弧菌病奠定理论基础。首先，应用PCR技术和电镜技术对拟态弧菌HX-4菌株进行TCP检测。根据基因文库中登录的霍乱弧菌tcpA基因全序列，设计一对特异性引物，对HX4菌株基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测其扩增片段的长度（617bp）与预期结果相符，表明该菌基因组结构中存在tcpA基因。同时采用电镜技术检测TCP，观察到细菌表面存在数量不一，中空、短粗的菌毛。这与国内外报道的霍乱弧菌TCP形态相吻合[8~13]。从而证实了拟态弧菌HX4菌株为TCP+株，在一定的营养与培养条件下可以表达TCP。其次，采用细菌学方法结合电镜技术优化拟态弧菌HX4菌株高表达TCP的最佳营养与培养条件。结果显示培养基的种类（AKI、CFA、BHI和LB）、培养温度（4℃、20℃、30℃和37℃）和培养方式（静置、厌氧和振荡培养）等环境参数对TCP表达均有明显影响，其最佳表达条件是：细菌接种初始pH 6.7定居因子固体培养基（CFA），30℃需氧静置培养24h。再次，采用菌毛分离技术、盐析技术和聚丙烯酰胺凝胶回收技术建立了拟态弧菌HX4菌株TCP的提纯方法。研究中比较了四种不同脱菌毛缓冲液的洗脱分离菌毛的效果，结果显示含2mol/L尿素的0.01mol/L， pH7.2的PBS缓冲液的洗脱效果最佳，其菌毛分离液中蛋白浓度最高，电泳条带最清晰。在此基础上进一步比较了3种不同饱和浓度硫酸铵（30%、50%和70%）盐析沉淀蛋白的效果，结果显示硫酸铵饱和度为70%时粗提蛋白含量最高，硫酸铵饱和度为30%时粗提蛋白含量最低。而PAGE电泳结果显示3份粗提蛋白样品的电泳图谱无明显差异。虽然经30%饱和硫酸铵盐析沉淀所得的总蛋白浓度较低，但其目的蛋白浓度相对较高，杂蛋白相对较少。因此，我们认为盐析沉淀TCP蛋白的最佳饱和硫酸铵浓度为30%。随后采用聚丙烯酰胺凝胶回收法回收纯化蛋白并进行电镜检查，确定了TCP蛋白在凝胶上的位置及其相对分子量为20.14KD。最后，应用细胞模型、肠管组织模型、动物试验和血凝试验系统研究了拟态弧菌HX4菌株TCP的生物学特性。以粘附模式细胞HEp-2细胞作为细胞模型，以本种动物河蟹肠管作为组织模型，测定拟态弧菌HX4菌株的组织细胞粘附性。结果显示TCP+菌和TCP-菌对河蟹肠管的粘附率分别为32.2%和0.4%；对细胞平均粘附菌数分别为16.03±4.669（﹥10）和6.8±2.06（﹤10），前者是粘附阳性菌，后者则为粘附阴性菌。表明HX4菌株对组织细胞的粘附作用主要是由TCP所介导，TCP是拟态弧菌的一种重要粘附因子。细菌毒力试验结果显示TCP+菌对小鼠和河蟹的LD50分别是1.7×107CFU/mL和2.08×106CFU/mL；而TCP-菌对小鼠和河蟹的LD50分别为2.13 ×108 CFU/mL和2.09×107CFU/mL，TCP+菌的毒力较大，约为TCP-菌的10-12倍。表明TCP也是拟态弧菌的一种重要毒力因子，通过介导细菌粘附组织细胞和协同毒素基因的表达参与致病过程。免疫保护性试验结果显示TCP抗体可以保护100%免疫小鼠和80%河蟹抵抗50LD50菌体的攻击。表明TCP蛋白又是一种有效的保护性抗原，诱导机体产生的TCP抗体可保护河蟹抵抗拟态弧菌的感染。提示我们可以研制TCP疫苗，预防水产动物的弧菌病。采用玻片血凝试验和微量血凝试验测定TCP+菌对不同动物红细胞的血凝谱及血凝价，结果显示TCP+菌的血凝谱较窄，仅对鸡和O型人的红细胞具有凝集作用，凝集价分别为1：16和1：64。同时发现TCP-菌也具有微弱血凝性。表明除TCP作为一种主要血凝素外，还有外膜蛋白等其它血凝素参与凝集作用。综上所述，拟态弧菌HX4菌株为TCP+株，TCP蛋白的相对分子量为20.14KD，具有致病性、组织细胞粘附性、免疫保护性和血凝性等生物学特性。

