沈淑萍, 朱莉萍, 孙佳红, 刘牧[1]2004年在《益气活血中药对大鼠前脑不全缺血再灌注后海马区血管内皮细胞生长因子表达的影响》文中指出目的:明确血管内皮细胞生长因子(VEGF)参与大鼠前脑不全性缺血再灌注损伤的病理过程,探讨益气活血中药对VEGF蛋白表达的影响。方法:对大鼠急性前脑不全性缺血再灌注模型应用HE染色法和免疫组织化学方法分别检测大鼠前脑不全缺血再灌注后1~7天海马区毛细血管密度(MVD)和VEGF蛋白表达的变化。结果:生理盐水组的MVD在再灌注3天时明显降低;中药组3天时开始降低,7天时明显降低。免疫组化结果显示:缺血再灌注组VEGF蛋白的表达明显高于假手术组且在3天时达到高峰,7天时逐渐减弱,中药组在各个时间点的表达均强于生理盐水组。结论:缺血再灌注可上调VEGF蛋白在大脑海马区域的表达;益气活血中药治疗后能增强VEGF蛋白的表达,从而减少毛细血管的消失,为内皮细胞增殖、迁移、新血管再生提供基础保障。
孙佳红[2]2003年在《益气活血中药对大鼠前脑不全缺血再灌注后海马区血管内皮细胞生长因子表达的影响》文中指出目的 明确血管内皮细胞生长因子(VEGF)参与大鼠前脑不全性缺血再灌注损伤的病理发展过程，探讨益气活血中药对VEGF蛋白表达的影响及意义。方法 采用二条血管闭塞的大鼠急性前脑不全性缺血再灌注模型，应用HE染色法和免疫组织化学方法分别检测大鼠前脑不全缺血再灌注后1-7天海马区毛细血管密度(MVD)和VEGF蛋白表达的变化，观察益气活血中药对MVD和VEGF蛋白的影响。结果 生理盐水组的毛细血管密度在再灌注3天时明显降低；中药组3天时开始降低，7天时明显降低。免疫组化结果显示：缺血再灌注组VEGF蛋白的表达明显高于假手术组且在3天时达到高峰，7天时逐渐减弱，中药组在各个时间点的表达均强于生理盐水组。结论 缺血再灌注可上调VEGF在大脑海马区域的表达；益气活血中药治疗急性脑缺血能增强VEGF蛋白的表达，从而减少毛细血管的消失，为内皮细胞增殖、迁移、新血管再生提供基础保障，这可能是益气活血中药抵抗脑缺血再灌注损伤的机制之一。
魏运湘[3]2009年在《和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠血管新生的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理研究表明,脑血管闭塞以后,缺血区出现血管增生,其增生的范围和程度直接关系到半暗带血流的改善,影响神经元生理功能的恢复除对缺血区现有的微血管结构功能的完整性给予保护之外,还需促进治疗性血管的新生以加强对缺血区的血流供应,挽救损伤的脑组织。脑缺血后的血管新生可被一系列血管生长因子调节。血管生成生长因子具有正性调控作用,包括内皮细胞特异性的血管内皮生长因子(VEGF)家族、血管生成素(Ang)家族等。VEGF/VEGFR系统可能在启动血管新生中发挥关键性作用,是整个脑缺血后血管新生调控的中心环节。而Ang及其受体家族被认为是最重要的血管稳定因子,它们抑制血管内皮系统(ECS)的增殖。脑缺血再灌注会导致脑微血管内皮细胞功能受损,通透性明显增高,血脑屏障严重破坏,是引起脑水肿最常见原因之一,研究对脑微血管内皮细胞具有保护作用的药物及方法具有重要的临床意义。中医学认为缺血性脑血管疾病属于“中风病”、“卒中”等范畴。我们认为中风的病机为气血失和、脑络失养,因此提出和血生络法治疗中风的观点,以人参养荣汤化裁为和血生络方,在临床当中治疗缺血性脑血管病取得了良好的疗效。目的:将和血生络方用于大鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO/IR)模型,观察其对对脑组织血管生成生长因子、血管生成素-1(Ang-1)及其受体(Tie-2)表达、大鼠神经功能评分和脑含水量的影响,探讨和血生络方对缺血性脑损伤后血管新生作用及其机制,同时观察其对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞活性、VEGFmRNA的影响,为和血生络方治疗脑梗塞提供实验依据。方法:研究内容共分四部分。第一部分:和血生络方对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织微血管密度和血管内皮生长因子的影响健康Wistar大鼠,体重250～300g。将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、和血生络方组,参照文献,后两组线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模(MCAO/IR)模型,大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(350mg/kg体重)麻醉,仰卧固定于手术台上,颈部正中切口,暴露分离右侧颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA) ,结扎CCA ECA根部及分支。用动脉夹夹闭CCA远心端,在CCA近分叉处剪一小口,经此插入直径0.2mm头端圆钝的渔线,插入深度为18.5±0.5mm。结扎颈总动脉,缝合皮肤。2h后抽出尼龙线栓,建立脑IR模型。假手术组只分离、暴露血管,不结扎颈总动脉及颈外动脉,不插入尼龙鱼线。参照Zea Longa 5分评分标准: 0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向外侧转圈;3分:向对侧倾斜;4分:不能自发行走,意识丧失。1～3分大鼠为合格,进入实验。各组大鼠届时以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,打开胸腔,经心脏灌注0.9%的生理盐水,续之以4%多聚甲醛灌流固定。剥取脑组织,以视交叉到枕叶处两点冠状切片。免疫组化步骤:P V法染色,染色步骤按说明书进行,VIII因子、VEGF的浓度均为1:100,DAB显色。