赵善超[1]2004年在《晚期糖基化终产物受体胞外段和胞内段的克隆、表达、纯化及功能研究》文中研究说明背景 晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)是一种膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。人RAGE由404个氨基酸组成，分别由较大的细胞外段(321个氨基酸残基)、跨膜段(19个氨基酸残基)及短的细胞内段(41个氨基酸残基)3个部分构成。氨基酸序列分析表明，RAGE为免疫球蛋白超家族的新成员，它与免疫球蛋白超家族中的MUC18糖蛋白、神经细胞粘附分子(nerve cell adhesion molecule,NCAM)及CD20胞内部分的氨基酸序列高度同源。可溶性RAGE(soluble RAGE,sRAGE)即RAGE胞外段，为配体结合部位，具有V型片段紧接两个C型片段的免疫球蛋白样结构，每个都含有一对保守的半胱氨酸残基，V型片段还含有两个与N偶联的糖基化位点，这些对于RAGE分子结构的稳定性和特异识别配体的功能具有重要意义。在胞外段之后是一个跨膜区和一条带有高度负电荷的胞质尾巴。胞内段RAGE与B细胞激活标记CD20具有高度同源性，该段很可能在配体占领受体后结合胞浆内信号转导分子，产生细胞效应。RAGE虽然是由于与AGE相互作用被发现并因此得名，但其配体并不是一段简单的多肽，而是一个配体家族，包括晚期糖基化终产物(advanced glyeation end products，AGE)，双性素抽力pboterin)，淀粉样p多肤(娜yloid一pp即tide)，细胞外新鉴定的RAGE结合蛋白(extracellular newly identified RAGE七访ding protein，阴一RAGE)，高迁移率族蛋白BI(high mobility grouP protein BI，HMGBI)等，这些配体分别与RAGE相互作用，在各种疾病中扮演着不同的角色，这使得对RAGE功能的研究更有意义，但也在一定程度上增加了研究的复杂性。 RAGE对AGE进行结合、内吞，并使其降解是它最基本的功能。这一功能在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及血管平滑肌细胞等细胞中均有表现。在AGE与RAGE结合并摄入细胞内这一过程的同时启动了AGE的病理效应:通过PKe、PTK、PZ IRAs、E双l甩、p3s MApK、氧自由基、NF一虑等环节，激活细胞内多种信号转导机制，产生氧化应激，激活核转录因子NF一祀，引起白细胞趋化;触发各种细胞因子的分泌，包括TNF一a、IL一l、IL一6、PDGF、及vACM一1等等，引起炎症反应;刺激结缔组织细胞异常增生;促使血管内皮细胞通透性增加，血管基底膜增厚变硬;诱发血栓形成;与系膜细胞作用促使肾脏基底膜成分大量增殖，导致肾小球硬化;介导成纤维细胞、平滑肌细胞增殖，从而引起各系统和脏器的一系列病变，在糖尿病慢性并发症、透析相关性淀粉样变(dial”15一ated amyloidosis，D双)、阿尔采默氏病(^一zheimer，5 disease，AD)、动脉粥样硬化等疾病发生中起着重要作用。对RAGE结构和功能的认识可能为这些疾病的防治提供新靶位，因此具有重要意义。 随着对RAGE研究的不断深入，研究者们更加深刻地认识到，阻断RAGE与其配体的结合效应，对于这些疾病的预防和治疗具有重要意义。抗RAGE抗体和sRAGE是公认的阻断剂。sRAGE是RAGE的细胞外段部分，它可特异结合AGE，但由于不具有胞内段部分，所以不介导生物效应。在体内，用sRAGE治疗载脂蛋白E缺乏的糖尿病鼠，可完全抑制糖尿病性动脉粥样硬化的形成。大量体外实验也证实，sRAGE对由RAGE介导的AGE所引起的血管通透性增加及氧化应激等有阻断作用。而抗RAGE抗体则是通过封闭细胞膜表面RAGE，使其不能与AGE结合，从而达到阻断AGE进入细胞内的目的。因此，利用抗RAGE抗体或sRAGE阻断RAGE介导的病理效应，将会为这些疾病的治疗提供新方法。国外学者已成功克隆了RAGE胞外段，获得sRAGE蛋白，并以其为抗原制备了抗RAGE抗体，但这些研究结果尚未商品化。国内尚无人克隆RAGE，因此阻碍了对AGE.RAGE病理生理研究的进展。RAGE胞内段尚未见克隆成功的报告，RAGE在细胞内首先与哪些蛋白相互作用也尚未被阐明。本研究的目的是分别构建和表达人RAGE的胞外段和胞内段，鉴定其生物学功能，筛选可能与RAGE胞内段相互作用的功能蛋白，从而为进一步深入研究RAGE的细胞内信号转导途径奠定基础。方法1.RAGE胞外段和胞内段融合蛋白的获得(l)应用亚克隆的方法，构建了RAGE胞外段和胞内段的表达载 体，其中胞外段构建于带有His标记的pET一14b载体上，胞内 段构建于带有GsT标记的pGEx一KG载体上。