焦云根, 刘乃丰[1]2004年在《吸烟升高大鼠血清糖基化终产物水平及其对血管内皮细胞ICAM-1表达的影响》文中提出目的:本研究旨在观察吸烟大鼠血清AGEs的升高水平及其对血管内皮细胞ICAM-1表达的影响,评价氨基胍、葛根素和戒烟在其中的作用,探讨吸烟对血管内皮细胞ICAM-1表达影响的可能作用机制,为临床寻求有效的干预措施提供实验依据。
焦云根[2]2004年在《吸烟升高大鼠血清糖基化终产物水平及对血管内皮细胞ICAM-1表达的影响》文中指出目的: 本研究旨在观察吸烟是否升高大鼠血清AGEs的水平,以及对血管内皮细胞ICAM-1表达的影响,评价氨基胍、葛根素和戒烟在其中的作用,探讨吸烟对血管内皮细胞ICAM-1表达影响的可能作用机制,为临床寻求有效的干预措施提供实验依据。方法: 清洁级雄性SD大鼠138只,体重220±10 g,按吸烟染毒时间不同随机分为2周组(n=30)、4周组(n=30)、6周组(n=30)、8周组(n=30)及戒烟组(n=18)共五大组。前四大组按干预条件的不同随机再分为正常对照组(CON亚组,n=6)、吸烟1小时组(SM1亚组,n=6)、吸烟半小时组(SM2亚组,n=6)、氨基胍干预组(AG亚组,n=6)和葛根素干预组(PU亚组,n=6);戒烟组按照戒烟时间的不同分为戒烟2周组(n=6)、戒烟4周组(n=6)及戒烟6周组(n=6)。除CON组外,其余各组大鼠均予每日上午在72L密闭箱内熏5%(V/V)飞马牌香烟 ,以被动吸烟染毒,半小时组每日连续熏0.5小时 ,其余组每日连续熏1小时。AG 组每日吸烟同时给予氨基胍干预,PU组每日吸烟同时给予葛根素干预。前四大组的大鼠分别于吸烟染毒满2,4,6,8周后处死;戒烟组于吸烟染毒满8周后分别戒烟2,4,6周后处死。用荧光法测定大鼠血清AGEs水平,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组织化学法检测大鼠主动脉组织中ICAM-1mRNA及蛋白的表达水平。结果: SD大鼠每天被动吸烟一小时,2周后血清AGEs水平上升(p<0.01),4周后达到高峰(p<0.001),6周、8周有下降趋势,但未降至正常。氨基胍、葛根素干预大鼠,血清AGEs水平升高趋势有所减低。戒烟后大鼠血清AGEs水平有下降趋势,戒烟4周后下降明显(p<0.001)。每天吸烟一小时组大鼠血清AGEs水平高于半小时组。随着吸烟时间的增加,大鼠主动脉内皮细胞ICAM-1mRNA及蛋白表达增加,氨基胍、葛根素干预组其表达减少;戒烟后其表达逐步减少,戒烟4周后明显(p<0.05)。结论: 吸烟能够升高大鼠血清AGEs水平,吸烟诱导产生的AGEs在吸烟促进大鼠主动脉内皮细胞ICAM-1表达中发挥作用,氨基胍、葛根素、戒烟均能降低吸烟大鼠血清AGEs水平,减少大鼠主动脉内皮细胞ICAM-1的表达。
焦云根[3]2016年在《血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）在晚期糖基化终产物（AGEs）促进动脉粥样硬化形成中的作用》文中研究指明第一部分 晚期糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞LOX-1表达的影响及其机制目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)和细胞间粘附分子(ICAM-1)表达的影响,以及马来酸罗格列酮和LOX-1反义寡核苷酸对上述效应的干预作用,从而揭示LOX-1在AGEs促进动脉粥样硬化形成中的作用和可能机制。方法以D-葡萄糖和牛血清白蛋白(BSA)在体外37℃条件下孵育制备AGEs。用胶原酶消化法分离HUVECs并加以培养、传代。分光光度法检测]HUVECs上清液SOD、MDA含量；不同浓度、不同时间的AGE-BSA干预HUVECs,以及不同浓度的马来酸罗格列酮、LOX-1反义寡核苷酸和AGE-BSA共同干预HUVECs,逆转录聚合酶链式反应方法检测LOX-1以及ICAM-1的mRNA表达；蛋白免疫印迹方法检测LOX-1以及ICAM-1的蛋白表达；用密度梯度加粘附法分离人外周血单核细胞(PBMCs),按Esposito's法进行HUVECs-PBMCs粘附试验,并根据Chen氏法计算HUVECs-PBMCs的粘附率。结果各组培养上清液MDA、SOD的值随培养时间的延长而升高,AGE-BSA促进HUVECs的MDA生成,降低其SOD的活性(P<0.05); HUVECs中的LOX-1的mRNA和蛋白表达量随着AGE-BSA的浓度和时间增加而增加(P<0.05)；马来酸罗格列酮、LOX-1反义寡核苷酸分别与AGE-BSA共同干预HUVECs呈浓度依赖性抑制LOX-1的mRNA表达和蛋白表达(P<0.05)；马来酸罗格列酮、LOX-1反义寡核苷酸分别与AGE-BSA共同干预HUVECs降低ICAM-1表达的同时也降低了HUVECs-PBMCs粘附率。结论AGE-BSA促进HUVECs活性氧生成,抗氧化酶活性下降,导致组织细胞氧化失衡；AGE-BSA以时间、浓度依赖方式增加HUVECs的LOX-1mRNA及蛋白表达水平,表明LOX-1在AGEs促进动脉粥样硬化形成中的发挥作用,其可能机制与氧化应激和促进细胞间粘附分子表达和HUVECs-PBMCs的粘附有关；马来酸罗格列酮能部分抑制AGE-BSA诱导的HUVEC sLOX-1和ICAM-1的表达提示其降血糖以外的抗动脉粥样硬化作用。第二部分晚期糖基化终产物对高脂饮食兔主动脉LOX-1表达的影响及药物的干预作用目的观察晚期糖基化终产物(AGE)对高脂饮食兔主动脉LOX-1表达的影响以及马来酸罗格列酮和瑞舒伐他汀的干预作用,探讨AGE促进动脉粥样硬化形成的途径以及药物抗动脉粥样硬化的作用机制。方法采用新西兰白兔42只,随机分为六组,每组7只：A组：喂饲普通饲料；B组：喂饲高脂饲料；C组：喂饲高脂饲料加静脉注射AGE修饰的兔血清白蛋白(AGE-RSA, 5mg/kg,1次／隔日)；D组：喂饲高脂饲料加静脉注射未加修饰的兔血清白蛋白(RSA,5mg/kg,1次／隔日)；E组：喂饲高脂饲料加静脉注射AGE修饰的兔血清白蛋白(AGE-RSA,5mg/kg,1次／隔日),同时给予马来酸罗格列酮0.5 mg/(kg-d);F组：喂饲高脂饲料加静脉注射AGE修饰的兔血清白蛋白(AGE-RSA,5 mg/kg,1次／隔日),同时给予瑞舒伐他汀1.5 mg/(kg-d),共干预10周。10周后取腹主动脉行油红O大体标本染色,HE染色观察光镜下血管形态和结构的变化,免疫组织化学染色法检测动脉血管中LOX-1表达情况,留取血清检测血脂及超敏C反应蛋白,West Blot法检测动脉血管组织NF-κB p65蛋白含量变化情况。结果1、油红O大体标本染色和HE染色结果显示：与A组比较,B组动脉粥样硬化斑块面积和厚度显着增加(P均<0.01)；与B组和D组比较,C组动脉粥样硬化斑块面积和厚度显着增加(P均<0.05)；与C组比较,E组和F组分别给予马来酸罗格列酮和瑞舒伐他汀治疗后斑块面积和厚度均下降(P<0.05)；而E组与F组之间无显着差异(P>0.05)。2、免疫组织化学染色显示：A组血管组织中未见明显LOX-1阳性细胞；B组和D组LOX-1阳性细胞增加(P均<0.01)；与B组和D组比较,C组血管组织中LOX-1阳性细胞计数明显增加(P均<0.01)；E组与F组分别给予马来酸罗格列酮和瑞舒伐他汀治疗后,与C组相比LOX-1阳性细胞明显降低(P均<0.05)；但E组与F组比较无显着差异。3、血清检测结果显示：与A比较,B组、C组和D组血清CHO、LDL-C明显增高(P<0.01),C与D组比较无显着差异(P>0.05)。