胞浆有棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞。微血管密度:凡染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞族作为一个血管计数,参照Weidener计数方法,计算出每1 mm2面积内微血管的数量,即微血管密度,然后求其均值。数据采用均数±标准差( x±s)表示,用SPSS for Windows 10.0统计软件处理,组间两两比较用q检验,显着性差异水平以0.05和0.01为标准。第二部分:和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠血管生成素-1及其受体表达的影响动物分组、造模方法及免疫组化步骤同上。第叁部分:和血生络法对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞活性和VEGFmRNA的影响大鼠脑微血管内皮细胞的培养:取1周内W istar大鼠,无菌条件下取出大脑,放入预冷D hank′s液中,剥离软脑膜、大血管及大脑髓质,用眼科剪将大脑皮质剪碎成1mm3的小块,移入匀浆器中匀浆,将匀浆液依次通过100目和200目尼龙网过滤,收集200目尼龙网上的微血管段。用0.2%胶原酶37℃消化20min。离心所得沉淀用DMEM液悬浮后,接种于明胶预先包被的培养瓶中,37℃,5%CO2培养箱中静置培养。本实验用第3代细胞,分为正常组及缺氧组,缺氧组建立缺氧模型:将细胞移入厌氧培养箱中(37℃,95%N2,5%CO2)造成缺氧模型。和血生络方组在造模时分别给予大、中、小剂量的和血生络方中药;采用MTT法测定各组细胞活性,用RT-PCR方法测定VEGFmRNA。第四部分:和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分和脑含水量的影响1大鼠一般状况的比较:和血生络方能显着改善脑缺血再灌注后大鼠的一般状况:明显改善大鼠的活动、皮毛光泽度、饮食等状况。2神经功能评分:采用Longa 5分评分神经功能评分标准对各组脑缺血再灌注后大鼠进行经功能评分。3脑含水量的测定:动物处死后,取出全脑,去除嗅脑,低位脑于及小脑,立即称取脑湿重,后置于90℃烤箱将组织块烤至恒重,测干重。计算脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。结果:第一部分:和血生络方对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织微血管密度和血管内皮生长因子的影响1和血生络方对脑缺血大鼠后微血管密度的影响正常组和假手术组MVD比较差异无统计学意义。自7天开始,模型组与和血生络方组缺血周边区微血管计数明显增多。和血生络组皮层缺血周边区微血管计数又明显多于模型组。2和血生络方对脑缺血大鼠VEGF表达的影响正常组和假手术组VEGF表达较弱。模型组第1d时见少量VEGF表达,与正常组相比,3d后模型组VEGF阳性细胞数逐渐增多。与模型组比较,和血生络方组阳性细胞数更多(P<0.01),第7d时,阳性细胞数达到高峰,表达细胞主要为神经胶质细胞、神经细胞及血管内皮细胞。在14d时模型组与和血生络方组VEGF表达开始下降,在第21d时仍有阳性细胞表达,仍未恢复到正常水平。第二部分:和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠血管生成素-1及其受体表达的影响正常组和假手术组Ang-1表达较弱。模型组第1d时见少量表达,与正常组比较,3d后模型组Ang-1阳性细胞数逐渐增多。与模型组比较,在14d时和血生络组Ang-1阳性细胞数明显增多。Tie-2的表达特点与Ang-1相似。第叁部分:和血生络法对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞活性和VEGFmRNA的影响1和血生络方对缺氧后脑微血管内皮细胞活性的影响与正常组比较,模型组细胞活性明显下降(P<0.01) ,表明缺氧可诱发内皮细胞造成比较严重的损伤。与模型组比较,和血生络方各剂量组细胞活性均明显增强(P<0.01)。2和血生络方对缺氧后脑微血管内皮细胞VEGFmRNA的影响与正常组比较,模型组细胞VEGFmRNA明显增高(P<0.01)。与模型组比较,和血生络方后小剂量、中剂量VEGFmRNA的表达增强(P<0.05)。大剂量组增高更明显(P<0.01)。第四部分:和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能和脑含水量的影响1和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响正常组与假手术组大鼠的神经行为学表现正常,评分均为0分。模型组神经学评分多数为2分以上。与模型组比较,和血生络方组在第7天时评分明显降低(P<0.01)。2和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响模型组3 d时的脑含水量达到高峰,在7d时脑含水量仍未恢复正常。与模型组比较,和血生络方组的脑含水量在3d和7d时明显下降(P<0.05, P<0.01)。假手术组的脑含水量与正常组比较均无明显差异,表明手术本身对大鼠脑含水量无明显影响。结论:1和血生络方可使脑缺血周边区MVD表达增强,使血管数目增多。可促进VEGF表达,第7d时,阳性细胞数达到高峰,表达细胞主要为神经胶质细胞、神经细胞及血管内皮细胞。提示有促进缺血区的血管新生的作用。2和血生络方可提高Ang-1和Tie-2表达,有促进缺血区的血管新生的作用,14d时表达最强,在血管形成后期具有非常重要的作用。3和血生络方可提高缺氧脑微血管内皮细胞活性和VEGFmRNA的表达,这可能是和血生络方对缺氧的脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。4和血生络方可改善局灶性脑缺血大鼠神经功能评分,减轻脑含水量,抑制脑水肿高峰的形成,提示和血生络方组可明显减轻脑缺血大鼠神经损伤,对脑缺血再灌注具有保护作用。
