张锦文 谢靖威 郭素
（广州市从化区食品药品检验所 广东 广州 510900）
【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）20-0375-03
1.研究背景
对乙酰氨基酚，化学名为4-羟基乙酰苯胺，英文名为4-Acetamidophenol,CAS No.103-90-2,分子式为C8H9NO2。化学结构为：
有解热镇痛作用，是最常见的非抗炎解热镇痛药，是乙酰苯胺类药物中最好的品种。特别适用于不能应用羧酸类药物的病人。被广泛用于感冒发烧、关节痛、神经痛、及手术后止痛等，不良反应较少。偶见皮疹、荨麻疹、药热、血小板减少症及白细胞减少症（如粒细胞减少）。长期大量用药会导致肝肾功能异常。剂量过大可引起肝脏损害，严重可致昏迷甚至死亡。
最近，有文献和新闻报道，某些中药制剂和保健食品中有人非法添加对乙酰氨基酚以增强其药效[1,2,3]。如果消费者购买服用该类产品，极有可能摄取过量的对乙酰氨基酚导致产生不良反应。对此类非法添加行为，应予严厉打击。国家食品药品监督管理局曾发布药品检验补充检验方法和检验项目批准件（批准件编号：2009025）对抗风湿类中成药非法添加对乙酰氨基酚进行检验。
目前有人使用高效液相色谱、质谱对非法添加对乙酰氨基酚进行检验[1,2]，也有人尝试使用薄层色谱对非法添加对乙酰氨基酚进行快检[3]，但尚无非法添加对乙酰氨基酚化学鉴别快速检测方法的报道。
2.文献调研
目前常用的快检方法主要是近红外、拉曼光谱、车载液相、等手段。目前常用的非法添加化学成分理化检验快速筛查的方法具有类似的实施步骤：提取样品中的目标化学成分。消除基质干扰，加入检测剂，产生沉淀或显色反应，阳性结果为添加，阴性结果为未添加。
《中国药典》2015年版二部[4]中，对乙酰氨基酚化学鉴别：（1）本品的水溶液加三氯化铁试液，即显蓝紫色。（2）取本品约0.1g，加稀盐酸5ml，置水浴中加热40分钟，放冷；取0.5ml，滴加亚硝酸钠试液5滴，摇匀，用水3ml稀释后，加碱性β-萘酚试液2ml，振摇，即显红色。对乙酰氨基酚片鉴别：（1）取本品的细粉适量（约相当于对乙酰氨基酚0.5g），用乙醇20ml分次研磨使对乙酰氨基酚溶解，滤过，合并滤液，蒸干，残渣照对乙酰氨基酚项下的鉴别（1）、（2）项试验，显相同的反应。
对乙酰氨基酚鉴别（1）的原理[5]为对乙酰氨基酚中的结构中有酚羟基，遇三氯化铁试液产生蓝紫色络合物。鉴别（2）的原理为对乙酰氨基酚在酸性介质中水解后生成对氨基酚，滴加亚硝酸钠试液，生成重氮盐，再加碱性B-萘芬试液，生成红色偶氮化合物。《药品快速检测技术研究与应用》化药卷[6]一书中也使用对乙酰氨基酚与三氯化铁的显色反应来鉴别对乙酰氨基酚类药品。
3.快检方法设计与优化
3.1 提取剂的选择
对乙酰氨基酚在热水或乙醇中易溶，在丙酮中溶解，在水中略溶。参考《药品快速检测技术研究与应用》一书，对于胶囊、片剂、颗粒剂等固体制剂，使用氯仿：甲醇：丙酮（9:2:1）作为提取溶剂，取上清液，使用0.45um微孔滤头过滤滴加检测剂，液体制剂如澄清，不用另加提取剂，直接滴加检测剂即可。如浑浊或颜色过深，可过滤或适当稀释后滴加检测剂。膏体糖分高，粘稠，直接加入检测剂效果不好（有待实验验证），加入氯仿：甲醇：丙酮（9:2:1）振摇提取后静置片刻，可分层，取上层（即氯仿：甲醇：丙酮（9:2:1）作为供试液即可。
3.2 检测剂的选择
对乙酰氨基酚结构简单，官能团少，本次文献调研没有查阅到可借鉴的沉淀反应，因此只能采用显色反应。《中国药典》2015年版二部对乙酰氨基酚鉴别（2）需要在水浴中加热40分钟，快检车难以提供必要的水浴设备，不适用于快检。鉴别（1）反应简单，专属性强，比较适合。因此，选用9%三氯化铁水溶液作为检测剂。
4.拟定的快检方法
液体制剂（露、糖浆、溶液等）：取液体制剂样品约1ml置试管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9:2:1）1～2ml,充分振摇后静置分层，吸取适量溶剂层液体，滴加9%三氯化铁水溶液，如有蓝色、蓝黑色或黑色等颜色产生，则为可疑样品；如无明显变色或变为其他颜色，则为阴性结果。对于比较澄清的液体，可直接滴加9%三氯化铁水溶液检测。
固体制剂（胶囊、片、丸、颗粒等）：胶囊取1粒内容物，片剂取1片，丸剂取2丸，颗粒剂取约1克，研磨均匀：置10ml具塞比色管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9:2:1）1～2ml，强力振摇混匀，静置，取上清液滤过，取续滤液置试管中，滴加9%三氯化铁水溶液，如有蓝色、蓝黑色或黑色等颜色产生，则为可疑样品；如无明显变色或变为其他颜色，则为阴性结果。
膏体：取膏剂药品约1克置试管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9:2:1）1～2ml，充分振摇后静置分层，吸取适量溶剂层液体，滴加9%三氯化铁水溶液，如有蓝色、蓝黑色或黑色等颜色产生，则为可疑样品；如无明显变色或变为其他颜色，则为阴性结果。
5.快检方法验证