与C比较,瑞舒伐他汀治疗后,F组血清CHO、LDL-C下降(P<0.05)；E组经马来酸罗格列酮治疗后,CHO、LDL-C水平未见变化(P>0.05)。与A组比较,B组、C组和D组TRG有增高趋势,但未达到统计学差异(P>0.05)。与C组比较,瑞舒伐他汀治疗后F组TRG有下降趋势,但未达到统计学差异(P>0.05)。血清hs-CRP测定结果显示：B组和D组比较,C组hs-CRP明显增高(P<0.01)；与C组比较,E组与F组分别给予马来酸罗格列酮和瑞舒伐他汀治疗后hs-CRP明显下降(P<0.01),E组与F组比较无显着差异(P>0.05)。4、血管组织细胞核内NF-κB p65蛋白含量的变化：与B组和D组比较,C组血管组织细胞核内NF-κB p65蛋白含量显着增高(P<0.01)；E组与F组分别给予马来酸罗格列酮和瑞舒伐他汀治疗后,血管组织细胞核内NF-κBp65蛋白含量显着降低(P<0.05),E组与F组比较无显着差异(P>0.05)。结论晚期糖基化终产物(AGEs)增加了高脂饮食兔主动脉粥样硬化斑块面积和动脉内膜厚度,促进了动脉粥样硬化的形成,也促进了主动脉LOX-1表达的增加,提示LOX-1可能在AGE促进动脉粥样硬化形成过程中发挥作用。其机制与增加血管炎症反应有关。马来酸罗格列酮和瑞舒伐他汀均能减轻主动脉粥样硬化斑块面积和动脉内膜厚度,减少血管组织细胞核内NF-κB和主动脉LOX-1的表达,降低血清hs-CRP水平,表明马来酸罗格列酮和瑞舒伐他汀可能通过抑制血管炎症反应,减少血管组织细胞核内NF-κB和主动脉LOX-1的表达,发挥抗动脉粥样硬化的作用。第叁部分sLOX-1及hs-CRP在急性冠脉综合征中的意义及药物的干预作用一、sLOX-1及hs-CRP在急性冠脉综合征患者中的检测意义目的观察不同类型冠心病患者血清水溶性血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(sLOX-1)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平的变化及其之间的关系,探讨临床预测急性冠脉综合征(ACS)的血清学指标。方法采用酶联免疫吸附法测定62例冠心病患者[ACS 34例、稳定型心绞痛(SAP)28例]、27例非冠心病患者血清sLOX-1、hs-CRP水平。结果ACS患者外周血清sLOX-1、hs-CRP水平均高于SAP(P<0.05)和非冠心病患者(P<0.01); SAP患者外周血清sLOX-1、hs-CRP水平高于非冠心病患者(P<0.05)。线性相关分析：ACS患者血清hs-CRP与sLOX-1的浓度呈正相关(r=0.927,P<0.001)。结论ACS患者外周血清sLOX-1、hs-CRP水平升高,二者可作为急性冠脉综合征患者动脉粥样硬化斑块不稳定的血清学指标。二、 PCI术前负荷量瑞舒伐他汀治疗对ACS患者sLOX-1、hs-CRP及心功能和近期预后的影响目的探讨PCI术前负荷剂量瑞舒伐他汀对非ST段抬高急性冠状动脉综合征(NSTEACS)患者血清sLOX-1、hs-CRP及心功能和近期预后的影响。方法将72例NSTEACS患者随机分为负荷治疗组(33例)和对照组(39例),负荷治疗组PCI术前12h顿服瑞舒伐他汀20 mg,PCI术前2h追加瑞舒伐他汀20 mg。所有患者于术前、术后24 h、术后30d抽取静脉血,检钡sLOX-1、hs-CRP、CK-MB、cTnI等。两组患者于术前及术后30d通过超声心动图观察左室射血分数(LVEF)的变化。随访30d观察主要不良心脏事件发生率。结果与术前比较,2组患者PCI术后24h血清hs-CRP、sLOX-1均明显升高(P<0.05),心肌损伤标准物CK-MB、cTnI亦明显升高(P<0.01)；但负荷治疗组hs-CRP、sLOX-1、 CK-MB、cTnI升高水平显着低于标准治疗组(P<0.05)；术后30d负荷治疗组血清hs-CRP、sLOX-1仍低于标准治疗组(P<0.05)。与术前比较,2组患者血清总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平在术后24h均未见明显变化(P>0.05),术后30d出现显着下降(P<0.05),但两组之间比较未见显着性差异。与术前比较,2组患者PCI术后24h及术后30d血清ALT及Scr水平均未见明显升高。与对照组比较,负荷治疗组在术后30d左室射血分数(LVEF)显着提高；负荷治疗组主要不良心脏事件总发生率较标准治疗组降低(6.06% vs23.08% P<0.05)。结论NSTEACS患者PCI术前负荷剂量瑞舒伐他汀能明显减少PCI术后sLOX-1水平,减轻患者的心肌损伤及炎性反应,降低PCI术后近期不良心脏事件的发生,其独立于他汀类药物调脂作用以外,并且使用是安全的。
王滨[4]2005年在《金芪降糖片防治糖尿病血管并发症的临床和实验研究》文中研究指明目的:探讨糖尿病大鼠主动脉内皮细胞核因子-κB(NF-κB)的表达、炎症因子的变化及金芪降糖片的作用机制,观察金芪降糖片对糖尿病合并大血管并发症患者的血管内皮细胞的保护作用。 方法:采用链脲佐菌素制备20只糖尿病大鼠模型,造模成功后随机分为2组:A组,10只,糖尿病组;B组,10只,糖尿病治疗组;另设C组,正常对照组大鼠10只。治疗组大鼠每日金芪降糖片灌胃给药,10周后处死大鼠,观察实验大鼠主动脉内皮细胞超微结构、主动脉内皮细胞NF-κB表达、血糖、血脂及血清内皮素-1(ET-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)水平。40例2型糖尿病合并大血管并发症患者随机分为两组:A组,20例,西药常规治疗(简称对照组);B组,20例,西药常规治疗基础上加金芪降糖片治疗(简称金芪组)。治疗周期3个月。主要观察治疗前后患者的空腹血糖(FBG)、餐后2小时血糖(2hPG)、血脂、糖化血红蛋白(HbA_1c)、ET-1、ICAM-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、P-选择素水平等。 结果:实验大鼠10周后B组电镜下可见内皮细胞结构排列较整齐,细胞核和细胞器结构正常,弹力纤维和胶原纤维排列整齐,接近C组正常的内皮细胞结构,而A组大鼠主动脉内皮细胞排列紊乱,内皮细胞肿胀、脱落,结构不清,内皮下结构疏松,基底膜不连续,弹力纤维和胶原纤维杂乱分布,可见糖基化终末产物沉积及炎症细胞浸润,B组糖尿病大鼠主动脉内皮细胞NF-κB表达明显降低,接近C组内皮细胞表达,A组表达明显增加。B组血糖明显下降,治疗前后及与A组比较有显着性差异,P<0.01;血脂中甘油叁酯(TG)明显下降、高密度脂蛋白(HDL-C)明显升高,与A组有显着性差异,P<0.01,总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)没有明显变化,P>0.05,血清ET-1、ICAM-1水平低于A组,有显着性差异,P<0.01。两组治疗后FBG、2hPG、HbA_1C均有明显下降,P<0.05,组间比较HbA_1C有显着性差异,P<0.05,B组治疗后TG、LDL-C明显下降,HDL-C明显上升,与A组比较有显着性差异,P<0.05,B组治疗后ET-1、ICAM-1、TNF-α、P-选择素水平明显下降,与A组比较有显着性差异,P<0.01。 结论:金芪降糖片具有显着的降糖作用,改善糖尿病的脂代谢紊乱,有效地减轻血管内皮细胞的损伤和ET-1分泌,其作用机制可能是通过抑制主动脉内皮细胞
