（广东医科大学基础医学院组胚教研室 广东 东莞 523808）
【摘要】目的：探讨宫颈癌C33a细胞和Hela细胞中转录因子RUNX2对促凋亡基因Bim RNA表达的影响。方法：C33a细胞和Hela细胞均分为对照组和过表达RUNX2组，构建RUNX2质粒并转染细胞，实时荧光定量PCR检测细胞RUNX2和Bim的表达情况。结果：与对照组相比，宫颈癌C33a细胞过表达组RUNX2 mRNA上升了41.2%（P＜0.05），而Bim mRNA下降了31.83%（P＜0.05）；宫颈癌Hela细胞过表达组RUNX2 mRNA较对照组上升了61.72%（P＜0.05），Bim mRNA下降了40.01%（P＜0.05），说明成功过表达RUNX2基因，过表达的RUNX2抑制了Bim的mRNA表达。结论：宫颈癌细胞中RUNX2能够抑制Bim的表达，可能藉此途径抑制细胞凋亡促进肿瘤进展。
【关键词】RUNX2；宫颈癌；Bim
【中图分类号】R737.33 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）03-0039-02
Regulation on Bim by RUNX2 in cervical cancer cells
Yang Yuhong, Zhang Xiaoyi, Wang Jianing, Chen Zhuofeng, Li Peng, Wang Sen (Corresponding author)
Histology and Embryology Teaching and Research Section of Basic Medicine,Guangdong Medical University,Dongguan,Guangdong 523808,China
【Abstract】Objective To discuss the regulation on Bim by RUNX2 in two cervical cancer cells C33a and Hela. Methods Control group and over-expressing Runx2 group were established and RUNX2 plasmid was transfected into tumor cells. QPCR was performed to detect mRNA expression of RUNX2 and Bim. Results Compared with that of the control group, Runx2 mRNA of the over-expressing Runx2 group was up regulated by 41.2%(P＜0.05)while Bim was down regulated by 31.83%(P＜0.05) in C33a cells. In Hela cells, Runx2 mRNA of the over-expressed Runx2 group was up regulated by 61.72%(P＜0.05)while Bim was down regulated by 40.01%(P＜0.05).Conclusion RUNX2 could suppress Bim expression in cervical cancer cells and RUNX2 might promote tumor progression by inhibiting cell apoptosis through Bim.
【Key words】RUNX2, Cervical cancer, Bim
1.引言
宫颈癌（Cervical Cancer， CC）是女性常见恶性肿瘤之一，严重危害女性生命健康。目前认为，宫颈癌与HPV感染关系密切，这一过程伴随着长期慢性炎症及其诱发的细胞凋亡的调节异常[1]。Bim是一种重要的凋亡调节蛋白，具有助凋亡活性，同时也具有肿瘤抑制因子的活性，Bim基因的缺失可导致多种肿瘤的发生[2]。本研究拟初步探讨宫颈癌细胞中RUNX2对Bim的调控作用。RUNX2属于Runxx蛋白家族一员，对肿瘤的侵袭能力具有重要的促进作用，RUNX2在宫颈癌、乳腺癌、肝癌的表达量明显增加，其异常表达与细胞转化和肿瘤进展同样密切相关[3]。然而，宫颈癌细胞中RUNX2对Bim的调控情况尚未清楚。因此，本实验初步探讨了RUNX2对Bim表达的影响，为进一步降低CC的转移和复发的治疗提供新的线索。
2.材料和方法
2.1 材料
宫颈癌Hela细胞和C33a细胞由本实验室保存。RUNX2表达载体由本课题组前期构建。细胞转染试剂Hilymax购自同仁化学研究所。逆转录试剂盒、PCR试剂购买自大连Takara 公司。PCR引物委托上海生工合成和测序。实时定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司，PBS粉末剂购自福州迈新生物技术有限公司，DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液购自上海生工。
2.2 实验方法