项目组在零售药店收集31批不同厂家的抗风湿类中成药：（1.强力天麻杜仲胶囊，2.风湿安泰片①，3.骨松宝胶囊，4.复方风湿宁片,5.壮骨关节丸，6.骨仙片，7.腰痛宁胶囊，8.盘龙七片，9.正清风痛宁片，10.云南红药胶囊，11.万通筋骨片，12.小活络丸，13.复方夏天无片，14.独一味胶囊，15.追风透骨丸，16.天麻片，17.金乌骨通胶囊，18舒筋丸,19.抗骨增生片，20.舒筋活血片，21.伸筋丹胶囊，22.腰息痛胶囊，23. 腰痛片，24.强力天麻杜仲丸，25.风湿安泰片②，26.汉桃叶片，27.抗骨质增生丸，28.独一味颗粒，29.风痛片，30.骨盘丸胶囊，31.维C银翘片）。
采用液质联用（LC-QTOF）确证样品是否存在非法添加。由于收集到的含有对乙酰氨基酚的样品较少，对于未添加对乙酰氨基酚而且快检成阴性的样品，采用了添加约20mg对乙酰氨基酚对照品的方法模拟非法添加。添加时使用研磨、超声等方法使对照品和样品混合均匀。
液质联用验证方法
对于样品是否存在非法添加，使用液质联用检验（LC-QTOF）作为最终确证方法，实验条件如下：
色谱条件：Agilent1200RRLC高效液相
色谱柱： Agilent ZORBAX EclipsePlus,C18,最高耐受600bar，3.0*100mm
填料粒径：1.8um Serial Number:USWHH01323
柱温：45℃ 流动性：水相：5mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸 有机相：甲醇
梯度洗脱条件：如下表。
质谱条件：
Agilent四极杆串联飞行时间质谱（QTOF6538），ESI源，干燥气温度；320℃，干燥气流速：10L/min，雾化器压力：40psi，fragmentor:135V,VCap:4000,参比雾化器压力：5 psi，选用121和922作为参比离子实时校正。选用Targeted ms/ms模式，采用碎片离子和保留时间作为定向依据。
对照品溶液的制备：取对乙酰氨基酚对照品约10mg，置100ml量瓶中，紧密称定，加纯水溶解并定容至刻度，摇匀，得到每1ml含对乙酰氨基酚约100ug的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品胶囊5粒内容物混匀，取约1粒内容物重量（膏、露、口服溶液、糖浆、颗粒制剂取约1g，片剂取1片，丸剂取3丸），置100ml量瓶中，精密称定，加水适量，超声10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各3ul，依次注入液相色谱仪，记录质谱总离子流（TIC），一级质谱按质核比提取对乙酰氨基酚准分子离子的离子流（EIC），二级质谱选用Targated ms/ms模式，采用碎片离子和保留时间作为定性依据。
6.结果分析
31批样品中，22,31共2批样品标示含有对乙酰氨基酚，快检结果显阳性。10、23样品未标示含有对乙酰氨基酚，液质结果未检出对乙酰氨基酚，快检呈阳性。其余27批样品液质结果未添加对乙酰氨基酚，快检成阴性，添加对乙酰氨基酚对照品后，快检结果均呈阳性。
以上结果表明（1）对于添加了对乙酰氨基酚的样品（包括添加对乙酰氨基酚对照品的样品），该快检方法均能检验未阳性，阳性检出率为100%，假阴性为0%。（2）对于未添加对乙酰氨基酚的样品，有10、23二批被快检为阳性，其余27批均被检出为阴性，真阴性率为93.1%，假阳性率为6.9%。
检测灵敏度：取浓度约为100ug/ml的对乙酰氨基酚水溶液约1ml，滴加9%三氯化铁水溶液，结果上层液有蓝色产生，表明对于对乙酰氨基酚，该方法的检测灵敏度可达到0.1mg。
【参考文献】
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[2]吴小红，李焕德，吴高芬,等.HPLC-DAD法同时测定部分中成药及保健食品中添加的9种解热镇痛药物[J].药物分析杂志,2010,30（10）1865-1868.
[3]张鹤，黄子桐，朱禹彭,等.关于抗风湿类中药制剂中非法添加化学药品 的检测方法研究[J].亚太传统医药,2010,6（6）:31-32.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版二部，中国医药科技出版社，2015:234-235.
[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典1990年版二部药典注释，化学工业出版社，1990:182-184.
[6]边振甲，李云龙，金少鸿,等.药品快速检测技术研究与应用化药卷[M].化学工业出版社，2013:1061-1070.
作者简介：张锦文（1980.7-），男，广东揭西，大学本科，主管中药师，主要研究方向：质量标准；谢靖威（1977.12-），男，广东从化，大学本科，主管药师，主要研究方向：质量标准；郭素（1981.7-），男，广东潮州，大学本科，药师，主要研究方向：质量标准.
论文作者:张锦文,谢靖威,郭素
论文发表刊物:《医药前沿》2018年7月第20期
论文发表时间:2018/7/31
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