魏海峰[5]2010年在《单宁酸对实验性糖尿病大鼠肾脏病变的改善作用及其机制的研究》文中认为糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)常见和严重的微血管并发症,其发病机制尚未完全阐明,也缺乏有效的治疗方法。目前,氧化应激、亚硝基化应激及微炎症与DN的关系已成为DN研究领域一个新的课题。单宁酸具有多方面药理活性,具有显着的抑菌抗病毒、抗肿瘤、调节糖脂代谢、抗炎抗氧化等作用。目前有关单宁酸对DN的防治作用很少有人研究。本研究从氧化应激、亚硝基化应激机制及微炎症机制等角度,应用动物实验观察单宁酸对DM大鼠肾脏功能、结构的保护作用并探讨其作用机制;在体外实验观察单宁酸对蛋白质非酶糖基化、高糖及AGEs作用下的肾小球系膜细胞增殖、Ⅳ型胶原生成、氧化应激、亚硝基化应激及微炎症的影响,旨在探讨单宁酸防治DN的作用及其机制。本研究结果表明,DM大鼠体内抗氧化酶活性减低,肾组织8-OHdG及3-NT含量增加,炎症因子表达水平增高。单宁酸可改善DM大鼠的一般状态,降低DM大鼠血糖、血肌酐、尿素氮、尿酸水平及尿蛋白排泄率,改善DM大鼠肾脏肥大和肾脏病变;单宁酸可降低血清及肾组织MDA含量、降低肾组织8-OHdG水平,提高血清及肾组织抗氧化酶GSH-Px、SOD和CAT活性;单宁酸可降低DM大鼠肾组织ICAM-1、MCP-1、TNF-α、PAI-1和CRP蛋白表达,下调肾组织ICAM-1、MCP-1及IL-8 mRNA表达,并能降低DM大鼠血清CRP水平;单宁酸能抑制高糖及AGEs刺激引起的肾小球系膜细胞增殖及Ⅳ型胶原生成;有效提升高糖及AGEs作用下肾小球系膜细胞培养上清中GSH-Px、SOD及CAT活性,降低MDA、8-OHdG含量;单宁酸可下调高糖及AGEs作用下肾小球系膜细胞ICAM-1蛋白表达,下调高糖诱导肾小球系膜细胞MCP-1及IL-8 mRNA表达;单宁酸还可降低DM大鼠肾组织及肾小球系膜细胞培养上清中3-NT含量,并具有抑制体外蛋白质非酶糖基化的作用。本研究首次从整体动物及细胞水平深入探究单宁酸防治DN的作用及其机制,证明单宁酸具有明显的抗炎、抗氧化、抗亚硝基化及抑制蛋白质非酶糖基化的作用。单宁酸改善DM大鼠肾脏功能和结构损害的作用可能与其通过降低肾脏氧化应激、亚硝基化应激及微炎症反应等机制有关。本研究为单宁酸防治DN提供了实验依据。
刘粉叶[6]2008年在《益肾活血胶囊对高同型半胱氨酸血症所致兔动脉粥样硬化相关炎症因子表达调节的研究》文中认为背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一个多因素导致的严重威胁人类健康和生命的心血管疾病,近年来,国内外大量研究表明,高同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)血症是AS和血栓栓塞性疾病的一个新的独立危险因素。降低血浆Hcy水平及逆转由此而产生的病理变化成为近年来AS防治的热点。AS是一多因素、多基因引起的复杂的慢性炎症性疾病,涉及损伤的内皮细胞与单核巨噬细胞、平滑肌细胞之间的相互作用,以及局部产生的大量细胞因子、生长因子的网络调控,其中黏附分子、趋化因子、生长因子等在AS发生发展过程中具有重要作用。近年研究表明,高Hcy血症导致AS发生的机制与其诱发血管壁炎症反应有关,Hcy可诱导核因子-kappa B(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化,上调血管内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞等表达细胞间黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocytechemoattractant protein-1,MCP-1)、转化生长因子-β_1(Transformation growthfactor-β_1,TGF-β_1)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)等,从而促进单核细胞与血管内皮的黏附,平滑肌细胞的增殖及胶原合成,参与AS的发生和发展。益肾活血胶囊(Yishenhuoxue Capsule,YC)是临床治疗高Hcy血症的中药复方制剂。本研究以高蛋氨酸饮食诱导兔高Hcy血症并制备AS动物模型,以降低血浆Hcy水平的常用药物叶酸、VitB_6、VitB_(12)联合治疗作为阳性对照,通过对高Hcy血症所致AS兔腹主动脉内膜、中膜病理改变及超微结构的观察,以及应用荧光实时定量PCR和免疫组化技术检测ICAM-1、MCP-1、TGF-β_1和MMP-9 mRNA及蛋白表达的改变,并用Western blot和免疫组化检测NF-κB抑制因子-a(Inhibitorof NF-κB-a,IκB-a)蛋白表达及NF-κB核移位的变化,探讨益肾活血胶囊对Hcy所致血管壁炎症的抑制作用,为其临床防治高Hcy血症及AS提供科学依据。目的观察益肾活血胶囊对高Hcy血症所致AS兔血浆Hcy水平、腹主动脉壁形态学及超微结构的改变、血管壁炎症因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β_1和MMP-9基因和蛋白表达的变化、以及对NF-κB活化的影响,探讨益肾活血胶囊对高Hcy血症及其所致AS的防治作用及机理。方法1.试验动物:2～3月龄、体重2.0～2.5 kg雄性纯种新西兰兔。2.建立模型:以充盈球囊损伤腹主动脉内膜后,2%高蛋氨酸饲料喂养动物5个月,建立高Hcy血症及AS动物模型。3.动物分组:将56只新西兰兔随机分为正常组、模型组、益肾活血胶囊预防组(预防组)、益肾活血胶囊小剂量组(小剂量组)、益肾活血胶囊中剂量组(中剂量组)、益肾活血胶囊大剂量组(大剂量组)、西药(叶酸、VitB_(12)、VitB_6)对照组,共7组。4.观察指标:(1)高效液相色谱技术检测各实验组兔血浆Hcy浓度;(2)腹主动脉壁病理学观察;(3)腹主动脉壁形态学指标检测:平均内膜厚度(Intimalthickness,IT)、中膜厚度(Medial thickness,MT)、内膜面积(Intimal area,IA)、内膜面积与中膜面积比(Intimal area/medial area,IA/MA);(4)透射电镜观察腹主动脉壁中膜平滑肌细胞超微结构;(5)实时定量RT-PCR法检测腹主动脉ICAM-1、MCP-1、TGF-β_1和MMP-9的mRNA表达;(6)免疫组化法观察ICAM-1、MCP-1、TGF-β_1、MMP-9的蛋白表达;(7)NF-κB活化情况检测:Westernblot检测IκB-a蛋白表达及免疫组化法检测NF-κB核表达情况。结果1.各实验组兔血浆Hcy浓度变化与正常对照组相比,模型组兔血浆Hcy浓度明显升高;各药物处理组兔血浆Hcy浓度较模型组均有不同程度下降,其中预防组下降最为显着(P＜0.01),其次为大剂量组(P＜0.01);预防组和大剂量组与西药对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);小剂量组和中剂量组与西药对照组相比差异无显着性(P均＞0.05)。2.腹主动脉壁切片光镜下HE染色观察正常对照组兔腹主动脉血管壁内膜、中膜、外膜叁层结构明显,内膜完整、无增厚,内皮下无脂质沉积,中膜VSMCs细长呈梭形,细胞核蓝染,同心圆状排列整齐;模型组兔腹主动脉壁内膜明显增厚,内皮下可见泡沫细胞聚集,中膜VSMCs排列紊乱,单位面积细胞核数量增多;预防组及各药物治疗组兔腹主动脉内膜增厚与模型组相比均有所减轻,中膜VSMCs排列欠规则,单位面积细胞核数目略增多。