长沙市第一医院 湖南长沙 410005
摘要：目的：了解凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中红霉素异质性耐药的情况，通过实验室方法检测其耐药表型，提示临床合理使用药物。方法：对来自不同标本类型分离的凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌用纸片扩散法（D试验）进行筛选，并与仪器法检测的红霉素和克林霉素的耐药情况进行比较，以明确红霉素异质性耐药情况和调整相应的药敏检测结果，保证结果的准确性。结果：仪器法检出37株凝固酶阴性葡萄球菌和102株金黄色葡萄球菌中，红霉素敏感株分别为20株（20/37）和40株（40/102），在同时用D试验方法检测的过程中发现D试验阳性菌分别为8株和18株，占仪器法红霉素敏感株的40%和45%。金黄色葡萄球菌出现红霉素异质性耐药现象的菌株为12株，占仪器法红霉素敏感株的30%；凝固酶阴性葡萄球菌仅发现1例红霉素异质性耐药情况。结论：在常规检测红霉素对葡萄球菌的耐药情况时，仪器法可能会漏检部分异质性耐药的菌株。建议常规使用纸片扩散法（D试验）与仪器法同时进行葡萄球菌的耐药检测，以鉴别红霉素的异质性耐药，避免红霉素和克林霉素的错误使用。
关键词：葡萄球菌；红霉素；异质性耐药；D试验
在体外的常规药敏试验中表现为敏感的菌株如果改用特殊的方法再次检测其耐药情况，则发现有一部分细菌耐药，极少数的细菌亚群甚至出现高水平耐药，这部分耐药细菌可以导致临床应用抗生素的失败。这种细菌耐药的特殊类型即为异质性耐药。在抗生素选择性压力下，部分细菌的基因或染色体发生变异，从而导致新的耐药表型出现[1]。红霉素和克林霉素作为葡萄球菌治疗的一线药物，经济适用，但耐药情况也日趋严峻。如何正确使用这些抗菌药物，离不开微生物检测方法的改进和提高。现将139株葡萄球菌中出现的红霉素异质性耐药情况进行报道如下。
一、材料与方法
1.1 菌株来源 来自我院2013年12月至2014年10月份从临床和门诊分离的葡萄球菌，其中金黄色葡萄球菌102株，表皮葡萄球菌25株，8株为溶血葡萄球菌，沃氏葡萄球菌和人葡萄球菌各2株。标本来自于血液、痰液、尿液、前列腺液以及伤口分泌物等。多次分离自同一患者同一来源标本的不做重复计算。标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923。
1.2 仪器与试剂 细菌的鉴定和药敏检测使用生物梅里埃公司的ATB系统和相应的检测耗材。红霉素（15µg）和克林霉素（2µg）药敏纸片购自英国OXOID公司。
1.3 检测方法 标本经分离培养及涂片染色，并常规做触酶及血浆凝固酶试验。对初步分类的菌株再配置悬液上机操作鉴定和药敏试验，同时按标准的纸片扩散法操作，涂布0.5麦氏单位菌悬液于MH琼脂平板上，将红霉素和克林霉素纸片相邻放置，边缘相距15-26mm。35℃孵育16—18h后阅读结果，在靠近红霉素纸片一侧的克林霉素抑菌圈出现截平现象（形状如大写的D），即为D试验阳性，提示该菌诱导克林霉素耐药阳性。如果克林霉素抑菌圈不出现D形状现象，则D试验为阴性[2]。
1.4 异质性耐药菌株筛选 对于仪器法检测出的红霉素敏感菌株，而用纸片扩散法进行D试验时发现红霉素纸片抑菌圈内出现的数量不等的菌株为异质性耐药菌株。所有异质性耐药菌株经纯化后再次进行菌种鉴定确认及D试验。
二 结果
2.1 葡萄球菌对红霉素的耐药情况 采用仪器法常规鉴定及药敏试验中，金黄色葡萄球菌102株，红霉素敏感株为40株，占39.2%。凝固酶阴性葡萄球菌中，以表皮葡萄球菌检测最多，溶血葡萄球菌次之。红霉素敏感的凝固酶阴性葡萄球菌有20株，占54.1%。各菌株对红霉素的耐药具体情况见下表。
