凌斌, 陈纲, 祝怀平, 赵卫东, 王群华[1]2004年在《照射后NK-92细胞对人卵巢癌细胞杀伤活性的研究》文中认为目的研究放射线照射后NK92细胞对人卵巢癌细胞杀伤活性及其成瘤性的影响。方法应用医用电子直线加速器对NK92细胞进行照射处理(800cGy),以体外培养的人卵巢癌细胞株HO8910为靶细胞,以细胞株K562作为对照,应用4h51Cr释放法检测不同效靶比情况下体外培养NK92细胞的杀伤活性。建立人卵巢癌SCID鼠肿瘤模型,观察输注经照射后的NK92细胞对荷瘤鼠的治疗效果。结果(1)体外实验NK92细胞未照射组,效靶比较低时(11、51)对HO8910细胞的杀伤率为39%～45%,随效靶比升高,杀伤率上升,101时杀伤率升为59%,201时杀伤率仅上升了6%;对于K562细胞,杀伤率在58%～71%之间。照射后2d,800cGy组NK92细胞对HO8910细胞不同效靶比的杀伤率比0cGy组略有降低,总体杀伤率在33%～58%之间;对于K562细胞,杀伤率在39%～49%之间。照射后NK92细胞数量进行性下降,第5天细胞死亡;(2)动物实验分别在接种后30、40、50d观察治疗组与对照组肿瘤体积,结果显示,分别减小了78%、56%、20%(P<0.01)。结论NK92细胞对人卵巢癌细胞具有较高的杀伤活性,经放射线照射后仍保留一定的杀伤活性,作为一种生物治疗手段治疗卵巢癌行之有效。
祝怀平, 陈纲, 凌斌, 赵卫东, 王群华[2]2004年在《NK-92细胞对人卵巢癌治疗活性的研究》文中提出NK-92细胞是1992年从非霍奇金淋巴瘤患者的外周血淋巴细胞中分离出来并建系成功的一种NK细胞系,具有与人NK细胞相似的表面分子特征和功能特点,可在体外长期培养、大量扩增,并对多种肿瘤细胞具有杀伤活性。NK-92细胞用于肿瘤过继性免疫治疗很有前景。但是,目前国外研究资料多集中于对血液病肿瘤、恶性黑色素瘤等的治疗研究,对于卵巢癌的研究未见报道。因而本研究应用NK-92细胞对卵巢癌细胞系HO-8910
陈纲[3]2004年在《NK-92细胞对人卵巢癌治疗活性的研究》文中研究指明卵巢癌是女性生殖器常见肿瘤之一，严重威胁妇女健康和生命。传统治疗以手术为主，辅以化疗，虽然能改善晚期卵巢癌患者的近期治疗效果，但并未明显提高患者的5年生存率，其治疗依然是临床棘手的问题，因此寻求新的治疗方法具有重要的意义。 随着肿瘤生物学和免疫学等基础学科的发展，以及对肿瘤发生、发展的进一步认识，为卵巢癌进行生物学治疗开辟了一个广阔的领域，其中过继性免疫治疗(adoptive immunotherapy，AIT)备受重视，包括淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells，LAK细胞)和肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocytes，TIL)，在一些肿瘤动物模型和某些肿瘤患者的临床试验中显示有一定效果。但是，由于LAK和TIL细胞均以T细胞为主，T细胞发挥作用必须经过复杂的免疫激活过程，而患者肿瘤细胞多处于免疫逃逸状态，所以疗效欠佳，且治疗过程中需辅以大剂量IL-2，副作用较多，限制了临床上的应用。 自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是先天免疫中的一类十分重要的淋巴细胞，由于无需抗原存在或预先致敏，就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，还可分泌IFN-γ和TNF-α等细胞因子，因此在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥重要的功能。显然，NK细胞可以作为肿瘤AIT的一种选择。但是，由于从肿瘤患者分离的NK细胞存在一些功能缺陷，以及NK细胞难以在体外大量扩增并达到临床所需治疗量，因而不能广泛应用于临床。鉴于上述原因，研究者试图通过建立NK细胞系来克服传统方法的不足，目前的研究结果表明，NK-92细胞系极具潜力且适合用来进行肿瘤AIT。 NK-92细胞是1992年从非霍奇金淋巴瘤患者的外周血淋巴细胞中分离出来并建系成功的一种NK细胞系，具有与人NK细胞相似的表面分子特征和功能特点，安徽医科大学硕士学位论文可在体外长期培养、大量扩增，并对多种肿瘤细胞具有杀伤活性。毋庸置疑，NK一92细胞用于肿瘤AIT是有前景的。