3.腹主动脉形态学指标比较3.1内膜厚度(IT)比较:与正常对照组相比,模型组兔腹主动脉IT明显增加(P＜0.01);与模型组相比,各药物处理组腹主动脉IT均有不同程度下降,其中预防组和大剂量组下降尤为明显(P均＜0.01),但是西药对照组和小剂量组IT与模型组相比,差异无显着性(P均＞0.05);预防组和大剂量组IT与西药对照组相比,差异具有统计学意义(P均＜0.05)。3.2中膜厚度(MT)比较:与正常对照组相比,模型组及各药物组兔腹主动脉MT虽有不同程度增加,但差异无显着性(P均＞0.05)。3.3内膜面积(IA)比较:与正常对照组相比,模型组兔腹主动脉IA明显增加(P＜0.01);与模型组相比,各药物处理组IA均有所下降,其中预防组和大剂量组下降尤为明显(P均＜0.01),然而西药对照组IA与模型组相比,差异无显着性(P＞0.05);预防组IA与西药对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)。3.4内膜与中膜面积比(IA/MA):与正常对照组相比,模型组兔腹主动脉IA/MA显着增加(P＜0.01);与模型组相比,各药物处理组兔腹主动脉IA/MA均明显下降(P均＜0.05);预防组、大剂量组与西药对照组相比差异具有显着性(P均＜0.05)。4.腹主动脉壁中膜平滑肌细胞超微结构改变正常组兔血管中膜平滑肌细胞呈纺锤形,密斑密体排列规则,肌丝含量丰富,线粒体、内质网无肿胀,呈典型的收缩型细胞特征;模型组可见血管平滑肌细胞向内膜迁移,核固缩,肌丝减少,线粒体明显肿胀,呈空泡状,粗面内质网、核糖体和高尔基体等细胞器增多,呈明显的合成型细胞特征;益肾活血胶囊不同处理组,中膜平滑肌细胞形态均有不同程度的改善,与模型组相比,线粒体肿胀减轻,密斑密体可见,肌丝含量增加,恢复收缩型细胞特征;西药对照组平滑肌细胞形态改善不明显。5.腹主动脉壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β_1、MMP-9 mRNA表达水平比较(1)ICAM-1 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁ICAM-1mRNA表达显着升高(P＜0.01);各药物处理组ICAM-1 mRNA表达较模型组均有不同程度下降,其中预防组下降最为显着(P＜0.01),其次为大剂量组(P＜0.01),小剂量组ICAM-1 mRNA表达与模型组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);预防组和大剂量组与西药对照组相比差异具有显着性(P均＜0.05)。(2)MCP-1 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁MCP-1mRNA表达显着升高(P＜0.01);与模型组相比,各药物处理组MCP-1 mRNA表达均显着下降(P均＜0.05);预防组、中剂量组和大剂量组与西药对照组比较,差异有统计学意义(P均＜0.05)。(3)TGF-β_1 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁TGF-β_1mRNA表达显着升高(P＜0.01);与模型组相比,各药物处理组TGF-β_1 mRNA表达均明显下降(P均＜0.05);预防组与西药对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。(4)MMP-9 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁MMP-9mRNA表达明显升高(P＜0.01);与模型组相比,各药物处理组MMP-9 mRNA表达均显着下降(P均＜0.01);预防组和大剂量组与西药对照组比较,差异具有统计学意义(P均＜0.05)。6.腹主动脉壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β_1、MMP-9蛋白表达水平比较(1)ICAM-1蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁ICAM-1蛋白表达显着升高(P＜0.01);小剂量组和西药对照组兔ICAM-1蛋白表达与模型组相比,差异无显着性(P＞0.05),预防组、中剂量组和大剂量组则较模型组明显下降(P均＜0.05);预防组和大剂量组兔ICAM-1蛋白表达明显低于西药对照组,也显着低于小剂量组(P均＜0.01)。(2)MCP-1蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁MCP-1蛋白表达显着升高(P＜0.01);与模型组相比,各药物处理组MCP-1蛋白表达均明显下降(P均＜0.01);预防组和大剂量组与西药对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。(3)TGF-β_1蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁TGF-β_1蛋白表达显着升高(P＜0.01);小剂量组、中剂量组和西药对照组兔TGF-β_1蛋白表达与模型组相比,差异无统计学意义(P均＞0.05),预防组和大剂量组TGF-β_1蛋白表达较模型组明显下降(P均＜0.01),且分别显着低于西药对照组、小剂量组和中剂量组(P均＜0.05)。(4)MMP-9蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁MMP-9蛋白表达显着升高(P＜0.01);与模型组相比,各药物处理组MMP-9蛋白表达均有所下降(P均＜0.05),其中以大剂量组下降最为显着(P＜0.01),其次为预防组(P＜0.01):大剂量组和西药对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。7.腹主动脉NF-κB活化情况比较Western blot分析显示,模型组兔血管壁IκB-a蛋白表达较正常对照组明显减少(P＜0.01),提示高Hcy血症促进IκB-a蛋白的降解;与模型组相比,各药物处理组IκB-a蛋白表达均有不同程度的升高,其中以大剂量组回升最为显着(P＜0.01),小剂量组IκB-a蛋白表达与模型组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);大剂量组IκB-a蛋白表达与西药对照组比较,差异有显着性(P＜0.01)。免疫组化显示,模型组兔血管壁NF-κB p65核表达比例较正常对照组明显增多(P＜0.01),提示高Hcy血症促进NF-κB的核移位;与模型组相比,各药物处理组NF-κB p65核表达比例均有不同程度的下降,其中以预防组下降最为显着(P＜0.01),其次为大剂量组(P＜0.01);预防组NF-κB p65核表达比例与西药对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论1.益肾活血胶囊能够降低实验兔血浆Hcy水平。2.益肾活血胶囊具有明显的抗炎作用,可降低腹主动脉壁炎症因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β_1、MMP-9 mRNA和蛋白表达,其机制与降低血浆Hcy浓度及抑制核因子NF-κB活化有关。3.益肾活血胶囊能够抑制腹主动脉粥样硬化形成,表现为减轻血管内膜增厚,抑制中膜平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转化,其机制与下调炎症因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β_1、MMP-9表达及抑制NF-κB活化有关。
