梁光军[1]2004年在《应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中产气荚膜梭菌及肠毒素阳性产气荚膜梭菌的基因型鉴定》文中认为产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病的病原体，广泛存在于环境中的土壤、水源、人和动物肠道中。根据产气荚膜梭菌产生的四种主要致死性毒素(α、β、ε、τ毒素)可将产气荚膜梭菌分为五种类型，即A、B、C、D、E型。产气荚膜梭菌的经典分类方法，通常采用动物中和试验，该方法操作繁琐、费时，而且有的结果不准确。文其乙等成功建立了一种快速基因分型的多重PCR方法。该方法可以在一个PCR反应中，同时扩增出四种主要毒素的基因片段，根据各种毒素基因的PCR产物来判定产气荚膜梭菌的菌型。ε毒素PCR产物为665bp，τ毒素PCR产物为446bp，α毒素的PCR产物为324bp，β毒素的PCR产物为196bp。另根据最新发现的另二种重要致病性毒素——肠毒素(Enterotoxin，CPE)和β_2毒素——基因的序列设计了引物，与以上四种分型毒素基因PCR引物相结合，构建改良的分型PCR方法。从多重PCR反应得到了CPE的PCR产物为233bp，β_2毒素PCR产物为567bp。该法除了正确分型之外，还可评价产气荚膜梭菌的致病性。该方法操作简便、快速、不需要高值仪器。经动物中和试验验证，其结果与多重PCR方法测试的结果完全一致。 本研究首先采集346份粪便样品，按常规方法分离产气荚膜梭菌，再用生化反应试验和多重PCR方法鉴定了分离的产气荚膜梭菌。分离与鉴定出了69株产气荚膜梭菌，分离率达到19.9％，而且均为A型产气荚膜梭菌，其中带β_2毒素的A型产气荚膜梭菌为33株，占总分离菌的47.8％；没有从粪便样品中分离到CPE阳性产气荚膜梭菌，也没有检测到B、C、D、E型产气荚膜梭菌。 本研究又从275份食品样品中分离到97株产气荚膜梭菌，检出率为35.3％，其中以鲜虾、鲜鱼、鲜猪肉中的带菌率最高，分别达到89.3％、44.4％和37.9％。所有分离到的产气荚膜菌均为A型，未发现其它型的产气荚膜梭菌。携带β_2毒素的产气荚膜梭菌共20株，占总分离菌数的14％。另从熟猪肉制品和熟鱼制品中共检出了2株CPE阳性A型产气荚膜梭菌，检出率为2.1％。 本研究再根据cpe高度保守的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)设计引扬州大学硕士学位论文物，以cPE阳性产气荚膜梭菌分离株为模板，扩增出960bP的cPeo盯;通过测序，与CPE阳性产气荚膜梭菌标准株比较，发现产气荚膜梭菌分离株的96Obp的cP。的oRF基因序列没有任何碱基突变，进一步证实了cP。的ORF高度保守性。大约5%的产气荚膜梭菌携带了肠毒素基因(Enterotoxin gene，cPe)，最新的研究发现cP。既可位于产气英膜梭菌的质粒上也可以位于染色体上。当cP。位于细菌的染色体上时，该种CPE阳性的A型产气荚膜梭菌可引起人的食物中毒;而当cP。位于细菌的质粒上时，引起人的抗生素相关腹泻和散发性腹泻等人的非食源性胃肠疾病及动物胃肠疾病。最新的研究成果揭示了cPe一15147口一like型质粒cP。、cPe一151了列型质粒cP。和染色体cP。下游基因序列组成不一样，再结合高度保守的cP。的oRF，因此分别合成了四对引物，分别建立叁种双重PCR方法，来鉴别两种不同类型的质粒CPE阳性的产气荚膜梭菌和染色体 CPE阳性的产气英膜梭菌。在这个多重PCR方法的基础上，组合成一个多重PCR反应体系，进行一次PCR反应就可以鉴定CPE阳性A型产气荚膜梭菌的cP。的位置。在这个多重PCR反应中，CPE产气英膜梭菌均扩增出0.6kb的cPe0RF内部序列，和O.SKb的cPe一151了刀型质粒cP。条带或1.6Kb的cPe一470一ll’ke型质粒cP。条带或1.3Kb的特异的染色体cP。条带。 利用该多重PCR方法检测4株CPE阳性A型产气荚膜梭菌标准株和两株CPE阳性A型产气英膜梭菌分离株，其中2株致人食物中毒的CPE阳性产气荚膜梭菌标准株都检出了染色体型cP。，而另外1株致人非食源性胃肠疾病标准株检测到cPe一151470一like型质粒cP。和1株致人抗生素相关性腹泻标准株检测到cPe一Isjl习型质粒cP。。因此该多重PCR方法可以快速区别引起人的胃肠疾病不同类型的CPE阳性A型产气荚膜梭菌。经本多重PCR反应鉴定证实分离到的两株CPE阳性A型产气荚膜梭菌均为染色体CPE阳性A型产气荚膜梭菌。 综上所述，本研究应用的产气荚膜梭菌的多重PCR基因分型方法是一种简便、快速、准确的基因分型方法，可以避免采用动物毒素中和试验。并对采自粪便中和食品中的产气英膜梭菌进行分离与鉴定，初步摸清了我国的粪便中和食品中的产气荚膜梭菌的类型。并在食品中发现了导致人食物中毒的CPE阳性A型产气荚膜梭菌，为分子流行病学研究提供了重要理论依据。此外本研究建立另一个多重PCR方法快速区分了携带染色体cP。和质粒cP。的产气荚膜梭菌，并证实了本次实验分离到的两株CPE阳性产气荚膜梭菌分离株是染色体CPE阳性的产气英膜梭菌。
梁光军, 赵李祥, 杨旭芹, 贾红, 张小荣[2]2005年在《应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中分离的产气荚膜梭菌》文中提出目的用国标方法和多重PCR方法检测粪样和食品中产气荚膜梭菌分离株。方法采集粪样和食品样品按照国标方法进行分离鉴定,再应用多重PCR方法进行基因型鉴定。结果346份粪便样品分离与鉴定出了69株产气荚膜梭菌,275份食品样品分离到97株产气荚膜梭菌。经过生化试验鉴定和多重PCR方法鉴定,证实均为A型产气荚膜梭菌,携带β2毒素的产气荚膜梭菌共为53株,另检出了2株肠毒素阳性A型产气荚膜梭菌。结论初步摸清了我国的粪便中和食品中的产气荚膜梭菌的动态分布。并在食品中发现了导致人食物中毒的肠毒素阳性A型产气荚膜梭菌,为分子流行病学研究提供了重要理论依据。
参考文献：
[1]. 应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中产气荚膜梭菌及肠毒素阳性产气荚膜梭菌的基因型鉴定[D]. 梁光军. 扬州大学. 2004
[2]. 应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中分离的产气荚膜梭菌[J]. 梁光军, 赵李祥, 杨旭芹, 贾红, 张小荣. 中国人兽共患病杂志. 2005