但是，目前国外研究资料多集中于对血液病肿瘤、恶性黑色素瘤等的治疗研究，对于卵巢癌的研究未见报道。因而本课题研究NK一92细胞对卵巢癌细胞系HO一8910体外杀伤活性及其对卵巢癌动物模型的治疗效果，为卵巢癌的治疗寻求一种新的治疗方法。 由于NK一92细胞具有永生性，可在体外长期培养，直接输注患者体内有增殖成瘤的潜在危险，因此，对NK一92细胞进行放射线照射，既消除了NK一92细胞增殖成瘤的潜在危险，又在一定时间内保留了杀瘤活性，藉此时期的NK一92细胞治疗肿瘤是避害趋利的方法。目的1.探讨不同剂量放射线照射后NK一92细胞治疗人卵巢癌的安全性。2.探讨合适剂量放射线照射后NK一92细胞治疗人卵巢癌的有效性。方法1.体外实验部分1.1细胞计数法检测照射后NK一92细胞的增殖情况 o、100、200、400、500、1600 cGy放射线照射后NK一92细胞培养于六孔板，每组3复孔，每孔细胞浓度5 x 104/ml，每日细胞计数，连续监测5天。1.2 3H一TdR掺入法检测照射后48hrNK一92细胞的增殖活性 0、100、200、400、800、1600 eGy放射线照射后，调整NK一92细胞浓度，于96孔平底板上每孔加入细胞4xl少/200闪，37℃5%c02孵箱中培养，结束培养前更换培养基为即Ml一2640继续培养Zh;每孔加入3H一TdR 0.5林ei，37℃5%CO:温箱培养4h，用多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，抽气过滤并用蒸馏水充分洗涤;将滤纸烤干后放入闪烁杯中，加入闪烁液，p一液闪仪检测叩m值。1.3台盼蓝拒染法检测照射后24、48、72hrNK一92细胞的活力安徽医科大学硕士学位论文 取0.2%台盼蓝盐溶液与待计数的细胞悬液1:1混合(细胞在染料中停留时间为3一lomin)，取10川含台盼蓝的细胞悬液滴加到细胞计数板的计数室中，至少计数总数500个细胞，分别计数未染色的活细胞数和染为蓝色的死细胞数。按下面的公式计算活细胞密度和细胞活力。 细胞数/ml=4大格活细胞总数/4 x IO4x稀释倍数 细胞活力(%)=活细胞数/(活细胞数十死细胞数)X 100%1.4 FACS检测照射后NK一92细胞凋亡变化 收集照射后(0、200、400、800 cGy)NK一92细胞，用冷pBS洗2次，IXBinding Bu旋r重悬细胞，调整浓度为2 x 2 06/ml;取1 00抖l(l又10，细胞)，加入5协1 Annexin V-FITC，轻轻混匀，常温避光放置15min;1 XBinding Buffer洗涤细胞2次，加入10拼1 pl，轻轻混匀，常温避光放置10min;IXBinding Buffer 400林l重悬细胞，上机检测。1.55‘c:释放法检测NK一92细胞对Ho一8910和K562细胞的体外杀伤活性 应用标准的4hrs‘c:释放法，检测未照射及照射后NK一92细胞对Ho一8910和K562细胞的体外杀伤活性，每次试验要求自然释放组cPm值<25%最大释放组cPm值，按下列公式计算杀伤活性: 实验组cPm值一自然释放组cPm值 细胞杀伤活性(%)=—x10o% 最大释放组cPm值一自然释放组叩m值1.6 FACS检测照射前后NK一92细胞主要表面标志CD56表达情况 收集照射后(0、800 eoy)NK一92细胞，用pBS洗2次，100林1 pBS重悬细胞;加入适量
万兰兰[4]2016年在《TT-1多肽对TT细胞以及联合IFN-α对HepG2细胞的抗肿瘤作用及机制研究》文中研究说明癌症仍是世界上致死率最高的疾病,尽管近年来在癌症的治疗方法上多有研究,但仍无法明显降低癌症患者的死亡率。随着甲状腺癌发病率的不断提高,该类型的癌症成为最为常见的内分泌恶性疾病。据统计,在发达国家和地区每100000个女性中有9.1个人会发生甲状腺癌,每100 000个男性中有2.9个会发生甲状腺癌。传统的甲状腺癌治疗方法为手术切除全部甲状腺组织后再进行放射性碘治疗,化疗以及生化疗法也被应用于治疗晚期甲状腺肿瘤。但对于分化类型较差的甲状腺癌,上述两种治疗方案治疗效果并不理想,在临床应用中受到了极大的限制。因此,亟需为分化较差的甲状腺癌患者开发研究高效低毒的治疗药物和治疗方案。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,是导致肝硬化患者死亡的主要原因。目前临床常用的肝癌治疗方法包括手术切除,肝移植手术以及热消融法和化疗方案,但效果均欠佳。