杨瑞雪[7]2006年在《益肾活血胶囊治疗冠心病高同型半胱氨酸血症的研究》文中认为目的 探讨益肾活血胶囊对高同型半胱氨酸血症及其动脉粥样硬化的治疗作用与治疗机理，为临床防治高同型半胱氨酸血症及其动脉粥样硬化药物治疗的开发提供依据。 方法 1．动物试验： 1．1 试验动物：Wistar大鼠。 1．2 建立模型：以高蛋氨酸饲料(含蛋氨酸5％)喂养动物3个月，建立高同型半胱氨酸血症大鼠模型 1．3 动物分组：将80只Wistar大鼠分为模型组、正常组、大剂量益肾活血胶囊组、小剂量益肾活血胶囊组、西药(叶酸、VitB_(12)、VitB_6)组、大黄(?)虫丸组、预防组、空白组共8组。 1．4 观察指标：观察各组大鼠血液同型半胱氨酸(Hcy)、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的变化，免疫组化法观察α-肌动蛋白(α-actin)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的蛋白表达，光镜、电镜观察主动脉壁形态学变化，采用原位杂交技术检测实验动物主动脉bFGF、TGF-β1、TNF-α、ICAM-1的mRNA表达。 2．临床试验： 2．1 病例选择： 2．1．1 符合中医肾虚血瘀证胸痹辨证标准的患者；符合西医冠心病心绞痛轻、中、较重度诊断标准的患者。
王克伟[8]2007年在《两种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物的生物学作用机制研究》文中研究指明研究表明,氧化应激在动脉粥样硬化病和帕金森病的发生、发展过程中起着重要的作用.应用抗氧化治疗能延缓疾病的发生、发展。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是抗氧化酶系的重要成员之一,我们实验室以环糊精(CD)为主体构建了两种GPX模拟物:2-位硒桥联环糊精(2-SeCD)和2-位碲桥联环糊精(2–TeCD)。本文研究了上述两种GPX模拟物对体外帕金森病的氧化应激细胞模型和动脉粥样硬化病的炎症模型的影响及其机制。1. 大鼠嗜铬细胞瘤 (PC12)细胞是常用的多巴胺能神经元细胞模型。我们用多巴胺损伤PC12细胞,构建了帕金森病的氧化应激模型,观察2-位硒桥联环糊精(2-SeCD)对由多巴胺氧化应激诱导的PC12细胞凋亡的影响及其机制。 结果表明:2-SeCD对由多巴胺氧化损伤诱导的PC12细胞凋亡有明显的抑制作用,明显降低细胞内活性氧含量,明显降低细胞脂质过氧化主产物丙二醛(MDA)含量,提高细胞内谷胱甘肽(GSH)含量,降低细胞内Bax的表达,提高细胞内Bcl-2的表达,提高bcl-2/ bax的比值。 结论:2-SeCD能抑制多巴胺诱导的PC12细胞的凋亡,其作用机制为2-SeCD对抗氧化应激,调节凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。2.人脐静脉内皮细胞是常用的动脉内皮细胞模型。我们以炎症因子肿瘤坏死因子-a (TNF-a)刺激人脐静脉内皮细胞作为动脉粥样硬化病的体外细胞模型,观察2-位碲桥联环糊精(2–TeCD)对TNF-a刺激的人脐静脉内皮细胞表面粘附分子VCAM-1和ICAM–1表达的影响及其机制。实验结果表明:2–TeCD明显降低TNF-a刺激的人脐静脉内皮细胞表面粘附分子 VCAM-1和ICAM–1的表达,明显抑制单核细胞THP-1与内皮细胞的粘附,明显降低细胞表面粘附分子 VCAM-1和ICAM–1的mRNA水平,明显抑制细胞内转录因子NF-?B的p65亚基核转位水平。 结论:2–TeCD能抑制TNF-a刺激的人脐静脉内皮细胞表面粘附分子VCAM-1和ICAM–1的表达,其作用机制与其抑制细胞内转录因子NF-?B的转位和活化有关。
秦伟栋[9]2013年在《聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在低剪切力诱导的动脉粥样硬化中的作用及机制研究》文中提出研究背景及目的动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病,最先发生于血流动力学紊乱的血管分叉或狭窄的部位。局部血流变化与这种部位特异性密切相关,其中一个重要的因素是剪切力(WSS)。剪切力是血液在血管中流动时对血管内膜产生的一种摩擦力。剪切力的大小与血液流速成正比,比管腔半径成反比。生理剪切力的大小介于0.5-1.2Pa,小于0.5Pa或者大于1.2Pa分别称为低剪切力和高剪切力。剪切力作用于内皮细胞能引起胞内各种信号转导分子的激活,如蛋白激酶C(PKC)、丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等。此外,低剪切力能够促进促动脉硬化物质在管腔和管壁之间的转运,因此能促进动脉粥样硬化的发生。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是一种高度保守的DNA结合蛋白。作为一种核酶,PARP-1参与了DNA损伤后的修复。一旦与损伤的DNA结合,PARP-1会被激活并催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解为尼克酰胺和ADP核糖,从而在DNA修复、基因转录、细胞周期、细胞死亡、染色体功能和遗传稳定性中发挥重要的作用。然而,PARP-1过度活化会引起细胞内NAD+和ATP的耗竭,导致细胞能量危机、细胞毒性和细胞死亡。研究证实氧化应激引起的PARP-1过度活化与各种疾病的发生密切相关,如内皮功能障碍、休克、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等。此外,作为核因子κB (NF-κB)的激活物,ⅠPARP-1能够调节各种关键炎症因子的表达,如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等。在以往研究的基础上,我们提出如下假设：1)低剪切力能引起氧化应激并导致DNA损伤,从而激活PARP-1;2) PARP-1在低剪切力引起的炎症反应中发挥了重要作用。本研究正是基于以上思路,拟应用低剪切力刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以验证这一假说。旨在探讨PARP-1在低剪切力引起的脐静脉内皮细胞炎症反应中的作用和可能的机制,以期寻找到与低剪切力相关的炎症性疾病的预防和治疗靶点。材料与方法1.细胞培养及剪切力模型建立：本实验采用内皮细胞培养基(ECM)培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象；低剪切力(0.4Pa)刺激以诱导脐静脉内皮细胞发生炎症反应,静态状态下培养的脐静脉内皮细胞作为实验对照。2.细胞内基因蛋白表达的干预：采用PARP-1抑制剂ABT888或瞬时转染PARP-1小干扰RNA片段的方式实现对脐静脉细胞内PARP-1表达的干预；采用SP600125,SB203580和U0126抑制剂来抑制,NK、 P38和ERK的活性。