(2)以1~oFL终浓度IPTG诱导表达，在变性条件下以Ni2+~N丁A 亲和树脂进行纯化，获得大量变性RAGE胞外段融合蛋白，进 而进行了复性。(3)以0.1~oFL终浓度IPTG诱导，同时在降低温度、适当延长 时间的条件下进行表达，在非变性条件下以Niz+~NTA亲和树 脂进行纯化，获得少量可溶性RAGE。(4)以1~。比终浓度印TG诱导表达，Glutautione SuP翻ow亲 和树脂进行纯化，获得大量可溶形式的RAGE胞内段GST融 合蛋白。2.sRAGE对人脐静脉内皮细胞(human umbUieal vein endothelial cells，RUVEC)IL一8基因表达与蛋白合成的阻断作用(1) AGE一HSA对HIJvEc分泌IL一8的作用 AGE一HsA作用的剂量关系:内皮细胞接种在%孔培养板 上，在无血清培养基中静止12h?
丁宁, 肖慧, 高巨, 许立新, 佘守章[2]2009年在《晚期糖基化终产物受体胞外段的原核表达及其相互作用蛋白的筛选》文中研究表明目的构建晚期糖基化终产物受体(receptor for ad-vanced glycation end-product,RAGE)胞外段基因的原核表达载体并诱导表达,应用噬菌体展示技术筛选其相互作用蛋白。方法用RT-PCR方法扩增人RAGE胞外段cDNA,构建于原核表达载体pET14b,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导RAGE胞外段融合蛋白表达,用Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化并行Western blot鉴定。以重组RAGE胞外段蛋白为靶分子,进行3轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第3轮洗脱物中随机挑选分隔良好的噬菌体克隆扩增后进行ELISA鉴定。对获得的阳性噬菌体克隆分别进行扩增、纯化,提取DNA测序后翻译为氨基酸序列,用BLAST软件搜索Gen-Bank中的同源序列。结果成功构建并表达、纯化了RAGE胞外段融合蛋白。经过3轮筛选后,随机挑取的24个噬菌体克隆中11个可与RAGE胞外段结合。对11个噬菌体测序后用BLAST软件搜索同源序列,得到14个编码蛋白。结论应用噬菌体展示技术筛选到与RAGE胞外段相互作用的蛋白,为进一步研究其功能和作用机制提供新线索。
赵善超, 姜勇, 刘靖华, 李志杰, 邓鹏[3]2005年在《人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定》文中研究指明目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化。方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段,利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性。转化大肠杆菌BL21(DE)3,用异丙基b-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达。以尿素对获得的包涵体进行处理,用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性。以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定。结果克隆的hsRAGE完全正确,经过表达与纯化,获得了相对分子质量约45000的融合蛋白。纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别。所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性,并能够抑制AGE诱导的内皮细胞NF-kB的表达。结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达,得到大量的复性蛋白;该蛋白具有特异的免疫原性,保持与AGE的结合活性,并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用。
参考文献：
[1]. 晚期糖基化终产物受体胞外段和胞内段的克隆、表达、纯化及功能研究[D]. 赵善超. 第一军医大学. 2004
[2]. 晚期糖基化终产物受体胞外段的原核表达及其相互作用蛋白的筛选[J]. 丁宁, 肖慧, 高巨, 许立新, 佘守章. 中国药理学通报. 2009
[3]. 人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定[J]. 赵善超, 姜勇, 刘靖华, 李志杰, 邓鹏. 第一军医大学学报. 2005