近几年来出现的一种新型治疗方案——生物免疫治疗,具体方案包括:靶向治疗、肿瘤生物疫苗、单克隆抗体或免疫基因治疗等方法,目前这些方案已经在临床试验或者临床前试验中取得了一定的疗效,但是存在许多负面问题和弊端,治疗效果并不是十分理想。在该研究背景下,我们需为甲状腺癌和肝细胞癌的治疗寻找一种更加有效的治疗措施。近期的研究表明,抗菌肽不仅具有很好地抗菌活性,还可以选择性地杀伤肿瘤细胞,杀伤机制是肿瘤细胞表面的膜蛋白由于糖基化反应带有大量的负电荷,可以与阳离子型的两亲性抗菌肽发生特异性结合从而发挥杀伤作用。但抗菌肽对肝细胞癌和甲状腺癌的抗肿瘤效果如何,未见具体的相关报道。在本研究中,我们选取抗菌肽中已证明具有明显抗肿瘤作用的蜂毒肽(Melittin)作为原型,在其基础上利用生物信息学的方法进行改造得到新型多肽TT-1,相较其母肽极大的节约了成本。改造体TT-1不仅保留了Melittin氨基末端区域的活性位点,也增加了疏水性,并降低了净电荷,提高了TT-1的稳定性,降低了毒性。对改造后的多肽TT-1进行体内外试验,试验结果证明该多肽对甲状腺癌中分化类型较差的髓样癌以及肝细胞癌具有良好的抗肿瘤效果,具体实验结果如下:1.TT-1多肽对TT细胞具有显着的体内外抗肿瘤活性(1)细胞水平的实验表明,TT-1多肽能够在细胞水平显着抑制TT细胞的生长,而对于人正常甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori3-1细胞的生长抑制作用较低,即TT-1多肽对甲状腺癌细胞具有选择性抑制作用,并且这种生长抑制作用呈现出一定的剂量依赖和时间依赖关系。应用Annexin V-FITC/PI双染对TT细胞系进行凋亡考察,结果表明多肽TT-1能够有效地诱导TT细胞的凋亡,并且呈现一定的浓度依赖性。在TT-1多肽浓度为2、4、8μg/ml时,TT细胞的凋亡率分别为12.31%、18.62%和31.07%。机制研究显示TT-1多肽能够上调TT细胞内Bax的蛋白表达和mRNA水平,下调Bcl-2的蛋白表达和mRNA水平。此外,我们检测了TT-1多肽作用后TT细胞内Caspase-3和Caspase-9在蛋白和RNA水平的表达量,结果显示TT-1多肽的处理增强了Caspase-3和Caspase-9在蛋白质转录和翻译水平的表达。(2)动物水平实验结果表明,在TT细胞裸鼠皮下移植瘤模型中,对照组的肿瘤体积随时间的延长而增大,而TT-1多肽高中低剂量处理组(0.04 mg/kg体重、0.20 mg/kg体重、1 mg/kg体重)的肿瘤体积与其相比明显较小。并且与对照组相比,TT-1多肽给药组的肿瘤体积和重量呈现出剂量依赖性降低趋势,TT-1多肽(0.04-1 mg/kg体重)叁个剂量组的抑瘤率分别为5.8%,48.6%和56.8%。不同治疗组的荷瘤鼠体重在TT-1多肽治疗过程中无明显变化。HE染色结果显示,与对照组相比,TT-1多肽治疗组裸鼠的肿瘤组织表现出明显的肿瘤细胞数目的减少,同时不论对照组与治疗组裸鼠的肝脏和脾脏均无明显疾病特征。以上结果表明,TT-1多肽能够显着抑制TT细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,体内抗肿瘤活性明显,且毒副作用较低。2.TT-1多肽对HepG2细胞体内外生长抑制作用明显,进一步联合IFN-α时发挥出极大的协同治疗作用(1)TT-1多肽与HepG2细胞共孵育72 h后呈现出对肿瘤细胞的剂量依赖性的生长抑制作用,TT-1多肽对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50)为3.762±0.285μg/ml。当TT-1多肽的孵育浓度达到32μg/ml时,肿瘤细胞HepG2的细胞存活率仅为14.8%。(2)构建HepG2裸鼠异位移植瘤模型,体内实验结果表明:TT-1多肽联合IFN-α抗肿瘤效果较单纯TT-1多肽治疗组显着增强。与对照组相比,TT-1多肽联合IFN-α治疗HepG2裸鼠的效果增强了近80%。机制研究证明TT-1多肽和IFN-α联合治疗的抗肿瘤作用是由NK细胞介导的,并且通过MICA-NKG2D通路特异性介导。综上所述,本论文首创性地研究了新型多肽TT-1对TT细胞以及联合IFN-α对HepG2细胞的抗肿瘤免疫治疗活性。通过体内外实验研究,证实了TT-1多肽对TT细胞具有特异性的杀伤作用,并通过诱导细胞凋亡实现。TT-1多肽对HepG2细胞具有明显的生长抑制作用,并且联合IFN-α对HepG2裸鼠移植瘤模型具有良好的体内抗肿瘤作用,阐述了联合治疗的抗肿瘤免疫治疗机制,表明该作用由NK细胞引起,并由MICA-NKG2D介导,为甲状腺髓样癌和肝癌的治疗策略提供了新的发展方向和发展思路。