3.实时定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR):收集各组细胞,提取RNA,进行逆转录和实时定量PCR,检测各组细胞中iNOS和ICAM-1mRNA的表达水平。4.蛋白印迹(Western blotting):收集各组细胞,提取蛋白,分别检测ICAM-1、iNOS、PARP-1、PAR、 nitrotyrosine、H2A-X、p-H2A-X、c-Jun、p-c-Jun、MAPKAPK-2、 p-MAPKAPK-2、ERK、p-ERK、Sirt1、IκBα口p-p65等蛋白的表达水平。5.细胞免疫荧光：显示细胞超氧阴离子的生成,细胞内的NF-κB P65亚基的表达及转位情况。6.分光光度法：收集各组细胞,使用相应试剂盒以检测细胞内NAD+勺水平和Sirtl的活性。7.彗星实验(comet assay):收集各组细胞,检测细胞DNA损伤程度。8.电泳迁移率检测(EMSA):收集各组细胞,提取各组细胞核蛋白,检测细胞内核转录因子NF-KB的活性。研究结果1.低剪切力诱导脐静脉内皮细胞内iNOS和ICAM-1mRNA和蛋白的表达具有时间依赖性：应用低剪切力(0.4Pa)刺激HUVECs Oh、4h、8h、12h、16h、24h和36h,RT-PCR和蛋白印记结果显示,与正常对照组相比,LSS能够诱导HUVECs细胞内iNOS和ICAM-1的表达。在LSS刺激4h后,iNOS mRNA和蛋白表达开始升高；在LSS刺激12h后,iNOS mRNA和蛋白达到峰值,此时ICAM-1mRNA和蛋白的表达也明显升高。2.LSS刺激增加了脐静脉内皮细胞中PARP-1的蛋白表达和活性：与正常对照组相比,LSS能够显着增加细胞中PARP-1蛋白的表达量,而PARP-1的siRNA可以下调PARP-1的表达；此外,LSS刺激能增加PARP-1的活性,即上调PAR的生成,加入PARP-1抑制齐ABT888或siRNA后,PAR的生成明显减少。3.LSS刺激增加了细胞中超氧阴离子(02-)和3-NT的合成：为了显示细胞内的氧化应激水平,我们检测了细胞内超氧阴离子和硝基酪氨酸的合成。DHE染色和蛋白印记结果显示,与正常对照组相比,LSS刺激下的HUVECs细胞,O2-的合成和3-NT的表达明显增加。4.LSS刺激引起细胞DNA损伤：彗星实验结果显示,低剪切力刺激能显着增加尾部DNA的含量,而静态条件下尾部几乎没有DNA;此外,LSS还能增加细胞中P-H2A-X的表达,说明了LSS刺激能诱导细胞DNA损伤。5.LSS能够通过MEK/ERK通路激活PARP-1:与正常对照组相比,LSS能够活化JNK、p38和ERK通路,增加其磷酸化蛋白的表达。应用SP600125、SB203580、U0126抑制剂能够抑制JNK、p38、ERK的磷酸化,但是只有MEK/ERK抑制剂U0126能够减少PAR的生成。6.抑制PARP-1能够减少炎症因子iNOS和ICAM-1的表达：蛋白印迹结果显示,与正常对照组相比,LSS刺激能够显着增加iNOS和ICAM-1的蛋白表达量；应用ABT888或siRNA抑制PARP-1后,炎症因子的表达明显减少。7.抑制PARP-1通过上调胞内NAD+的水平而上调Sirtl的活性：与正常对照组相比,LSS刺激能够显着减少细胞内NAD+的水平和Sirt1的活性；抑制PARP-1后,细胞内NAD+水平明显升高,伴随Sirt1活性的增加,而其蛋白表达量没有明显变化。8.抑制PARP-1通过抑制NF-KB的核转位和活性而减少炎症因子的表达：免疫荧光结果显示,静息状态下,NF-KB的亚单位p65主要存在于胞浆中,而LSS刺激能够诱导p65亚基的核转位；抑制PARP-1后,LSS诱导的p65亚基核转位受到明显抑制。EMSA结果显示,LSS刺激能够增加NF-KB的转录活性,而抑制PARP-1能够显着降低NF-κB的活性。此外,蛋白印迹结果显示,LSS能减少IkBα的表达,增加p65亚基的磷酸化；而抑制PARP-1能够减少p65亚基的磷酸化,对IkBα勺表达无显著作用。结论及意义1.低剪切力能够诱导人脐静脉内皮细胞的炎症反应；2.低剪切力能够引起细胞内氧化应激和DNA损伤；3.低剪切力可以通过MEK/ERK途径激活PARP-1;4.抑制PARP-1能够减轻LSS诱导的脐静脉内皮细胞炎症反应,这一作用主要通过以下两个机制实现：(1)上调胞内NAD+水平而增加Sirt1的活性；(2)抑制NF-κB的核转位和活性,以及p65亚基的磷酸化。5.在本实验研究中,我们对PARP-1在低剪切力诱导的人脐静脉内皮细胞炎症中的作用及其机制做了系统的阐述,相关结果提示聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1或许是治疗动脉粥样硬化疾病的靶基因。研究背景及目的在西方发达国家,动脉粥样硬化性疾病依然是患病率和死亡率的首要原因。随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的改变,动脉粥样硬化(AS)也成为我国人民的主要死亡原因。动脉粥样硬化的发病是多因素的,深入的了解动脉粥样硬化对其早期预防和治疗具有重要的意义。动脉粥样硬化通常被认为是一种系统性疾病,其发病机制与许多经典的危险因素密切相关,如高血压,高血脂,糖尿病和吸烟等。动脉粥样硬化斑块好发于血管弯曲、分叉和分支部位,提示血流动力和血管形态在斑块形成中发挥了重要的作用。许多体内体外实验已经研究了血管中血流的状态并寻找斑块好发部位与血流动力学之间的可能联系。随着研究的不断深入,剪切力在动脉粥样硬化发病中的作用日益受到重视。在平直血管中,血液在各处血管的流速是不一致的。在血管轴心处血液流速最快,越靠近血管壁流速越慢。流动的血液会与血管发生摩擦,这种摩擦会产生一种平行作用于血管内膜的力,称为剪切力(WSS)。剪切力是一种十分重要的血流动力,它能够引起血管活性物质的释放,改变基因的表达、细胞代谢和细胞形态等。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(ⅠPARP-1)是PARP家族中含量最多的一种高度保守的核蛋白。氧化应激引起的DNA损伤能够激活PARP-1。在细胞核中,活化的PARP-1催化裂解NAD+为ADP核糖并将其转移到靶蛋白上。在正常情况下,PARP-1参与了DNA损伤的修复；但是在病理条件下,PARP-1的过度活化会引起细胞内NAD+和ATP的耗竭,导致细胞能量危机和功能障碍甚至死亡。大量研究证实PARP-1的过度激活与各种疾病的发生密切相关,如休克、心衰、缺血再灌注损伤和糖尿病等。在以往研究的基础上,我们提出如下假设：1)在动脉粥样硬化形成的早期,抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够延缓低剪切力诱导的动脉粥样硬化斑块形成；2)抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1减少低剪切力诱导的动脉粥样硬化斑块形成是通过抑制内皮细胞炎症反应来实现的。本研究正是基于以上思路,在小鼠体内设计实验以验证这一假说。旨在探讨PARP-1在动脉粥样硬化斑块形成中的作用,以期为抑制斑块形成、预防心血管急性事件的发生防治寻找新的契机和治疗靶点。研究方法1.实验动物：先将ApoE和PARP-1敲基因小鼠合笼繁殖得到ApoE+/-PARP-1+/-小鼠,然后将ApoE+/-PARP-1+/-杂合子合笼繁殖,应用PCR鉴定其子代基因型,最后得到ApoE+/-PARP-1+/-双基因敲除小鼠。2.