郑一[4]2004年在《脑络舒通治疗缺血性中风的作用机制研究》文中研究表明1 目 的 中风病是中老年人的常见病, 多发病, 严重危害人类健康. 本课题的目的是讨论颅脑瘀水毒邪与缺血性中风病发病的关系和脑络舒通治疗缺血性中风的药效学机制. 本课题在中医基础理论的指导下 ,分析了缺血性中风的发病规律, 认为瘀, 水 ,毒邪互结于脑内是中风病急性期的病机重点. 提出活血利水 ,解毒通络治法是缺血后脑水肿治疗的关键. 从脑络舒通对脑组织含水量, 血脑屏障通透性-EP和MMP-9等方面深入探讨脑络舒通的利水作用, 采用血瘀证大鼠凝血指标和临床中风病人血瘀证证侯积分的方法证明脑络舒通的活血功能 .通过观察临床病人血清TNF-α和IL-1的变化来探讨脑络舒通的解毒作用,并从bFGF和nestin 蛋白的表达来讨论脑络舒通对成体神经功能重塑的治疗机制. 2 方 法 2.1 采用光化学诱导大鼠局灶性脑缺血的方法, 设脑络舒通治疗组 ,模型对照组 ,假手术组, 空白组 ,于造模成功后3h始,给予脑络舒通灌胃,连续4d 动态观察体重及神经功能评分的变化,术后第5d 取脑TTC染色后计算梗塞灶体积HE染色后观察病理学改变. 2.2 采用栓线法造成大鼠大脑中动脉缺血3h, 再灌注24h 模型 ,观察各组神经功能评分脑组织含水量 ,用 Evans 蓝测定法观察血脑屏障通透性的改变 ,并采用免疫组织化学方法观察缺血再灌注大鼠大脑-EP表达. 采用RT-PCR方法测定MMP-9mRNA 的表达. 2.3 采用大鼠血瘀模型,观察脑络舒通对血瘀证大鼠凝血,纤溶系统的影响.并在临床观察脑络舒通治疗前后治疗组和对照组病人的血瘀证证侯积分的改变. 2.4 采用放射免疫RIA法观察脑络舒通治疗前后治疗组和对照组病人血清TNF-α 和IL-1 的变化. 2.5 采用免疫组化方法观察光化学诱导的脑缺血大鼠治疗组, 模型组, 假手术组, 空白组脑的第5d 时bFGF的表达和第10d 时nestin 蛋白的表达. 3 结 果 3.1 脑络舒通可以减小光化学诱导的大鼠局灶性脑梗死体积, 治疗组梗死灶体积为7.322.03mm3 明显小于对照组(16.01 2.62mm3)( P<0.001).治疗组大鼠的缺血性病理改变比对照组明显减轻,假手术组和空白组无缺血灶形成. 3.2 MCAO大鼠脑缺血3h再灌注,24h的对照组缺血侧脑组织含水量(79.24 0.61%)和EB含量( 4.78 0.72ug/g) 明显高于空白组(73.43 0.57%)( 2.07 0.15ug/g)治疗组缺血侧脑组织含水量(76.85 0.87%)和EB含量( 3.52 0.63ug/g )明显降低 ,与对照组相比具有显着性差异( P<0.001 )假手术组与空白组则无显着性差异.对照组非缺血侧脑组织含水量(75.590.48%)和EB含量3.24 0.57ug/g 也较空白组增高(P<0.001). MCAO大鼠缺血3h 再灌注24h 时,对照组大鼠缺血灶 -EP 的表达明显升高,以神经胶质细胞表达为主,治疗组大鼠缺血灶 -EP 的表达与对照组相比明显减少.具有显着性差异(P<0.001) 假手术组与空白组相应缺血灶-EP的表达较少,无显着性差异( P>0.05) MCAO大鼠脑缺血3h 再灌注24h时,对照组大鼠(MMP-9mRNA)的表达明显升高,与假<WP=5>手术组和空白组相比具有显着性差异(P<0.001),治疗组大鼠(MMP-9mRNA)的表达较对照组减少(P<0.05).假手术组和空白组大鼠表达较少, 相比较无显着性差异. 3.3 血瘀证大鼠凝血-纤溶指标观察中, 血瘀证大鼠与空白组比较, PT, APTT 明显缩短.(P<0.01 P<0.001) Fig.显着增加(P<0.001), PA 显着增高 (P<0.001).说明血瘀证大鼠存在高凝状态, 治疗组PT, APTT 较对照组延长(P<0.01) Fig 和PA 降低(P<0.001). 3.4 对照组病人血清, TNF- 含量在治疗后 7d 312 041ng/ml 略有下降 与入院时351 045ng/ml 相比无显着性差异(P>0.05) 治疗后 21d血清TNF- 含量 2.810.59ng/ml 与治疗前相比具有显着性差异 (P<0.01) . 治疗组病人血清TNF含量在治疗后7d 2.39 0.33ng/ml 迅速下降 治疗后21d 血清TNF- 含量 1.77 0.48ng/ml 明显下降P<0.001 与对照组相比具有显着性差异(P<0.001) 两组治疗后血清 IL-1 含量较治疗前下降 P<0.05 治疗组下降 0.38 0.16ng/ml 较对照组 0.52 0.12ng/ml 明显 具有显着性差异 P<0.001. 3.4 光化学诱导脑缺血第5d时, 治疗组大鼠缺血边缘区 bFGF 的表达明显增高 ,神经元细胞和神经胶质细胞均有表达 ,与对照组相比具有显着性差异(P<0.001).治疗组海马锥体细胞层中bFGF的表达明显增高, 与对照组相比具有显着性差异(P<0.05) 假手术组与空白组相应缺血边缘区及海马没有bFGF的表达 .各组缺血灶内部 ,皮层与皮层下, 小脑等部位均无bFGF 阳性细胞的表达. 光化学诱导脑缺血第 10d 时, 治疗组大鼠侧脑室室管膜下层和第叁脑室底部 nestin 蛋白的表达明显增高, 与对照组相比具有显着性差异( P<0.001 ),假手术组与空白组侧脑室室管膜下层和第叁脑室底部仅有少量nestin蛋白表达. 治疗组大脑皮质缺血边缘区 nestin 蛋白表达明显增高. 与对照组相比具有显着性差异( P<0.05) 缺血区周围的大脑皮质和皮层下nestin蛋白的表达两组无显着性差异, 假手术组与空白组无阳性细胞表达. 4 结 论 4.1 脑络舒通可减轻MCAO鼠缺血再灌注对血脑屏障的损伤.对血脑屏障通透性具有一定的保护作用, 可抑制脑内 -EP 的合成和释放. 降?