陈纲, 凌斌, 祝怀平, 赵卫东, 张红雁[5]2004年在《NK-92细胞对人卵巢癌细胞体外杀伤活性》文中认为目的 研究NK 92细胞对人卵巢癌细胞的体外杀伤活性以及放射线照射后对其杀伤活性的影响。方法 以体外培养人卵巢癌细胞系HO 8910为靶细胞 ,以NK 92的敏感细胞株K5 6 2作为对照 ,应用 4h51Cr释放法检测不同效靶比情况下体外培养NK 92细胞的杀伤活性 ,并应用医用电子直线加速器对NK 92细胞进行照射处理 (0、4 0 0cGy)后再检测其杀伤活性变化。结果 NK 92细胞未照射组 ,效靶比较低时 (1∶1、5∶1)对于HO 8910细胞杀伤率为 39%～4 5 % ,随效靶比升高 ,杀伤率随之上升 ,10∶1时杀伤率显着上升为 5 9% ,2 0∶1时杀伤率仅上升了 6 % ;对于K5 6 2细胞 ,杀伤率为 5 8%～ 71%。照射后 2d ,4 0 0cGy组NK 92细胞对HO 8910细胞不同效靶比的杀伤率与 0cGy组相比有所降低 ,其总体杀伤率为 4 2 %～ 6 2 % ,对K5 6 2细胞杀伤范围在 4 4 %～ 6 1%之间。结论 NK 92细胞对人卵巢癌细胞系HO 8910具有较高的杀伤活性 ,经放射线照射后仍保留一定的杀伤活性。
朱彬[6]2006年在《IL-18联合IL-2诱导的NK92细胞对卵巢癌免疫治疗作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的： 探讨白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)联合白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)诱导自然杀伤细胞系NK92(natural killer cells line NK-92)的体外增殖及诱导后的NK92细胞对人卵巢癌浆液性细胞株(human ovarian serous cancer cell strain，SKOV3)的体外杀伤作用。 方法： 用不同浓度的IL-18(1、10、25、50、100ng／mL)联合低浓度的IL-2(5U／mL)体外诱导刺激NK92细胞，实验分为：IL-2单独刺激组、IL-18单独刺激组、IL-18+IL-2联合刺激组及对照组(未经细胞因子刺激)。甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法检测不同浓度IL-18、IL-2对NK92细胞的促增殖活化作用，筛选最佳刺激浓度。采用流式细胞分析技术(flow cytometry，FCM)检测刺激后NK92的细胞周期变化。乳酸脱氢酶释放法(lactate dehydrogenase releasing method，LDHRM)观察诱导前后、不同效靶比的NK92细胞在不同时相点对卵巢癌细胞SKOV3的体外生长抑制作用。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定NK92细胞杀伤活性最大时，细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ的含量。 结果： 1．NK92细胞经不同浓度IL-18、IL-2作用后增殖出现变化，结果显示，IL-18浓度为25ng／mL诱导24h时，对NK92细胞促增殖作用最佳，OD
程民[7]2010年在《一种新的人NK细胞系的特性及其抗肿瘤效应研究》文中提出自然杀伤细胞(Natural killer cell, NK细胞)作为固有免疫系统的重要成员在机体抗肿瘤免疫中扮演重要的角色。使用NK细胞进行抗肿瘤治疗已引起人们高度的重视,目前已有研究进入了临床实验阶段。基于NK细胞的肿瘤免疫治疗包括内源性NK细胞的诱导活化、同种反应性NK细胞输注、体外扩增的自体或供者NK细胞及NK细胞系的过继转输等。相比较而言,自体或同种异体NK细胞在进行抗瘤治疗时存在一定的局限性,而永生化的人NK细胞系因具有较强的细胞毒作用、体外易扩增培养、且不存在其他细胞污染等优点,可以克服自体或异体NK细胞的局限性,具有很好的临床应用前景。