动物模型的建立：8周龄雄性ApoE和ApoE/PARP-1敲基因小鼠,采用高脂喂养+右侧颈动脉套管的方法,构建动脉粥样硬化模型；实验动物共分为叁组：对照组,ApoE敲基因小鼠胃饲生理盐水；抑制剂组,ApoE敲基因小鼠胃饲PARP-1抑制剂ABT888;敲基因组,ApoE/PARP-1敲基因小鼠。3.聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的干预：采用基因敲除和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1抑制剂ABT888降低PARP-1基因表达。4.心率和血压：实验结束后,应用无创方法检测各组小鼠的心率和血压。5.血脂参数：实验结束后,收集小鼠血清,检测总胆固醇(TC)、甘油叁脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。6.H&E和油红O染色：收集左侧颈动脉和右侧颈动脉近心端,制备小鼠颈动脉切片,进行H&E和油红O染色,分别显示斑块的大体结构和斑块内脂质含量。7.免疫荧光检测：制备小鼠颈动脉近心端切片,进行免疫荧光染色,检测斑块组织内炎性因子ICAM-1的表达情况。8.蛋白印迹：收集颈动脉近心端,提取蛋白,用于检测组织内聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的蛋白及其活性、炎性因子ICAM-1的表达量。9.DHE染色：收集小鼠颈动脉,制备颈动脉切片,用于检测斑块内超氧化物阴离子的生成量。研究结果1.各组小鼠的一般情况：实验结束后,检测各组小鼠心率、血压和血脂水平,结果显示各组小鼠心率血压、血清TC.TG.LDL-C和HDL-C的浓度水平无显着统计学差异。这些结果提示PARP-1基因干预抑制动脉粥样硬化斑块形成与血脂之间没有直接关系。2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减少低剪切力诱导的颈动脉斑块形成：实验结束后,我们应用H&E和油红O染色检测各组小鼠颈动脉斑块及脂质的形成情况。与正常对照组的生理剪切力(左侧颈动脉)相比,低剪切力(右侧近心端)明显促进了动脉粥样硬化斑块和脂质的生成(p＜0.05,VS生理剪切力)。与对照组低剪切力相比,(?)PARP一1抑制或敲除明显抑制了实验组套管侧近心端斑块的形成和脂质的含量(p<0.05,VS.对照组低剪切力)。3.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够抑制低剪切力诱导的炎症反应：实验结束后,我们检测小鼠颈动脉炎症因子ICAM-1的表达情况。免疫荧光结果显示,与生理剪切力(对照组左侧颈动脉)相比,低剪切力(对照组套管近心端)能够明显促进ICAM-1的表达(p＜0.05,VS生理剪切力)；而在各实验组中,(?)PARP-1抑制或敲除能够明显抑制低剪切力诱导的ICAM-1表达(p<0.05,VS.对照组低剪切力)。蛋白印迹显示了类似的结果,且基因敲除引起的效果较抑制剂明显。这些结果说明抑制PARP-1减少低剪切力诱导的斑块形成是通过抑制内皮细胞炎症反应来实现的。4.低剪切力能够增加聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表达和活性：实验结束后,我们检测了小鼠颈动脉中PARP-1和PAR的表达情况。蛋白印迹结果显示,与生理剪切力(对照组左侧颈动脉)相比较,低剪切力(对照组套管近心端)能够明显增加ⅠPARP-1和PAR的表达量(p<0.05,VS.对照组生理剪切力)。在实验组套管侧近心端,抑制剂组小鼠PARP-1的表达无明显变化,而PAR的表达明显下降；双基因敲除组小鼠体内没有PARP-1和PAR的表达(p<0.05,VS.对照组低剪切力)。5.低剪切力能够增加氧化应激反应：实验结束后,我们应用DHE染色显示组织中超氧阴离子的形成状况。DHE染色结果显示,与生理剪切力(对照组左侧)相比,低剪切力(对照组套管近心端)能够明显增加组织超氧阴离子的生成,且PARP-1基因敲除或抑制对此没有明显影响。结论及意义1.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减轻低剪切力诱导的动脉粥样硬化斑块形成；2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减轻低剪切力诱导的内皮炎症反应；3.低剪切力能够增加聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表达和活性；4.低剪切力能够增加氧化应激；5.该研究为进一步阐明PARP-1在AS斑块形成中的作用和机理,从而为相关的心血管急性事件的防治提供新的思路及有效的治疗靶点。研究背景及目的糖尿病(DM)是一种代谢综合征,以机体相对或绝对胰岛素不足或胰岛素抵抗而出现高血糖为特征。据统计目前全球约有1亿8千万糖尿病患者,预计到2025年这一数字将增加到3亿。随着人民生活水平的改善和饮食结构的变化,我国糖尿病的患病率也达到了相当高的水平,大约是9.7%。由冠状动脉病变和高血压引起的心血管疾病(CAD)是糖尿病患者死亡的首要病因。然而,科学研究发现在冠心病和高血压等危险因素不存在的情况下,糖尿病患者也出现了心衰症状,临床上将导致上述现象出现的疾病称为糖尿病心肌病(DCM)。作为糖尿病的早期并发症,糖尿病心肌病能够导致心肌收缩和舒张功能异常。尽管糖尿病心肌病的发病机制仍然不明确,但是氧化应激在其中发挥了重要的作用。高血糖引起的氧化应激诱导微血管病变的发生,导致心肌细胞死亡、肥大、纤维化和功能障碍。此外,氧化应激引起DNA链的断裂并激活了聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)。PARP-1是PARP家族中研究最为广泛的一种核酶。PARP-1具有3个功能结构域：DNA结合结构域、自我修饰结构域和催化结构域。正常情况下,PARP-1参与了机体DNA损伤的修复和遗传物质的稳定。然而,当PARP-1被过度激活时,它会快速消耗胞内NAD以便将聚ADP核糖转移到靶蛋白上。为了重新合成NAD,细胞会过度消耗ATP,从而导致能量耗竭和细胞死亡。抑制PARP-1可以减少细胞能量消耗而减少细胞死亡。此外,最近研究显示抑制PARP-1还能够诱导Akt磷酸化,激活抗凋亡信号转导通路。在心脏中,胰岛素样因子1(IGF-1)可以通过诱导胰岛素样因子1受体的磷酸化保护心脏功能,而后者的磷酸化能够激活PI3K/Akt信号通路。在以往研究的基础上,我们提出如下假设：1)抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减少高糖诱导的心肌细胞凋亡；2)抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1减少凋亡的作用是通过激活IGF-1R/Akt信号通路来实现的。本研究正是基于以上思路,我们设计了体外实验以验证这一假说。旨在探讨聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在糖尿病心肌细胞凋亡中的作用和可能机制,以期寻找到糖尿病心肌病新的预防和治疗靶点。材料与方法1.细胞培养及模型建立：应用DMEM培养大鼠H9c2心肌细胞,以低糖(5.5mM)和高糖(33mM)分别刺激细胞。2.基因和蛋白表达的干预：体外采用瞬时转染PARP-1siRNA的方式抑制PARP-1的基因表达；分别应用IGF-1和PPP以促进或抑制IGF-1R的磷酸化水平。