张占军[5]2005年在《基因表达谱权衡清开灵组分配伍治疗脑缺血药效特征分析研究》文中研究指明本研究旨在通过对脑缺血后清开灵组分及其配伍治疗脑缺血基因表达谱变化及其药理学和药效学特色的研究,权衡组分配伍优劣,从分子水平提取有关功能信息的关键因素分析清开灵组分配伍的复杂体系,并且通过相关基因表达特征分析,为方剂配伍研究提供借鉴,为脑缺血药物筛选平台、药效评价方法以及现代中药药物配伍优化和中药资源的合理配置提供重要理论参考及依据,最大程度接近导师王永炎院士所提出的中医药研究需在整体论、系统论、理性论指导下才能更好阐发其原创优势的科学观和发展观。首先,用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型。提取临床疗效较好的清开灵中的四个主要组分黄芩苷,栀子苷,胆酸,珍珠母作为研究对象。为展示方剂的综合效应,整体功能及组分功效的共性和个性特点,实验分为西药对照尼莫地平治疗组,模型组及黄芩苷,栀子苷,胆酸,珍珠母四个单一组分治疗组的同时,增加了黄芩苷+栀子苷,黄芩苷+栀子苷+胆酸,黄芩苷+栀子苷+胆酸+珍珠母,栀子苷+胆酸四个层次不同而又紧密相关同属一系统的组分配伍组。通过脑组织TTC染色测量药物治疗后脑梗塞面积,神经功能检查法对脑缺血后动物进行行为测评,病理及超微组织观察作为药效评价辅助手段。考虑到复杂性研究所遵循的整体、活体、动态观察原则,应用核磁共振弥散加权成像和弥散张量成像技术于造模后1h、脑缺血再灌注3h、12h、24h进一步综合评价模型是否成功及组分配伍的治疗作用,准确界定不同方剂组分配伍的功效层次。根据脑缺血后机体复杂的生理病理反应,简化复杂问题,从先期973工作基础及国外文献报道基因组数据库中提取了372个基因作为靶标,建立了涵盖脑缺血病生理反应特异表达基因及部分非特异表达基因在内的cDNA芯片。于脑缺血模型再灌注后3h、12h、24h分别提取每组3只鼠脑组织总RNA与芯片进行杂交,获取与治疗各组药效功效层次相应时间点对应的芯片杂交基因表达谱数据。采用管家基因(Housekeeping gene)校正和局部加权最小二乘法(LOWESS)方法对数据进行标准化校正,差异表达基因Ratio值和不同矩阵、不同芯片中同一基因的p值做为筛选具有显着统计性意义表达基因的标准。根据国际通用的GO分类原则,运用国际公认的Genespring软件对标准化后数据进行功能分类分析和聚类分析;通过脑缺血后不同组分差异表达基因的个性和共性特点及生物信息学相关研究,结合方剂配伍治疗脑缺血药效,中药对病理环节干预的偏重,权衡复杂体系中方剂配伍的利弊。通过荧光实时定量PCR,蛋白印迹以及指纹图谱特征分析方法对基因芯片实验技术平台及实验结果进行综合评估。基因表达谱权衡清开灵组分配伍治疗脑缺血药效特征分析研究 配伍组黄答普+桅子昔十胆酸+珍珠母,黄琴昔+桅子普+胆酸在TTC染色,行为学,形态学,磁共振成像研究中都体现了显着疗效,黄岑营+桅子昔,桅子昔+胆酸配伍组在所有药效评价指标中,也有一定的治疗作用,但治疗作用较前两组差。尽管黄答昔,桅子昔,胆酸叁个单一组分在TTC染色脑梗塞面积测量中体现了治疗作用,但在动物行为测评及活体磁共振检查中均未见明显治疗作用。珍珠母在所有药效评价指标中均未见显着治疗效果,在四组分配伍中也没有起到药效迭加作用。在黄苏昔、桅子昔、胆酸、珍珠母四个组分治疗组中,共同差异表达的基因只有6个,每组与其它叁个组分别作比较,差异表达基因数目显着不同,黄答昔治疗组有16个,桅子普治疗组有3个,胆酸治疗组为19个,珍珠母治疗组仅有1个。黄芹普+桅子普,桅子昔+胆酸,黄芹昔+桅子营+胆酸,黄芹昔+桅子营+胆酸+珍珠母治疗组的差异表达基因分别为65,24,53和62个,这些基因涉及到了信号转导、蛋白结合、转录调节等多方面。 通过不同组分及其配伍药效及其基因表达谱特征比较分析可以得出以下结论:中药复方配伍的治疗作用较单方效果好,凭借目前一、两种常用的评价方法,难以真正准确和全面地判定药物药效,现有的治疗脑缺血药物筛选平台及药效评价方法,需增加一些活体、动态、全面、综合的分析方法;在治疗脑缺血中,胆酸可以完全发挥珍珠母的药理作用并优于珍珠母,在我们目前开展的二者组方配伍研究中,珍珠母可以弃置不用,可见任何一种中药的任何一种效应,都是来自该中药的一种特定的中药分子组合,基因表达谱特征能够反应这种组合产生的特定效应;中药合理配伍可以起到减毒增效作用;中药配伍的增效作用机制可以通过启动新的作用途径和作用因子而实现;通过基因表达谱评判药效是可行的,组分配伍所产生的药效并不是依赖各单一组分作用及基因数目的迭加而实现的,更重要的是配伍后的整合作用,这种整合作用体现了中医中药作为复杂理论科学的原创优势和整体性,全方发挥疗效的整体作用机制同样在基因mRNA这样的微观世界得到体现;研究中医、中药作用机理,离不开整体观的指导,基因芯片技术是能较好体现或证实中医中药作为复杂理论学科“整体观”的原创优势和整体性及非线性特征的有效研究手段;这种整体综合评价方法的科学应用可以反证配伍优劣,优化配伍组合,指导调节这些非线性关系可以使药效达到最佳。 综上所述,本文在国内外首次将王永炎院士所提出的?