2.2.1细胞培养及转染 宫颈癌细胞置于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。转染前24h取对数生长期的C33a细胞，经0.25%胰酶消化后显微镜下进行细胞计数，按每孔3×105个细胞的数量铺于6孔板中，设对照组和RUNX2组两组。以3μg 质粒：15μL Hilymax的浓度进行转染。转染后4h换液，继续培养，等待后续实验。
2.2.2总RNA 用TRIzol法提取，合成cDNA进行荧光实时定量PCR反应。Realtime PCR反应体系如下：首先取1μL cDNA作为模板，加入10μL SYBR Green Mix、0.8μL 10μmol/L上游引物、0.8μL 10μmol/L下游引物，7.4μLddH2O，混匀后以20μL体系进行定量PCR反应。引物序列：Runx2-F， 5’-TCTTCACAAATCCTCCCC-3’；Runx2-R，5’-TGGATTAAAAGGACT TGGTG-3’；Bim-F Primers 5’-CAGACAGGAGCCCAGCACC-3'，Bim-R Primers 5’-TCCAATACGCCGCAACTCTT-3'.反应条件为95℃预变性10min；95℃变性15s、58℃退火30s、60℃延伸1min共40个循环。
2.3 统计学分析
运用SPSS19.0软件分析实验结果，使用两独立样本t检验（双侧）进行组间比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。
3.结果
3.1 C33a细胞过表达RUNX2下调了Bim的mRNA表达
将过表达RUNX2质粒转染宫颈癌C33a细胞后48h，提取总RNA，进行 qPCR实验检测RUNX2和Bim基因的表达。结果显示：与对照组相比，过表达组RUNX2 mRNA上升约41.2%（P＜0.05），表明C33a细胞成功转染了RUNX2基因。与对照组相比，BimmRNA降低约31.83%（P＜0.05），提示C33a细胞中RUNX2可以下调Bim基因mRNA的表达，见图1。
3.2 Hela细胞过表达RUNX2下调了Bim的mRNA表达
结果显示，与对照组相比，过表达组RUNX2 mRNA上升约61.72%（P＜0.05），表明Hela细胞成功转染了RUNX2基因。而Bim mRNA降低约40.01%（P＜0.05），提示RUNX2可以下调Bim基因mRNA的表达，见图2。
4.讨论
Runx2属于Runxx蛋白家族一员，由α和β亚单位组成的异二聚体构成，定位于人染色体6p12.3-p21.1。Runx2同时也是多瘤病毒增强子结合蛋白2/核心结合因子转录因子家族中的一员，在癌细胞中RUNX2可调节与肿瘤转移的相关标志蛋白表达[4]。研究证实，在宫颈鳞癌组织中，RUNX2蛋白的阳性表达率高于正常宫颈黏膜组织；且癌组织临床分期越高，其阳性表达率越高。另外，在宫颈高级别鳞状上皮内病变（HSIL）组织中，RUNX2也高表达，但低于宫颈鳞癌组织[5]。可见，RUNX2蛋白高表达与宫颈鳞癌的发生发展密切相关。
Bim是Bcl-2促凋亡蛋白家族成员之一，Bim基因作为抑癌基因，其沉默可导致肿瘤细胞凋亡通路的失敏，促使多种肿瘤的发生[6]。在目前研究中，通过免疫组化可评估在宫颈癌中BIM表达的相关性和预后意义。与正常子宫颈和低宫颈上皮内瘤（CIN）相比，在高CIN和宫颈癌中BIM高度表达[7]。可见，高Bim表达是宫颈癌潜在的预后标志物以及化学治疗靶标。
为了解Runx2对Bim的调控作用，我们应用qPCR技术检测过表达Runx2的宫颈癌C33a细胞和Hela细胞Bim的mRNA表达。结果显示较之于对照组，本实验中的宫颈癌C33a细胞和Hela细胞成功转染了Runx2基因；过表达Runx2下调了Bim的mRNA表达。宫颈癌细胞中RUNX2能够抑制Bim的表达，可能藉此途径抑制细胞凋亡促进肿瘤进展。
综上所述，本研究发现，宫颈癌细胞中过表达RUNX2抑制了Bim的表达，为将来进一步深入研究打下基础，也为宫颈癌防治提供潜在治疗靶点。
图1
图2
【参考文献】
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[3]李悦,宫萍,王燕,郑咏之,贾美君,黄文祺,徐燕,姚成增.Runx2基因调控致病的研究进展[J].医学综述,2018,24(11):2081-2086.
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[5]张威,郭文涛,曾宪旭,班振英. RUNX2在宫颈鳞癌组织中的表达及其siRNA对Hela229细胞RUNX2表达及细胞增殖与凋亡的影响[J].郑州大学学报(医学版),2017,52(06):718-722.
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[7] Kim BW, Cho H, Ylaya K, et al. Bcl-2-like Protein 11 (BIM) Expression Is Associated with Favorable Prognosis for Patients with Cervical Cancer. Anticancer Res, 2017, 37(9):4873-4879.
论文作者:杨煜鸿,张晓怡,王佳宁,陈卓峰,郭燕娴,许忆恩,
论文发表刊物:《医药前沿》2019年3期
论文发表时间:2019/3/27
标签：细胞论文; 宫颈癌论文; 转染论文; 宫颈论文; 基因论文; 癌细胞论文; 肿瘤论文; 《医药前沿》2019年3期论文;