严鸣[1]2002年在《Mac-1-FP融合蛋白的构建、表达、鉴定及其在细胞内走向的探讨》文中研究表明Mac-1(CD11b/CD18)为位于白细胞表面的整合素家族粘附分子之一，它是白细胞游走、趋化、吞噬的基础，在机体防御作用及免疫反应过程中起着极为重要的作用。然而，迄今为止，尽管白细胞活化后Mac-1如何参与粘附的研究已相当深入，但关于Mac-1在白细胞脱粘附中的作用及其机制则研究得还很少；对于Mac-1的贮存、转位、变构的过程，尚缺乏在一个细胞对其全过程进行动态定位定量的研究；对不同的激动剂引起的Mac-1的活化过程，还只是一个统一的笼统的模式。为此，本课题拟对Mac-1在细胞内的走向进行研究。以往文献上研究Mac-1的贮存、转位以及内吞的方法，主要采用的是抗体标记Mac-1，用流式细胞术测定或免疫组化技术显微镜下直接观察Mac-1的细胞内分布，但其缺点是不可能在单细胞、活细胞连续地观察，如果要研究在细胞内的走向则还需要使细胞表面通透性增高（permeabilize）,这就难免干扰了细胞的静态及生理过程。我们决定尝试采用绿色荧光蛋白（GFP）标记Mac-1形成融合蛋白的方法，研究其细胞内定位和细胞内的走向。首先，为了更全面更明确地了解Mac-1α、β两个亚基二聚化以及解聚的过程，根据其结构特点并尽可能将荧光蛋白对Mac-1的影响降至最低，我们决定选择发射波长相距最远，即分辨最明显的绿色荧光蛋白（GFP）的突变体蓝色荧光蛋白（BFP）与黄色荧光蛋白（YFP）来分别构建BFP与CD11b C－末端相连接、YFP与 CD18 N－末端相连接的pCD11b-BFP与pYFP-CD18重组质粒；然后，比较U937细胞株，并最终选择了非专职性炎细胞——既无内源性Mac-1的表达同时又具有炎症反应的信号转导系统的CHO细胞株，作为转染pCD11b-BFP与pYFP-CD18的靶细胞；通过荧光显微镜观察到共转染成功后的CHO细胞发出的蓝色荧光和黄色荧光，应用Western Blot方法确定CD11b-BFP与YFP-CD18能够形成二聚体，采用流式细胞术检测确定PMA刺激Mac-1活化后可由胞浆内转位至膜上，测定PMA活<WP=8>化前后转染的CHO细胞与其配基ICAM-1粘附活性的变化等四方面证明转染CHO中的Mac-1-FP构建表达成功并具有野生型Mac-1的功能。炎症介质活化中性粒细胞后可通过由里向外信号传递使位于颗粒和分泌小泡内的Mac-1转位到细胞表面，Mac-1与活化EC表面的ICAM-1结合也由外向里信号传递引起Mac-1的群集，由于这两种不同的信号传导方式的存在，对于其Mac-1的走向可能有所不同。为此，本部分内容包括二方面：（1）以PMA作为炎症介质的代表，观测PMA刺激前后CHO-Mac-1-FP静止以及活化后α链、β链在不同时间变化的动力学过程，了解信号从里向外时CHO-Mac-1-FP在细胞内的走向；（2）以ICAM-1作为Mac-1的配基，观测ICAM-1与CHO-Mac-1-FP结合前后α链、β链在不同时间变化的动力学过程，明确信号从外向里时CHO-Mac-1-FP在细胞内的走向。利用前面构建完成并表达的CD11b-BFP与YFP-CD18融合蛋白在380nm激发下可见蓝色荧光，在514nm激发下发生黄色荧光这一特性，用于研究Mac-1的走向与归宿是比较理想的。但由于目前国内尚无具有紫外光源的共聚焦显微镜，不得不用PE(藻红素)标记的CD11b单抗跟踪CD11b, 用激光共聚焦显微镜，结合免疫组化，必要时在用放线菌酮抑制翻译的条件下，观测CD11b、CD18在PMA刺激和ICAM-1作用后在胞内的走向与归宿，获得以下结果：(1)静息时Mac-1－FP主要位于胞核周围的胞浆中;(2)PMA活化后1小时，在胞膜上可见CD11b-BFP和YFP-CD18群集，2小时后内吞，内吞后CD18的荧光减弱，提示Mac-1有部分降解；24小时PMA再次作用，部分CD11b与CD18可再次出现在膜上，说明Mac-1还可以被循环利用；(3)PMA刺激后Mac-1－FP由胞浆内转位到质膜上然后内吞的这一动态过程，与PMA活化后流式细胞术测得膜上Mac-1－FP以及粘附活性的变化完全符合；(4)ICAM-1包被磁珠与Mac-1-FP-CHO细胞作用后，4小时内粘附增加，同时伴有Mac-1－FP的群集，8小时后粘附减少，同时伴有Mac-1-FP<WP=9>的荧光逐渐减弱，这过程与PMA活化后Mac-1-FP的变化过程类似，提示可能出现内吞并降解。从上述实验结果，可以看到Mac-1活化后的走向是由胞浆内转位到质膜上，然后内吞，内吞后被降解或可被再利用，而与此同时粘附活性亦发生相应的变化，提示内吞是白细胞粘附活性降低的重要机制之一。
胡锋[2]2008年在《稻瘟病菌相关基因CAMK和CHK1的克隆和功能分析》文中研究指明稻瘟病是水稻上重要的病害之一,其病原菌为子囊菌Magnaporthe oryzae。了解M. oryzae的致病机理不仅有利于稻瘟病的防治,而且作为研究植物病原真菌与寄主互作的理想模式系统,对于了解其它真菌的致病机理也有重要意义。致病相关基因的克隆和分析是达到这一目标的有效途径。本文克隆了在稻瘟病菌中致病相关基因CAMK和CHK1,通过基因取代的方法分析了CAMK和CHK1基因在稻瘟病菌致病性及其他相关过程的作用。具体研究结果如下:1.利用稻瘟病菌附着胞cDNA文库,在文库中找到一条MGG-9413和MGG_3729;在稻瘟病菌中找到同源基因,定名为CAMK和CHK1。通过PCR获得了这些基因的cDNA全长,并进行序列分析。2.通过构建CAMK和CHK1基因置换载体和敲除转化,得到Knock-out突变子。通过PCR和Southern杂交分析各鉴定出1个Knock-out突变子,明确CAMK在Guy11菌株中均为单拷贝。3.ΔCAMK突变子的菌落形态与野生型不同,生长速度无明显改变。在N饥饿,C饥饿,高渗(1M NaCl)胁迫条件下的菌落形态、生长速度产、孢能力与野生型比较无明显差异。4.构建PHNCHK1E、PHNECHK1和PHCHK1PE荧光蛋白表达载体,转化至稻瘟病菌原生质体。结果表明:荧光表达很弱。5.ΔCHK1突变子的菌落形态与野生型不同,生长速度和野生型有明显差别,UV照射后的恢复生长速度有明显区别。不产孢子。ΔCHK1突变子对大麦的致病力丧失。
参考文献：
[1]. Mac-1-FP融合蛋白的构建、表达、鉴定及其在细胞内走向的探讨[D]. 严鸣. 第二军医大学. 2002
[2]. 稻瘟病菌相关基因CAMK和CHK1的克隆和功能分析[D]. 胡锋. 新疆农业大学. 2008