周忠光[6]2007年在《补阳还五汤对Aβ_（1-40）所致AD大鼠β-淀粉样蛋白影响及相关机制的研究》文中认为本项研究以AD发病理论“β-淀粉样蛋白级联假说”和“神经免疫炎症假说”为切入点，以Aβ代谢途径参与AD发病为基础，采用Aβ_(1-40)海马区注射诱发大鼠脑内神经元损伤，复制AD模型大鼠。以β-淀粉样蛋白沉积和神经元损伤病变为治疗靶点，利用Morris水迷宫和神经病理学方法观察AD大鼠行为学及脑组织形态学变化；放射免疫法测定大鼠血清及海马中Aβ、IL-1β、IL-6、TNF-α水平；免疫组织化学法检测大鼠海马区Aβ_(1-40)、β-APP、COX-2、nNOS、IKB-α蛋白表达；RT-PCR法检测海马中β-APPmRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA、TNF-αmRNA的表达。从行为学、细胞、分子和基因水平，探讨中药补阳还五汤对Aβ诱导的AD大鼠的治疗效果及相关机制，为其临床应用提供实验依据。研究结果表明，补阳还五汤对Aβ_(1-40)所致AD模型大鼠学习记忆障碍具有明显改善作用；可显着地降低AD模型大鼠明显增高的海马和皮质Aβ沉积，改善Aβ所造成的神经元损害，改善神经元能量代谢和毛细管的功能，减轻脑中炎性反应；可显著降低对Aβ所致AD大鼠海马β-APP蛋白和其mRNA异常增高表达；降低明显升高的血清及海马中Aβ、IL-1β、IL-6、TNF-α水平；降低前炎性细胞因子IL-1βmRNA、IL-6mRNA、TNF-αmRNA在模型大鼠海马的异常增高表达；升高AD模型大鼠海马的nNOS阳性表达，降低明显升高的海马COX-2、IKB-α阳性表达。上述指标中以补阳还五汤组作用最为明显，活血组优于补气组。中药补阳还五汤可能通过COX-2、IKB-α和nNOS等信号转导途径，调节血液和脑组织免疫炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α及其基因表达，干预β-APP生成与代谢，合理地调控Aβ过度沉积引起的免疫炎症级联反应，有效地减轻Aβ毒性作用所致脑组织神经元损伤，从而改善学习记忆障碍，起到防治AD的作用。
刘德山[7]2007年在《益气补肾中药改善糖尿病脑功能的作用及其机制研究》文中研究表明目的:观察益气补肾中药对糖尿病大鼠脑功能的改善作用,并探讨其作用机制。方法:以“消渴病其本在肾”,“肾生髓,上通于脑”和“脑血辨证”等理论为依据,以糖尿病脑功能损害、高同型半胱氨酸血症、不全脑缺血等复合大鼠模型为实验对象,采用益气补肾中药—脑神康治疗后,测定动物模型的学习记忆及神经电生理学、病理生理学、生物化学以及分子生物学等指标。结果:益气补肾中药—脑神康能降低血糖,降低血同型半胱氨酸浓度,改善脑血流,增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗,提高SOD水平,降低MDA含量,调节脑组织单胺类神经递质含量,上调NOS和Ach E的蛋白表达,上调海马组织神经生长因子NGF、IGF-1的蛋白表达,下调促凋亡蛋白Bax表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,上调Bcl-2/Bax比值,抑制海马神经元的细胞凋亡,抗脑缺血损伤,显着改善高血糖和高Hcy血症引起的糖尿病大鼠脑功能损害。结论:益气补肾中药可显着改善糖尿病大鼠的学习记忆能力和神经传导功能,逆转脑功能损害,其机制可能是通过多层次、多环节、多靶点作用而实现的。
赵光峰[8]2009年在《麝香配伍冰片对缺血再灌注后血脑屏障损伤的影响及机制研究》文中研究指明缺血性脑水肿是脑血管病伴发的最常见的死亡原因,是脑梗死必然且重要的病理过程,对其机制的研究及防治对策,一直是神经科的研究热点之一。其发病机制的主要环节为血脑屏障(BBB)受损。目前对脑水肿的治疗主要有高渗性脱水剂,利尿剂,糖皮质激素以及外科手术减压等,这些治疗虽然能一定程度减轻脑水肿,但都没有解决其发病机制的主要环节即BBB受损的问题。中药及复方对缺血性脑损伤的治疗具有一定的优势,其药理作用的多靶点、多途径性引起了医学界的广泛重视。而醒脑开窍法作为治疗中风的一种重要方法,虽然近年来广泛应用于临床,但一直未能引起足够的重视。本课题通过文献研究,总结并阐述了缺血性中风急性期使用芳香开窍法的必要性,中医药尤其是麝香和冰片对BBB的作用,脑缺血再灌注后BBB损伤的分子机制。根据导师刘亚敏教授等的工作基础,按线栓法造成大鼠大脑中动脉闭塞,建立局灶性脑缺血再灌注模型,造成缺血性脑水肿,采用电镜、免疫组化、RT-PCR等方法,围绕缺血性脑水肿中血脑屏障(BBB)损伤的主要环节,探讨麝香配伍冰片对脑微血管内皮细胞、基质及胶质细胞足突叁个环节的作用,系统地分析麝香配伍冰片对缺血后BBB损伤的影响,阐明其作用的分子机制。为临床合理应用开窍醒脑法治疗急性缺血性中风提供科学的依据,对临床应用也具有重要的指导意义和应用前景。1文献研究1.1缺血性中风的病机为脑窍痹阻、神机失用,醒脑开窍是缺血性中风的基本治则。醒脑开窍法是中风急性期的重要方法,应及早使用。使用开窍药不仅可醒脑开窍、恢复神机,且可兼顾化痰、活血、息风止痉、清热等,一举多得。开窍法在治疗偏瘫、失语、痴呆等后遗症方面也有一定的优势。