【摘要】 由于蛋白质组学研究的是生命活动直接的执行者——蛋白质，因此更接近生理或病理的本质。用蛋白质组学方法对生理或病理过程进行研究，具有很大的潜力。随着细胞培养方法的建立和成熟，其在基础生物学研究领域中的应用已越来越广泛, 本文将就肝细胞培养在蛋白质组学中的应用作简要概述。
【关键词】 蛋白质组学 肝细胞培养 应用
【中图分类号】R329.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）34-0144-02
蛋白质组和蛋白质组学的概念于1995 年被首次提出，是指在特定时间和条件下，某细胞、组织或者器官内的全部的蛋白质表达[1]。这些蛋白质不仅有直接从基因序列上翻译出的蛋白质，同时也有各类选择性剪切和翻译后修饰的蛋白质。机体蛋白质的种类远高于mRNA的数量[2]。
蛋白质组学研究方法是对蛋白质混合物的一种高通量、大规模的分析，易化了对蛋白间相互作用及蛋白结构的研究。在回答有关生命活动机制的基本问题方面达到空前的规模和速度。由于蛋白质组学研究的是生命活动直接的执行者—蛋白质，因此更接近生理或病理的本质。用蛋白质组学方法对生理或病理过程进行研究，具有很大的潜力。[3]但蛋白质组学毕竟还处在发展分阶段，蛋白质组在提高通量化、低丰度蛋白质的分辩率，及增加质谱分析小量样品的灵敏度上仍需要进一步完善。[4]
目前，很多研究直接采用组织匀浆法以获得大量的蛋白质样品，但组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起，最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在某一类型细胞中的表达情况。随着细胞培养方法的建立和成熟，其在基础生物学研究领域中的应用已越来越广泛。体外培养的细胞株虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性, 但他具有成分单一, 均质性好, 实验条件容易控制等优点。尤其在做对比性研究时可避免由组织细胞成分复杂, 细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠[5]。本文将就肝细胞培养在蛋白质组学中的应用作简要概述。
肝细胞来源及培养
对于肝细胞蛋白质组学的研究，首要步骤是肝细胞的体外培养。体外培养包括原代肝细胞的分离与培养和肝细胞株的培养。
研究用的肝细胞来源包括人的肝细胞、异种肝细胞及所谓永生化肝细胞, 理论上用正常人肝细胞最为理想, 但存在供体短缺的问题, 且体外培养增殖能力较差。人胎肝细胞存在着道德伦理问题。异种肝细胞目前以猪肝细胞应用最为广泛。广义上讲, 肝肿瘤细胞株、基因工程肝细胞及肝干细胞都属于永生化肝细胞, 强大的增殖分化能力使之成为肝细胞主要来源。根据细胞来源于不同，经重复筛选可制备出不同型号的肝细胞株，满足各种实验需要。[6]
原代细胞需经过从器官中分离的过程，存在分离难度大、体外培养要求条件高、存活时间短、增殖及传代困难等问题。多数研究者采用改良的Seglen两步胶原酶灌注法。刘友平等采用肝组织块贴壁法原代培养，即只把组织块剪碎，不用胶原酶消化，直接按肝细胞的培养方法进行贴壁培养，在传代时加胰酶消化，只取上层细胞悬液继续培养。该法简单快捷，无需灌注、离心，所得肝细胞活力高。为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题，Hengstler等研究优化肝细胞冷冻技术。
肝细胞株容易贴壁存活，在相对稳定的培养条件下，传20—30代不会出现明显衰老现象。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆一般的肝细胞培养都要求在肝细胞生存时间跨度内进行。肝细胞培养方法进展迅速，目前可应用肝细胞微载体培养，球形聚集体培养，均可增加培养肝细胞的数量，且功能表达良好。[7]
在蛋白质组学研究中的应用
目前对肝癌发生机制的研究大都是在基因水平, 但是mRNA的水平并不能真正代表所表达的蛋白质水平, 两者之间的相关性通常低于0.5%. 因此, 要求对生物功能的执行者——蛋白质进行研究。目前肝病蛋白质研究领域中比较有前景的是：描绘生理，病理条件下，组织、细胞或亚细胞、蛋白质复合物及体液中蛋白质表达的改变；寻找用于早期诊断的生物标志物及药靶，探索疾病发生发展的机理等[3]。
任何疾病在出现病理变化之前, 细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应改变, 有的可能通过血清中的蛋白质反映出来.发现的这些组织特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值, 更主要的是为研究肝细胞癌变机制提供了一个基础, 而且这些蛋白有可能为肝癌治疗提供新的靶位, 可以进行RNA干扰来阻断其高表达或通过基因导入来促进低表达蛋白的表达。 [5]
有研究针对肝细胞培养，建立肝培养细胞的毒理学实验蛋白组检测系统，对原代培养的鼠肝细胞进行了蛋白组学。实验中发现，通过刮取或平板收集的单层培养细胞的蛋白质在二维电泳上与对原位细胞直接溶解获得的蛋白质存在明显差异。研究者认为培养细胞在刮取时收缩，丢失的蛋白大部分是细胞浆蛋白。这就提示在获取培养细胞的蛋白质方面注意避免过度的破碎，避免出现细胞浆的流失。
随着技术水平的不断提高，原代培养大鼠和人肝细胞已广泛用于药物研究，如探讨药物在肝中的代谢途径和药物药代动力学的研究;评价药物和外源性物质对肝微粒体中细胞色素P450酶诱导作用并探讨其诱导机制。此外，原代肝细胞培养还广泛用于外科临床，其对肝脏疾病的发病机制及其临床应用都有着十分重要的意义。[8]
结束语
培养出高密度、高纯度、高活力的肝细胞，可为进行蛋白质组学研究提供足够量的单一类型细胞。利用蛋白质组学对肝进行的研究进展迅速，已分别从肝整体、细胞、细胞器、细胞器的亚单位等均进行了蛋白组学研究。随着细胞培养技术和蛋白质组学技术的发展，肝功能及其病理研究取得了重大进展。
参考文献
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[6] Bilei , M T Granato , A Ferraresso C , et al . Comparion of pig ,human and rat hepatocytes as a source of liver specific metabolic function in culture systerm 2implication for use in bioartificial liverdeveies [J ] . Int J Artif Organs , 2001 , 24 (6) : 392 - 296.
[7] 张阳德，范立侨，陈伟. 肝细胞体外培养研究进展.中国现代医学杂志 2002;12:1-4.
论文作者:孙月菊, 赵小翠
论文发表刊物:《中外健康文摘》2013年第34期供稿
论文发表时间:2014-1-22
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