2.2 D试验及红霉素异质性耐药检测情况 与仪器法同步进行D试验检测。仪器法中如果红霉素耐药，克林霉素敏感，而纸片法中红霉素+克林霉素敏感，判断为诱导耐药试验阴性；如果仪器法中红霉素耐药，克林霉素敏感，而纸片法红霉素+克林霉素耐药，判断为诱导耐药试验阳性[3]。纸片法红霉素抑菌圈内出现的数量不等的菌株，而克林霉素敏感，判读为红霉素异质性耐药。金黄色葡萄球菌40例敏感株中，D试验阳性18株；凝固酶阴性葡萄球菌20例敏感株中，D试验阳性8株。红霉素异质性耐药现象中金黄色葡萄球菌有12株，占敏感株的30%。而凝固酶阴性葡萄球菌中仅1株溶血葡萄球菌中出现异质性耐药菌株。对于挑选出的异质性耐药经纯化鉴定后再行D试验，此18株无一例外的D试验均为阳性。
三 讨论
细菌耐药是长期的抗生素压力下，细菌的基因或染色体发生变异，从而导致细菌对药物的抗性增强。细菌异质性耐药表现在用不同的体外方法检测细菌耐药情况时出现结果的差异化，这部分耐药亚群的检出在一定程度上容易发生漏检，造成临床抗感染失败。因此，了解细菌异质性耐药的检出及其检测方法，对于异质性耐药细菌的监控具有重要的临床意义。红霉素异质性耐药可以用基因分型方法[4]或多重PCR[5]证实异质性耐药株，但对于一般基层实验室则难以开展。
检测我院一段时期的102株金黄色葡萄球菌和37株凝固酶阴性葡萄球菌发现，D试验阳性的菌株分别有18株和8株，出现红霉素异质性耐药的菌株有12株和1株。此外对于异质性耐药的13例菌株纯化后再次D试验，均为D实验阳性。根据体外纸片扩散法D试验的结果，提示我们需要人为修正红霉素和克林霉素的药敏，将敏感改为耐药。
使用自动化仪器或使用微量肉汤稀释法药敏试验不能完全用稀释法取代纸片扩散法进行药敏试验，这样会造成漏检的发生。其原因可能有异质性耐药菌株的数量有限，在进行药敏试验所需菌量的前提下，异质性耐药菌株的数量不足以达到耐药所需的阈值标准，因此显示为敏感的结果，在纯化培养后重新进行的药敏试验结果均显示为耐药[3]。
异质性耐药株在常规检测中多表现为敏感菌，耐药亚群不易筛出，因此容易导致临床医生使用药物出现误差，延误患者病情。对于细菌异质性耐药的检出和监控将是微生物工作者面临的一个新的课题和挑战。作为一般基层单位，我们推荐对于葡萄球菌药敏除外仪器法外常规使用纸片扩散法D实验来加以证实和筛选红霉素异质性耐药菌株。
参考文献：
[1]侯琦，马筱玲．细菌的异质性耐药．临床输血与检验，2003，5：238-240．
[2]周庭银．临床微生物学诊断与图解．3版，上海：上海科技出版社，2012，5：59-60．
[3]陈东科，赖惠英，杨冬梅等.红霉素异质性耐药金黄色葡萄球菌耐药机制及检测方法学的比较.中华医学杂志，2013，12（93）3867-3871.
[4]Prabu D，Menon T.Genotyping oferythromycin resistantgroup C & G streptococci isolated in Chennai，south India.Indian J Med Res.2013 Jan；137（1）：164-8.
[5]Zmantar T，Chaieb K，Ben Abdallah F，et.Multiplex PCRdetection of the antibiotic resistance genes in Staphylococcus aureus strains isolated from auricular infections.Folia Microbiol（Praha）.2008；53（4）：357-62.
论文作者:胡金伟,沈,晖,龙,辉
论文发表刊物:《健康世界》2015年12期
论文发表时间:2016/5/18
标签：葡萄球菌论文; 红霉素论文; 菌株论文; 异质论文; 霉素论文; 纸片论文; 细菌论文; 《健康世界》2015年12期论文;