1.2中医药对BBB的影响目前研究较广泛,芳香开窍药麝香、冰片广泛应用于神经系统疾病,二者透过BBB迅速,麝香可抑制脑缺血后炎症、抗自由基损伤、减轻脑水肿、增加血流量等,对缺血性神经元有保护作用。冰片可改善BBB的通透性,使其他药物能更快更多地进入中枢神经系统发挥作用。1.3脑缺血再灌注后BBB的超微结构损伤,包括内皮细胞肿胀、吞饮小泡增多、紧密连接开放、基底膜破坏及胶质细胞水肿等。BBB损伤分子机制涉及炎性细胞因子、粘附分子、基质金属蛋白酶、水通道蛋白、自由基、花生四烯酸代谢产物、血管内皮生长因子、纤溶酶、凝血酶等,这些因素相互作用,互为因果。2实验研究2.1麝香配伍冰片对缺血再灌注后大鼠病理及BBB超微结构影响的研究目的:通过观察缺血再灌注后大鼠神经元病理及BBB超微结构变化的影响探讨麝香配伍冰片对BBB的保护作用。方法:建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,光镜下观察各组动物神经元病理变化,电镜下观察BBB超微结构。结果:麝香配伍冰片可以有效减轻缺血再灌注后神经元坏死、水肿,BBB内皮细胞肿胀、紧密连接疏松、基底膜结构模糊及胶质细胞水肿等。结论:麝香配伍冰片通过上述作用减轻BBB损害、脑水肿,减轻缺血再灌注损伤。2.2麝香配伍冰片对缺血再灌注后大鼠ICAM-1、LFA-1表达的影响目的:研究缺血再灌注后BBB内皮细胞ICAM-1、LFA-1表达情况,探讨麝香配伍冰片对BBB内皮细胞的保护作用。方法:RT-PCR方法研究ICAM-1mRNA、LFA-1 mRNA表达,免疫组化方法研究ICAM-1蛋白表达变化。结果:麝香配伍冰片、安宫牛黄丸可显着降低缺血再灌注后脑组织中ICAM-1 mRNA及其配基LFA-1 mRNA的表达(P＜0.01),冰片组各时间段ICAM-1 mRNA和缺血2h再灌注48h时间段的LFA-1mRNA也有明显降低(P＜0.05)。蛋白表达方面,麝香配伍冰片组、安宫牛黄丸组、冰片组ICAM-1蛋白表达量较模型组明显下降(P＜0.05),其中麝香配伍冰片组下降最多。结论:麝香配伍冰片可以降低缺血再灌注后粘附分子ICAM-1及其配基LFA-1的表达,从而减轻炎性反应对BBB的损伤而起脑保护作用。2.3麝香配伍冰片对缺血再灌注后大鼠MMP-9、TIMP-1表达的影响目的:研究缺血再灌注后BBB基底膜MMP-9、TIMP-1表达情况,探讨麝香配伍冰片对BBB基底膜的保护作用。方法:RT-PCR方法研究MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达,免疫组化方法研究MMP-9蛋白表达变化。结果:麝香配伍冰片组、安宫牛黄丸组、冰片组各缺血再灌注时间段脑组织MMP-9 mRNA表达均受到明显抑制;与假手术组比较,叁组TIMP-1 mRNA表达明显升高,在缺血2h再灌注24h时间段,麝香组也有相同变化趋势。MMP-9蛋白表达方面,麝香配伍冰片组、冰片组、安宫牛黄丸组较模型组表达下降明显(P＜0.05)。结论:麝香配伍冰片可通过抑制MMP-9表达、提升TIMP-1表达而减轻基底膜细胞外基质的降解和BBB通透性。2.4麝香配伍冰片对缺血再灌注后大鼠AQP4表达的影响目的:研究麝香配伍冰片对缺血再灌注后BBB胶质细胞AQP-4表达情况,探讨麝香配伍冰片对BBB胶质细胞的保护作用。方法:分别用RT-PCR方法、免疫组化方法研究AQP-4 mRNA、AQP-4蛋白表达的变化。结果:在缺血再灌注各时间段,麝香配伍冰片、安宫牛黄丸、冰片均可明显抑制缺血脑组织中AQP-4 mRNA的表达,其中麝香配伍冰片、安宫牛黄丸组降低幅度最大。蛋白表达方面,麝香配伍冰片组、冰片组、安宫牛黄丸组下降明显(P＜0.05)。结论:麝香配伍冰片通过抑制缺血再灌注后脑组织AQP-4 mRNA和蛋白的表达而降低BBB通透性、减轻脑水肿而起到脑保护作用。3本研究的创新性从古至今,绝大多数医家均认为中风急性期出现意识不清才使用“开窍法”,我们以大鼠局灶性脑缺血再灌注模型为基础,研究“芳香开窍”代表药物麝香、冰片药对缺血再灌注后BBB损伤的影响机制,深入研究其作用机理,为临床治疗缺血性中风即使未出现意识不清也可应用芳香开窍法提供依据。过去对麝香、冰片多进行单味药的药理研究,我们以成分比较清楚的、且能通过BBB的两个单味中药麝香、冰片配伍组合进行系统的研究,有别于传统的大复方研究,不仅有利于药物作用的分析及其应用时增效减毒作用的研究,而且便于新药的开发,具有潜在的应用价值。探讨麝香配伍冰片抗缺血性脑损伤的作用机理,对揭示该药对配伍规律及其“芳香开窍”作用机理具有理论意义。现有的研究未能系统阐明该药对抗缺血性脑损伤的机制,因而未能较清晰地认识其作用环节,限制了该药对临床的合理使用。本研究从多角度探讨该药对配伍抗脑缺血损伤的作用及机理。这对于深入认识该药对的配伍原理和临床合理应用均具有指导作用。围绕缺血性脑水肿中BBB损伤的主要环节,从内皮细胞损伤、基质破坏和胶质细胞损伤叁个环节动态研究麝香配伍冰片抗缺血性脑水肿的作用和分子机制,从而系统地研究其作用环节。