现有可用于肿瘤治疗的NK细胞系(NK-92细胞)由西方国家建立,尽管HLA分子不匹配是NK细胞行驶功能的有益因素,但是由于不同种族间HLA分子的差异很可能在受者体内产生抗HLA的抗体从而抑制免疫治疗的效果,故西方国家建立的NK细胞系可能不适合用于中国肿瘤病人的治疗。因此,建立国人的NK细胞系并将其用于肿瘤治疗尤为重要。另外,肿瘤的诊断及分期对于临床治疗方案的制定至关重要。肺癌作为恶性肿瘤中最常见的死亡原因,严重威胁人类的健康。肺癌的高转移率和复发率严重阻碍肺癌患者生存期的提高,寻找用于循环肿瘤细胞监测的标志物并建立合适的检测方法成为亟需解决的问题。本研究利用流式细胞术对本室已建立的人NK细胞系(NKG细胞)的表型、活化状态及功能分子的表达进行分析；利用3H掺入实验测定不同剂量辐照后NKG细胞的增殖情况；利用51Cr杀伤实验测定NKG细胞的细胞毒活性；建立人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型评价NKG细胞的体内抗肿瘤活性；利用波浪式生物反应器建立NKG细胞大规模培养的工艺流程,建立NKG细胞主细胞库和工作细胞库,并按《药典》叁部(2005年版)的相关要求进行了细胞鉴别试验、无菌试验、外源性因子检测、致瘤性检查及急性毒性试验。另外,应用实时荧光定量PCR的方法检测LunX等多种肿瘤标志物mRNA的水平,分析LunX mRNA与肺癌病理分期及临床治疗效果之间的关系。利用上述方法所取得的研究结果如下：1.NKG细胞表型及功能分子的表达NKG细胞是本研究室863课题组于2003年建立的永生化的人NK细胞株。NKG细胞悬浮生长,成团细胞较多,倍增时间为2-3天。NKG细胞的表型鉴定为CD56+CD 16-CD27- CD3-αβTCR-γδTCR- CD4- CD8- CD 19- CD 161- CD45+。NKG细胞表面表达高水平CD2、CD58、CD11a、CD54、CD11b及CD11c等粘附分子；高表达共刺激分子CD48。NKG细胞表面表达抑制性受体CD94/NKG2A、CD158b和CD85j,同时亦表达高水平NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和NKG2C等活化性受体。另外,与细胞杀伤功能相关的TRAIL、FasL、granzyme B、perforin和IFN-γ等均在NKG细胞中表达。上述结果表明,NKG细胞具有活化性NK细胞的特征。2.NKG细胞的抗肿瘤细胞毒活性及其分子机制NKG细胞对多种肿瘤细胞系均有较强的杀伤活性,尤其是对SGC7901和Ho-8910细胞的杀伤活性>80%(E／T=20／1)。NKG细胞对Ho-8910细胞的杀伤活性明显高于NK-92、NKL及YT细胞。体外抗体阻断及中和实验表明NKG细胞的细胞毒活性主要依赖于NKG2D和NKp30识别机制。当γ辐照剂量达800cGy时,辐照后的NKG细胞失去增殖能力,但在48小时内维持其对肿瘤细胞的杀伤活性。体外实验进一步证明800cGy辐照后的NKG细胞对原代分离的人卵巢癌细胞具有较强的杀伤活性(75%-45%,E／T=20／1)。3.人卵巢癌小鼠模型中NKG细胞的免疫治疗作用利用Ho-8910细胞以腹腔注射的方式接种裸鼠,成功建立人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型。当将800cGy辐照后的NKG细胞与Ho-8910细胞按5：1混合后接种裸鼠,结果显示小鼠成瘤时间由28～44天延迟至90～135天,成瘤率由100%明显降低至50%。NKG细胞治疗组小鼠腹围明显减少,尽管在观察时间内50%小鼠死亡,但其平均生存时间由61.5天明显延长至210.2天。以上结果表明NKG细胞在小鼠体内对人卵巢癌细胞具有明显的杀伤功能。当在Ho-8910细胞接种后第21天,给予800cGy辐照后的NKG细胞进行治疗,结果表明治疗组小鼠成瘤时间由28～38天延后至56～66天,小鼠成瘤率由100%降低至62.5%,成瘤鼠病情进展较缓慢,平均生存时间由64.6天延长至119.6天。当在Ho-8910细胞接种后第35天选择已成瘤小鼠,给予800cGy辐照后的NKG细胞进行治疗,结果表明治疗后小鼠腹围变化较对照组明显减慢,尽管最终治疗组小鼠亦全部死亡,但其平均生存时间由64.2天明显延长至93.6天。上述动物模型的结果表明,辐照后NKG细胞具有明显的治疗卵巢癌的作用。