3.激光共聚焦显微镜：分别检测大鼠心肌细胞内超氧阴离子(O2-)和活性氧簇(ROS)的含量。4.流式细胞术：检测各刺激组心肌细胞的凋亡水平。5.实时定量逆转录PCR (Real-time RT-PCR):检测大鼠心肌细胞中PARP-1的基因表达水平。6.蛋白印迹(western blotting analysis):分别检测大鼠心肌细胞中PARP-1蛋白,IGF-1R和Akt蛋白的磷酸化水平。研究结果1.高糖诱导大鼠心肌细胞的氧化应激具有时间依赖性：应用高糖DMEM (33mM)分别刺激大鼠心肌细胞24h、36h(?)48h,应用DHE和DCF进行细胞染色,激光共聚焦显微镜拍片检测细胞中超氧阴离子和ROS的生成水平。结果显示,应用高糖刺激24h后,心肌细胞中的氧化应激水平与正常对照组(5.5mM)相当；应用高糖刺激36h,与正常对照组相比,超氧阴离子和ROS的生成分别增加了将近1倍和3倍(p＜0.05,VS. control);应用高糖刺激48h后,超氧阴离子和ROS的生成分别增加了将近3倍和4倍(p＜0.01,VS.control)。2.高糖刺激增加了心肌细胞内PARP-1的表达和活性：分别应用高糖刺激心肌细胞24h.36h口48h后,检测细胞中PARP-1的表达与活性水平RT-PCR结果显示,与正常对照相比,高糖刺激24h后PARP-1基因表达无明显变化,高糖刺激36h和48h能够明显增加心肌细胞中PARP-1的基因表达量。蛋白印迹结果显示,高糖刺激24h后PARP-1和PAR蛋白表达无明显变化,高糖刺激36h和48h明显增加了PARP-1和PAR蛋白的表达量,且呈现时间依赖性。这些结果显示高糖能够增加PARP-1的表达和活性。3.PARP-1siRNA减少了PARP-1基因和蛋白的表达量：实验中我们应用了PARP-1的siRNA来抑制PARP-1的表达,并用RT-PCR和蛋白印迹的实验方法检测了干扰效率。RT-PCR结果显示与正常对照相比,PARP-1siRNA明显减少了PARP-1基因的表达；蛋白印迹结果显示应用PARP-1siRNA使PARP-1蛋白表达量减少到正常对照的一半。PARP-1siRNA的阴性对照对其基因和蛋白表达没有明显影响。这些结果显示PARP-1siRNA能有效抑制PARP-1的表达。4.抑制PARP-1减少了高糖诱导的胞内NAD+消耗：一旦被DNA损伤激活,PARP-1就会以胞内NAD+为底物进行聚ADP核糖化反应。我们应用NAD检测试剂盒测定各组细胞NAD+的水平。分光光度结果显示与正常对照组相比,高糖能够明显降低胞内NAD+的含量；而抑制PARP-1能够减少高糖诱导的NAD+消耗。这些结果说明PARP一1参与了高糖诱导的胞内NAD+消耗。5.抑制PARP-1减少了高糖诱导的心肌细胞凋亡：随后我们应用流式细胞术检测了各种心肌细胞的凋亡状况。结果显示与正常对照相比,高糖能够增加细胞的凋亡水平；应用IGF-1能够减少高糖诱导的细胞凋亡,而PPP却能够增加高糖引起的细胞凋亡；抑制PARP-1后,高糖诱导的心肌细胞凋亡水平明显减少。这些结果显示,与IGF-1一样,抑制PARP-1也能够减少心肌细胞凋亡。6.抑制PARP-1增加了Akt磷酸化水平：在接下来的实验中,我们研究了抑制PARP-1减少细胞凋亡的可能机制。考虑到Akt在抗凋亡中的重要作用,我们检测了细胞中Akt的表达。蛋白印迹结果显示,各组细胞总Akt的表达没有明显变化；但是与高糖刺激组相比,应用IGF-1和PARP-1siRNA能够增加Akt的磷酸化水平；应用PPP却减少了磷酸化Akt的表达。这些结果显示Akt参与了抗凋亡机制。7.抑制PARP-1增加了IGF-1R的磷酸化水平：随后我们检测了IGF-1R的表达量。蛋白印迹结果显示,各组细胞总的IGF-1R表达没有明显变化；但是与高糖刺激组相比,应用PPP减少了磷酸化IGF-1R的表达,应用IGF-1和PARP-1siRNA却能够增加IGF-1R的磷酸化水平。这些结果显示抑制PARP-1减少凋亡是通过激活IGF-1R/Akt细胞通路来实验的。结论及意义1.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减少高糖诱导的心肌细胞凋亡；2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1减少凋亡的作用是通过激活IGF-1R/Akt通路实现的；3.通过对高糖诱导的大鼠心肌细胞凋亡的研究,我们发现聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1或许是未来治疗糖尿病心肌病的新靶点。
田景惠[10]2004年在《冠心病病人细胞黏附分子与巨细胞病毒抗体水平的变化及其临床意义》文中进行了进一步梳理目的 观察冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)病人细胞黏附分子及人类巨细胞病毒抗体水平的变化，以探讨细胞黏附分子(CAMs)的变化及巨细胞病毒感染与CHD发病之间的关系，以便为临床预防、诊断及治疗CHD提供实验室依据。 方法 采用酶联免疫吸附(ELISA)的方法，检测了60例CHD病人血浆可溶性细胞黏附分子-1(sICAM-1)、可溶性P-选择素(sP-sel)的含量及血清抗人类巨细胞病毒抗体(HCMV-IgM，HCMV-IgG)的变化，并与健康对照组进行比较。 结果 CHD病人血浆sICAM-1、sP-sel水平明显升高，与对照组比较有显着性差异(t=5.794～7.136，P＜0.01)；且急性心肌梗死(AMI)病人sICAM-1、sP-sel水平显着高于其他各型病人(t=1.862～8.154，P＜0.01)，不稳定性心绞痛(UAP)病人sICAM-1、sP-sel高于稳定性心绞痛(SA)病人(t=3.524～3.666，P＜0.01)。CHD病人HCMV-IgM的阳性率为15％，与对照组相比较无统计学差异(x~2=0.108，P＞0.05)，且两组OD值比较亦无显着性意义。CHD病人血清HCMV-IgG阳性率在1：80稀释度水平与对照组比较无统计学差异，但表示两组平均感染水平的HCMV-IgG OD值比较统计学差异显着(t=3.904，P＜0.05)。在血清1：160、1：320、1：640稀释度水平，CHD病人HC-MV-IgG阳性率与对照组有显着性差异(x~2=5.76～6.43，P＜0.05)；且在血清1：160、1：320稀释度水平，AMI与OMI的HCMV-IgG阳性率均高于UAP和SA组，在血清1：640稀释度水平，AMI组的阳性率高于UAP和SA组。CHD病人HCMV-IgG(OD值)、HCMV-IgM(OD值)与sICAM-1、sP-sel之间存在明显的相关性(r=0.367～0.639，P＜0.05～0.01)，其中尤以HCMV-IgG、HCMV-IgM与sICAM-1之间的相关性更明显(r=0.528～0.639，P＜0.01)。 结论 CHD病人sICAM-1、sP-sel明显高于正常对照组，AMI组sICAM-1、sP-sel水平高于其他各组，UAP组高于SA组，表明炎症反应参与了CHD的发病过程且在一定程度上反映了病情变化；CHD病人存在高滴度的HCMV-IgG抗体，提示HCMV感染与CHD有关，长期、慢性、反复HCMV感染可能启动或促进了CHD的发生与发展。另外，CHD病人sICAM-1、sP-sel与HCMV抗体之间存在明显的相关性，提示HCMV感染可使黏附分子的表达上调。
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