郭明冬[9]2007年在《补肾益气活血法治疗血管性痴呆的临床观察与实验研究》文中认为随着人们寿命的延长，血管性痴呆的发病率呈明显上升趋势，已成为人类衰老过程中常见的难治性疾病，而中西医均缺乏理想的治疗效果。积极开展对本病的研究具有重要的现实意义。本研究以中医理论为指导，对治疗该病的补肾益气活血法进行了临床观察和实验研究。1临床研究目的：在前期研究的基础上，进一步规范化观察补肾益气活血法治疗轻度血管性痴呆的临床疗效，并探讨其部分作用机制。方法：采用区组随机、双盲、对照的设计原则，将入选病例70例分为治疗组(50例)和对照组(20例)。治疗组给予口服参芎补肾胶囊，每次5粒，每天3次；对照组给予口服吡拉西坦胶囊(由吡拉西坦片经重新包装而成)，每次5粒，每天3次。两组均观察用药2个月，1／3病例随访1个月。主要观察患者的认知能力(MMSE)、日常生活活动能力(ADL)、神经功能缺损(NFDS)、中医证候、生存质量(WHOQOL-SF36)、脑电图、脑神经递质(乙酰胆碱和单胺类神经递质)及相关安全性指标。结果：补肾益气活血法对轻度VaD患者在认知能力、日常生活活动能力、中医证候叁方面的总有效率分别为74.46％、80.85％和85.11％，其中中医证候方面治疗组优于对照组(P＜0.05)。对以上叁方面的模糊综合疗效评价结果显示治疗组明显优于对照组。结果还显示：该治法对患者总体认知能力及除语言外的各项积分均有明显改善作用，其中对总积分及计算积分的改善作用较对照组明显(P＜0.05)；对日常生活活动能力ADL、IADL积分有明显改善作用，其中对PSMS积分的改善作用较对照组明显(P＜0.05)；对中医证候积分改善明显，且优于对照组(P＜0.05)；对患者总体生存质量改善明显，且优于对照组(P＜0.01)，对生存质量各维度积分均有明显改善作用，且对生理功能(PF)、生理职能(RP)、活力(VT)诸维度的改善作用优于对照组(P＜0.05)；对脑神经递质乙酰胆碱、多巴胺和去甲肾上腺素改善明显，且对乙酰胆碱、去甲肾上腺素的改善作用较对照组明显(P＜0.05)；对患者神经功能缺损积分和脑电图也有一定改善作用。安全观测显示该治法所用药物安全、无毒副作用，适宜患者长期服用。结论：补肾益气活血法对轻度VaD有较好的临床治疗效果，对患者认知能力、日常生活活动能力、中医证候、生存质量、神经功能缺损、脑电图、脑神经递质诸方面都有较好改善作用。其部分作用机制与改善患者脑内部分神经递质水平有关。2实验研究目的：进一步探讨补肾益气活血法对血管性痴呆的部分作用机制。方法：实验采用bEnd．3小鼠脑微血管内皮细胞株制作缺氧复氧VaD病理模型。取换培养液后的bEnd．3脑微血管内皮细胞株，随机分为7组，除正常对照组外，分别加上适量事先制备的正常大鼠血清或含药血清(参芎补肾含药血清或吡拉西坦含药血清)，孵育24小时后，PBS冲洗一遍，再换上新的培养液，分别加上述含药血清，放置于自制的缺氧袋中，缺氧7小时后复氧1小时，然后取上清检测NO、ET和VEGF的含量。结果：对NO、ET的检测结果表明，模型组bEnd．3脑微血管内皮细胞株分泌的NO较正常对照组减少，而ET则增多，NO／ET比值变小，差异均有显着的统计学意义(P＜0.01)。参芎补肾组和吡拉西坦组对缺氧复氧造成bEnd．3脑微血管内皮细胞的缩血管功能增强有明显的改善作用(P＜0.01或0.05)，能够促进bEnd.3脑微血管内皮细胞株分泌NO，而减少ET的分泌，提高NO／ET比值，其中参芎补肾A、B、C叁个剂量组的改善作用明显优于吡拉西坦(P＜0.01或0.05)。对VEGF的检测结果表明，模型组bEnd．3脑微血管内皮细胞株分泌的VEGF较正常对照组明显减少(P＜0.01)。与模型组相比，参芎补肾与吡拉西坦含药血清均有明显促进缺氧bEnd．3脑微血管内皮细胞株分泌VEGF的作用(P＜0.01)；但参芎补肾各剂量组的改善作用均明显优于吡拉西坦(P＜0.01)。结论：补肾益气活血法能够促进缺氧复氧后脑微血管内皮细胞释放NO、VEGF，同时减少释放ET，从而改善血管内皮功能状态、促进血管再生，并直接和间接地保护脑神经。这可能是该治法治疗血管性痴呆的作用机制之一。
程传浩[10]2007年在《复智胶囊对血管性痴呆胆碱能系统及炎性细胞因子的影响》文中认为目的:观察复智胶囊对血管性痴呆(Vascular Dementia, VD)的临床疗效,观测复智胶囊对VD大鼠学习记忆、海马内乙酰转移酶(CHAT)表达、胆碱酯酶(AchE)活性、血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的影响,探讨该药对急、慢性脑缺血所致痴呆的作用机制。方法:临床研究按随机单盲对照方法,采用DSM IV(美国《精神病诊断和统计手册》)及NINDS-AIREN(美国国立神经系统疾病与卒中研究所和瑞士神经科学研究国际协会)关于VD的诊断标准进行病例筛选,并用临床痴呆分级量表(CDR)、简易智能状态检查(MMSE)、行为能力检查(BBS)、日常生活能力量表(ADL)及中医辨证标准对患者进行整体评定。经患者同意符合纳入标准而列入研究对象计80例,随机分为治疗组和对照组各40例;治疗组口服复智胶囊每次4粒,每日3次;对照组口服安理申,5mg/次,1次/日。两组均连续用药12周。治疗前、治疗6周后、治疗12周后对患者认知功能(MMSE-R)、行为能力(BBS)、日常生活能力(ADL)、中医证候指标进行评定。安全性观测采用血、尿、粪常规及肝、肾功、心电图监测,治疗前后各1次。