4.NKG细胞大规模培养工艺的建立利用波浪式生物反应器建立NKG细胞大规模连续培养的工艺流程,具体流程如下：接种密度：2.0×104cells／ml；培养基：a-MEM完全培养基(a-MEM液体培养基含10%新生牛血清、10%马血清),添加终浓度为100U／ml的rhIL-2；接种体积：500ml,分别于接种后2、4、6天补加500ml完全培养基及rhIL-2溶液(终浓度为100U／ml)；最大培养体积：<2000ml。培养条件：37℃,5.0%C02,C02流速为0.15L／min,7rpm／7。。按照该工艺流程培养得到的NKG细胞数量、纯度及杀伤活性等均可满足临床治疗的要求。5.NKG细胞急性毒性检测使用高于临床使用剂量150倍的NKG细胞(1×108cells／鼠),经800cGy辐照后通过腹腔注射的方式输入C57BL／6小鼠体内,连续观察7天,叁批小鼠均为未发生毒性反应、过敏反应、局部刺激反应；实验组及对照组小鼠体重增加平稳,小鼠体重及体重增加量两组之间均无显着性差异,说明NKG细胞无急性毒性作用。6.NKG细胞种子库的建立及检定利用本研究建立的NKG细胞大规模培养工艺,建立主细胞库及工作细胞库。对工作细胞库的检定结果表明,NKG细胞的表型与原始库一致,无细菌、真菌及支原体污染,外源性病毒因子检测为阴性,体内外均无致瘤性。7. LunX mRNA在非小细胞肺癌转移早期诊断及疗效评价中的作用利用实时荧光定量RT-PCR方法检测肺癌患者、健康人、肺炎患者及其他肿瘤患者(包括乳腺癌和食道癌)的外周血或胸水样品中LunX、CEA、CK19、VEGF-c、hRNP A2/B1等肿瘤标志物nRNA的水平,结果表明LunX mRNA仅在非小细胞肺癌患者的外周血(75.0%,33／44)及胸水(92.9%,13／14)中有表达,而在健康人、肺炎、其他上皮来源的肿瘤患者外周血及结核性胸膜炎胸水中均无表达,明显优于其他各种标志物,而且外周血中LunX mRNA的水平及其阳性率与肺癌的临床分期成正相关。进一步对非小细胞肺癌患者治疗前后外周血中上述基因mRNA的表达情况进行检测分析,结果表明治疗后患者外周血中LunX、CK19 mRNA水平较治疗前明显降低,治疗前后VEGF-C、CEA、hnRNP A2/B1 mRNA表达水平无明显差异。LunX与CK19 mRNA均可作为疗效评价的指标,但因CK19mRNA在其他肿瘤患者外周血中亦有表达,故LunX mRNA作为肺痛患者治疗效果评价的指标更为灵敏和特异。结论：NKG细胞具有活化的人NK细胞特征,对多种肿瘤细胞具有很强的细胞毒作用。利用人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型证明NKG细胞具有明显的抗肿瘤效应,特别是对晚期肿瘤亦具有明显的治疗效果。NKG细胞的应用将可能成为一种新的肿瘤免疫治疗方法。在此基础上,建立了体外大规模扩增NKG细胞的工艺流程,并建立了合格的主细胞库和工作细胞库,为NKG细胞用于临床的肿瘤治疗奠定了基础。此外,本研究证实检测外周血及胸水中LunX mRNA表达水平将在非小细胞肺癌转移早期诊断及治疗效果评价中具有重要作用。
尹志超[8]2015年在《细胞免疫治疗联合化疗治疗复发性卵巢癌的临床疗效分析》文中提出目的：探讨含有NK、CIK、γδT细胞的细胞免疫治疗联合化疗对复发性卵巢癌患者免疫功能、近期治疗效果、远期治疗效果、生活质量的影响及其安全性。方法：选取2009年9月至2014年8月于吉大一院就诊的初次复发的卵巢癌患者作为研究对象，根据是否接受细胞免疫治疗分为单纯化疗组和在化疗间歇期给予NK、CIK、γδT免疫细胞治疗的联合治疗组。比较两种治疗方法对患者免疫功能、有效率、疾病控制率、无进展生存期、总生存期、生活质量的影响，探讨联合治疗的安全性。结果：1．联合治疗组及单纯化疗组分别有33例和72例治疗规范、信息完整，纳入纳入研究。两组患者临床病理特征各项无统计学差异。中位随访时间16个月。本研究NK、γδT和CIK细胞在诱导前和诱导后的比例分别是10.13%(4.34-16.88%) vs92.32%(63.33-99.54%)，4.93%(1.44-8.21%)vs37.25%(29.3125-58.18%)，4.36%(2.61-11.29%) vs87.53%(62.34-97.98%)。2．多疗程（≥3）细胞免疫治疗后联合治疗组患者外周血CD3-CD56+、CD19+细胞水平明显高于单纯化疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。