胡守奎^[2]2010年在《一株拟态弧菌毒素共调菌毛(TCP)的检测及分离纯化》文中指出目的:证实所分离的拟态弧菌为TCP+株,并建立TCP菌毛的提纯方法,为系统地测定其生物学特性,并继而全面揭示拟态弧菌致病机理和研制TCP菌苗奠定理论基础。方法:采用PCR技术、电镜技术和细菌学方法对该拟态弧菌进行毒素共调菌毛(TCP)检测及分离纯化。结果:10 g湿菌体依次经过热洗脱法分离菌毛、30%饱和硫酸铵盐析沉淀蛋白和聚丙烯酰胺凝胶回收纯化蛋白,获得1 mg纯化TCP蛋白,该蛋白的相对分子量为20.14 KD。结论:该菌株为TCP+株;建立了聚丙烯酰胺凝胶回收技术提纯菌毛,取得了良好效果。

鞠明霞^[3]2015年在《五种弧菌实时荧光定量PCR检测方法的建立》文中提出弧菌(Vibrio)种类繁多,广泛分布于自然界中,特别是在水生动物及水体中比较常见。其中霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌是较常见的致病性弧菌,不仅对动物有致病性,还严重威胁着人类健康。针对这5种弧菌,建立敏感快速的检测方法非常必要。副溶血弧菌是引起食源性细菌胃肠炎的最主要原因,主要的毒力因子是耐热直接溶血素(TDH)和耐热相关溶血素(TRH)。根据副溶血弧菌的两种毒力因子tdh、trh和种特异性基因toxR,分别设计1对特异性的引物及相应的TaqMan探针,应用于荧光定量PCR反应。通过优化反应体系和反应参数,建立单重和叁重荧光定量PCR,用于快速准确检测副溶血弧菌。研究表明,建立的方法扩增效率均在95%-110%之间;特异性试验表明,只有副溶血弧菌扩增明显,对其它细菌无扩增,表明该方法良好的特异性;单重反应灵敏度比常规PCR高出100倍,多重反应布菌检测灵敏度均在103CFU/g左右,表明该法敏感性强;重复3次试验,每组变异系数均小于1.8%,表明该方法重复性好。以霍乱弧菌的种特异性基因外膜蛋白W基因(ompW)和毒力因子霍乱毒素基因(ctx)、溶血素(hly)为靶基因,分别设计1对特异性的引物及相应的TaqMan探针,通过优化各个反应成分的浓度和反应参数,建立了叁重荧光定量PCR。单重荧光定量PCR实验发现其灵敏度比常规PCR高出了 1000倍,而在多重反应布菌检测灵敏度均小于30CFU/g;与其他细菌无扩增,表明特异性良好;重复3次试验后的每组变异系数均小于1.1%,表明该法重复性好。以创伤弧菌的毒力基因溶血素基因(vvhA)、拟态弧菌的毒力基因溶血素(vmhA)和溶藻弧菌的毒力基因胶原蛋白酶基因(vacol)为靶标,分别设计了 1对特异性的引物及相应的TaqMan水解探针,经过条件优化,在单重实时荧光定量PCR显示良好结果的基础上建立了叁重实时荧光定量PCR。该方法扩增效率均在95%-110%之间;特异性试验表明,只有创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌基因组扩增明显,表明该方法良好的特异性;单重反应灵敏度比常规PCR高出100倍,多重反应布菌检测灵敏度均在3×103-3×104CFU/g,表明该方法敏感性强;重复3次试验,每组变异系数均小于3%,表明该方法重复性好。总之,本研究针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌等,建立了实时荧光定量PCR检测方法,为5种致病弧菌感染的流行病学调查与病原监测提供了工具。

王洪月, 袁野, 周群兰, 朱健, 崔玉东^[4]2009年在《致病性弧菌主要毒力相关因子的研究进展》文中认为弧菌(Vibrio)是一种革兰氏阴性短杆菌,其广泛分布于自然界,以水中最多。弧菌是引起人类、水生动物细菌性疾病的重要病原之一。弧菌的致病性与各个毒力基因的协同作用密切相关。弧菌的毒力因子主要可分为粘附素、内毒素、外毒素等。本文主要对致病性较强的毒力因子粘附素和外毒素进行阐述,以期为弧菌致病机理的研究及弧菌病的防治提供参考和借鉴。

参考文献：

[1]. 拟态弧菌毒素共调菌毛的检测及其生物学特性研究[D]. 胡守奎. 安徽农业大学. 2004

[2]. 一株拟态弧菌毒素共调菌毛(TCP)的检测及分离纯化[J]. 胡守奎. 中国卫生检验杂志. 2010

[3]. 五种弧菌实时荧光定量PCR检测方法的建立[D]. 鞠明霞. 南京农业大学. 2015

[4]. 致病性弧菌主要毒力相关因子的研究进展[J]. 王洪月, 袁野, 周群兰, 朱健, 崔玉东. 生物技术通报. 2009

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