实验研究采用急性缺血再灌注及慢性缺血VD模型进行研究。前者选用4-血管阻断法制造动物模型,随机分为复智胶囊治疗组和模型组各30例,假手术组10例,在第3d、7d、4w 3个时段随机从治疗组、模型组各抽取10只检验其主动回避反应(AAR)习得率、血清TNF-α、IL-6含量及海马CHAT表达、AchE活性。后者选用双侧颈总动脉结扎法制备慢性缺血VD模型,随机分为模型组、复智胶囊高、中、低剂量治疗组、安理申对照组,以及假手术组,共6组,每组10只,治疗1月。于造模前后及用药后用水迷宫方法检测各组大鼠学习记忆情况;治疗后检测各组大鼠海马CHAT表达、AchE活性、血清TNF-α及IL-6的含量。结果:80例患者按方案完成临床试验,无脱落及剔除病例。治疗组与对照组用药后MMSE评分较前改善(P<0.01),两者无显着差异(P>0.05)。BBS评分两组用药后均有改善(P<0.01),治疗组优于对照组(P<0.05)。用药后两组ADL评分较前改善(P<0.01),治疗组优于对照组(P<0.01)。用药后两组均降低中医证候积分(P<0.01),治疗组优于对照组,差异极显着(P<0.01)。临床疗效判定方面,MMSE、BBS、ADL评分及中医证候积分总有效率均为95%,而对照组分别为75.0%、80.0%、67.5%、72.5%,除MMSE评分无显着差异外(P>0.05),其他均有显着性差异(两组比较:BBS,P<0.05;ADL,P<0.01,中医证候积分,P<0.01)。对急性缺血再灌注VD大鼠的实验研究发现,模型动物的AAR习得率3d即显着低于对照组,7天、4w时进一步降低;造模后3d海马CHAT阳性面积及阳性面积比率即显着减少(P<0.01),第7d、4w保持在相同的低水平状态;海马AchE含量在3d时显着升高(P<0.01),第7d、4w处于低水平状态;血清IL-6造模3d时升至最高(P<0.01),7d时降低,但仍然高于假手术组(P<0.05),4w时已经接近正常水平(P>0.05);TNF-α于造模3d升高(P<0.01),7d达最高(P<0.01),4w时降低,但仍然高于假手术组(与假手术组相比,P<0.05)。复智胶囊可以提高各时段AAR习得率(P<0.05),降低IL-6在缺血早期的含量,降低各时相TNF-α含量;在早期(3d)即提高CHAT的表达,在7d时AchE活性下降且接近假手术组(P<0.05)。对慢性缺血VD大鼠的研究发现,大鼠学习记忆能力在造模后显着降低(P<0.01);海马内CHAT表达降低(P<0.01),AchE增高(P<0.01);TNF-α及IL-6含量升高(P<0.01)。与模型组比较,复智胶囊不同剂量治疗后,中、高剂量组能明显提高大鼠的学习记忆能力(P<0.05),且与对照组无显着差异(P>0.05);高剂量组可提高CHAT阳性表达(P<0.01);中、高剂量组、对照组可显着降低AchE的活性(中剂量组P<0.05,高剂量组P<0.01);低、中、高剂量组均可降低VD大鼠血清TNF-α(均P<0.01)含量,中、高剂量剂量组可降低IL-6含量,差异极显着(P<0.01),对照组无此作用(P>0.05)。结论:复智胶囊和安理申在改善VD患者认知功能方面无显着差异;在改善非认知功能、日常生活能力及中医证候方面,复智胶囊优于安理申。实验研究表明复智胶囊能确切改善VD大鼠的学习记忆能力;可保护胆碱能系统,提高VD大鼠海马CHAT表达;可抑制血清TNF-ɑ与IL-6的过度表达,减轻缺血炎症反应损害。其机制可能为减轻缺血炎性反应对神经元的危害,并上调海马胆碱能系统低水平状态,达到改善学习记忆能力的作用。
参考文献：
[1]. 益气活血中药对大鼠前脑不全缺血再灌注后海马区血管内皮细胞生长因子表达的影响[J]. 沈淑萍, 朱莉萍, 孙佳红, 刘牧. 包头医学院学报. 2004
[2]. 益气活血中药对大鼠前脑不全缺血再灌注后海马区血管内皮细胞生长因子表达的影响[D]. 孙佳红. 山西医科大学. 2003
[3]. 和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠血管新生的影响及机制研究[D]. 魏运湘. 河北医科大学. 2009
[4]. 脑络舒通治疗缺血性中风的作用机制研究[D]. 郑一. 北京中医药大学. 2004
[5]. 基因表达谱权衡清开灵组分配伍治疗脑缺血药效特征分析研究[D]. 张占军. 北京中医药大学. 2005
[6]. 补阳还五汤对Aβ_（1-40）所致AD大鼠β-淀粉样蛋白影响及相关机制的研究[D]. 周忠光. 黑龙江中医药大学. 2007
[7]. 益气补肾中药改善糖尿病脑功能的作用及其机制研究[D]. 刘德山. 山东中医药大学. 2007
[8]. 麝香配伍冰片对缺血再灌注后血脑屏障损伤的影响及机制研究[D]. 赵光峰. 广州中医药大学. 2009
[9]. 补肾益气活血法治疗血管性痴呆的临床观察与实验研究[D]. 郭明冬. 中国中医科学院. 2007
[10]. 复智胶囊对血管性痴呆胆碱能系统及炎性细胞因子的影响[D]. 程传浩. 北京中医药大学. 2007
标签：中药学论文; 内皮细胞论文; 缺血再灌注论文; 细胞生长因子论文; 脑缺血论文; 脑组织论文; 健康论文; 药品论文;