3.联合治疗组与单纯化疗组总有效率分别为33.3%和34.7%，疾病控制率分别为78.8%和73.6%，两组近期治疗效果差异无统计学意义（P＞0.05）。4.①联合治疗组患者中位PFS2为12.1个月（3.0～49.9个月），单纯化疗组患者中位PFS2为8.0个月（2.8～63.1个月），两组差异有统计学意义（P=0.044）；联合治疗组细胞免疫治疗疗程数≥3患者的PFS2长于单纯化疗组，差异有统计学意义（P=0.034）；②联合治疗组患者中位OS为18.2个月（3.2～63.9个月），单纯化疗组患者中位OS为13.5个月（3.1～63.1个月），两组患者总OS差异有统计学意义（P=0.046）；联合治疗组内细胞免疫治疗≥3疗程患者的OS长于单纯化疗组，差异有统计学意义（P=0.041）。5.治疗后联合治疗组疲倦症状较单纯化疗组改善明显，差异有统计学意义(P=0.04)。6.仅1人出现轻度细胞免疫治疗相关性发热，余不良反应两组差异无统计学差异（P＞0.05）。结论：细胞免疫治疗联合化疗治疗复发进展卵巢癌可改善患者免疫状态，延长生存期，提高生活质量，且是一种安全的治疗方法，其综合治疗效果优于单纯化疗。
马娟[9]2010年在《NK细胞系（NKG细胞）的体外培养及对荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠治疗作用的研究》文中研究说明研究背景:卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤,临床上可出现下腹不适、腹痛、腹部肿块、月经紊乱、压迫等症状,卵巢癌起病多隐匿,早期不易发现,临床上确诊时大多数已为晚期,死亡率很高,严重威胁妇女健康和生命。尽管近年来手术技术的改进及一些新化疗药物的应用,卵巢癌的预后有了较大的改善,但5年存活率仍徘徊在30%左右,因此,寻求新的治疗方法成为当务之急。大量研究表明,细胞免疫在抗肿瘤免疫中起主要作用,过继性免疫治疗备受重视。过继性T细胞治疗是过继性细胞免疫治疗研究的重点,但对MHCI类分子阴性的肿瘤细胞无效,而NK细胞(Natural killer cell,NK细胞)由于表达MHCI类分子的抑制性受体-杀伤细胞抑制性受体(Killer inhibitory receptor,KIR),可以杀灭MHCI类分子阴性的肿瘤,随着对NK细胞研究的深入,目前NK细胞用于肿瘤免疫治疗成为研究热点。本研究所用的免疫细胞是中国科技大学免疫学研究所从非何杰金氏淋巴瘤的病人的外周血分离出来的一种NK细胞系,经检测此细胞具有与人NK细胞相似的表面分子特征和功能特点,对肝癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞具有杀伤活性,命名为NKG细胞。但尚无NKG细胞对卵巢癌细胞的杀伤作用的研究,因此,我们选择卵巢癌细胞作为靶细胞检测NKG细胞对其的杀伤活性,结果表明NKG细胞对卵巢癌的细胞具有较高的杀伤活性,杀伤率高于其它已构建成功的NK细胞系,包括NK-92、NKL及YT细胞。基于卵巢癌治疗现状及寻求新的治疗策略的考虑,安徽省立医院妇产科与科大免疫所共同申报了安徽省重大专项课题并获得批准。NKG细胞具有永生性,体内直接输注有增殖成瘤的危险,我们采用γ放射线对NKG细胞进行照射,抑制其增殖性而又保留了其的杀伤活性。因此,本课题研究内容包括:(1)NKG细胞的体外培养及安全性评价;(2)经不同剂量放射线照射后的NKG细胞的增殖活性、对HO-8910细胞及原代卵巢癌细胞的杀伤活性,并通过构建裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型评价过继转输辐照后的NKG细胞的有效性,从而为NKG细胞用于卵巢癌过继性免疫治疗提供依据。目的探讨NKG细胞体外培养方法、增殖活性、对卵巢癌细胞的杀伤活性及对裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型的治疗作用,为NKG细胞用于晚期卵巢癌的临床治疗提供理论依据。方法①用细胞袋进行NKG细胞大规模培养;②按照肿瘤细胞分离纯化试剂盒的说明书进行原代卵巢癌细胞的分离;③采用γ射线辐照仪在室温下辐照NKG细胞,照射后的细胞分别用于增殖、杀伤及对荷卵巢癌腹水瘤裸鼠治疗作用的研究;④3H-TdR掺入法检测照射后NKG细胞的增殖活性;⑤51Cr释放法检测NKG细胞、NK-92细胞对靶细胞的杀伤活性;⑥将0.2ml含5×105、1×106、2×106、5×106、1×107个的HO-8910细胞悬液,用1ml注射器将上述0.2ml细胞悬液经腹腔注入裸鼠体内,选择构建裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型最佳细胞剂量;⑦在体内,照射后的NKG细胞对HO-8910细胞杀伤活性,将2×106个HO-8910细胞与1×107个800cGy照射后的NKG细胞混匀同时腹腔注入裸鼠体内,每周两次监测体重及腹围、成瘤率、成瘤时间及生存时间;⑧将NKG细胞重悬成浓度为6.67×107/ml的细胞悬液,800cGy辐照,分别过继转输入接种肿瘤细胞后第21和35天的裸鼠腹腔内,评价NKG细胞的有效性。结果①采用细胞袋培养7-10天,NKG细胞浓度可达1.1×106个/ml,细胞状态良好,活率≥90%;②3H-TdR掺入法检测NKG细胞的增殖情况:与未辐照组相比,所有剂量的放射线均可抑制NKG细胞的增殖活性,并随着放射线剂量的增加,NKG的增殖能力逐渐减弱,800cGy辐照后细胞无增殖能力;③51Cr释放法检测NKG细胞杀伤活性:NKG细胞经400cGy和800cGy放射线照射后,对K562细胞的杀伤活性无明显降低,而经1200cGy辐照后NKG细胞的杀伤率为活性明显降低,差异有显着性(P< 0.05),800cGy辐照后的NK-92细胞对HO-8910细胞杀伤率明显低于NKG细胞。辐照后的NKG细胞对原代卵巢癌细胞的平均杀伤率为61.1-15.5%;④裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型的建立:腹腔接种HO-8910细胞数量不同,形成腹水瘤的时间及成瘤率不同,腹腔接种2.0×106肿瘤细胞后25-45天100%的小鼠出现腹水瘤,移植瘤及腹水经我院病理科常规石蜡包埋、H&E染色,其病理组织学形态与人卵巢浆液性囊腺癌相似,肝脏、脾脏及肠组织病理检查可见肿瘤浸润;⑤照射后的NKG细胞过继性转输有效性评价:HO-8910细胞与NKG细胞(1:5)同时注射组成瘤率由100%降到50%,成瘤时间由25-45天延长到90-135天,生存时间由61.5天延长至210.2天;⑥NKG细胞治疗21天成瘤鼠的结果显示,观察140天,未治疗组小鼠已全部死亡,中位生存期64.6天,治疗组仍有40%小鼠存活,中位生存期延长至119.6天;⑦对35天成瘤鼠,NKG细胞在一定程度可抑制肿瘤生长,提高生存率,小鼠生存期由64.2天延长至93.6天。结论800cGy照射后的NKG细胞不具有增殖能力,且最大限度地保留了对卵巢癌细胞的杀伤活性,过继性转输到荷瘤鼠腹腔内,可抑制肿瘤进展,延长生存期。
参考文献：
[1]. 照射后NK-92细胞对人卵巢癌细胞杀伤活性的研究[J]. 凌斌, 陈纲, 祝怀平, 赵卫东, 王群华. 现代妇产科进展. 2004
[2]. NK-92细胞对人卵巢癌治疗活性的研究[C]. 祝怀平, 陈纲, 凌斌, 赵卫东, 王群华. 第八届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集. 2004
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[4]. TT-1多肽对TT细胞以及联合IFN-α对HepG2细胞的抗肿瘤作用及机制研究[D]. 万兰兰. 吉林大学. 2016
[5]. NK-92细胞对人卵巢癌细胞体外杀伤活性[J]. 陈纲, 凌斌, 祝怀平, 赵卫东, 张红雁. 安徽医科大学学报. 2004
[6]. IL-18联合IL-2诱导的NK92细胞对卵巢癌免疫治疗作用的实验研究[D]. 朱彬. 山东大学. 2006
[7]. 一种新的人NK细胞系的特性及其抗肿瘤效应研究[D]. 程民. 中国科学技术大学. 2010
[8]. 细胞免疫治疗联合化疗治疗复发性卵巢癌的临床疗效分析[D]. 尹志超. 吉林大学. 2015
[9]. NK细胞系（NKG细胞）的体外培养及对荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠治疗作用的研究[D]. 马娟. 安徽医科大学. 2010
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