广西中医药大学第一附属医院病理科 南宁市 530023
摘要：目的：探讨结直肠癌BRCA1、EGFR的蛋白表达与细胞增殖及凋亡的关系。方法：收集80例结直肠癌，采用免疫组化检测BRCA1、EGFR蛋白的表达及Ki67阳性指数；TUNEL（原位末端标记法）检测结直肠癌细胞凋亡指数。结果：结直肠癌细胞凋亡指数于BRCA1蛋白阳性组显著高于阴性组（P<0.001），细胞增殖指数显著低于阴性组（P<0.001）；结直肠癌细胞凋亡指数于EGFR蛋白阳性组显著低于阴性组（P<0.001），增殖指数显著高于阴性组（P<0.001）。结论：BRCA1、EGFR蛋白表达缺失可能通过影响肿瘤细胞凋亡及增殖，促进结直肠癌的发生发展。
关键词：BRCA1；EGFR；结直肠癌；增殖；凋亡
乳腺癌易感基因1（BRCA1）是一种直接与遗传性乳腺癌有关的基因，能够抑制恶性肿瘤的发生，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用[1]；表皮生长因子受体（EGFR）广泛表达于间质、上皮及神经等组织，其作用包括调节细胞分化、分裂、生长和组织修复等。有研究表明BRCA1、EGFR蛋白表达与肿瘤分化程度、Duke’s分期和淋巴结转移有关[2]，而结直肠癌组织中BRCA1、EGFR蛋白表达与癌细胞增殖和凋亡之间的关系尚未见报道。本课题通过免疫组化方法检测在BRCA1、EGFR在结直肠组织中的表达情况，按阴、阳性分组，分别检测各组Ki-67指数及细胞凋亡指数，分析它们在结直肠癌发生、发展过程中的作用，并提示临床预后及指导治疗。
1 研究材料
1.1 标本
广西中医一附院病理科2011年5月到2014年6月常规送检的直肠腺癌病理标本80例，其中男性53例，女性27例，年龄21-80岁。
1.2 试剂
免疫组织化学二步法试剂盒为上海长岛生物技术公司产品；BRCA1、EGFR、Ki-67均为小鼠抗人单克隆抗体，为福州迈新生物技术公司产品；细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒为德国罗氏（Roche）公司产品。
2 研究方法
2.1 免疫组化检测
采用二步法免疫组化染色，阳性对照为已知肺癌阳性切片，空白对照用PBS代替一抗。阳性标准：细胞内出现棕黄色颗粒，BRCA1蛋白（图1）和Ki67（图2）阳性定位于细胞核，EGFR蛋白（图3）阳性定位于细胞浆。细胞增殖指数（PI）是肿瘤细胞中Ki67阳性细胞的比例，其计算方法为随机选取10个高倍视野（×400）），分别计算阳性细胞比例，取其平均值[3]。BRCA1蛋白和EGFR蛋白染色结果分4个等级，计数10个高倍视野（×400）内1000个细胞，根据阳性细胞比例确定阳性程度。判断标准：阴性（阳性细胞<10%），弱阳性（10%-25%），阳性（26%-50%），强阳性（>50%）。
2.2 细胞凋亡检测
按照TUNEL说明书进行染色，阳性标准：细胞核内呈现棕黄色（图4），参考已有文献[4]标准判断染色结果。细胞凋亡指数（AI）是肿瘤细胞中凋亡细胞的比例，其计算方法为随机选取5个高倍镜视野（×400），分别计算阳性细胞比例，取其平均值。
2.3 数据分析
应用统计软件SPSS 13.0，组间样本均数比较采用t检验，当P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 BRCA1蛋白阳性组的细胞增殖指数显著低于阴性组（P<0.01）（表1），EGFR蛋白阳性组的细胞增殖指数显著高于阴性组（P<0.01）（表2）：
表1 结直肠癌BRCA1蛋白阳性组与阴性组增殖指数的比较（n=80）
4 讨论
结直肠癌是多基因、多阶段、多途径发生发展的结果，癌基因的激活和抑癌基因的失活导致肿瘤细胞增殖和凋亡失去平衡，是肿瘤持续生长的重要因素[5]。BRCA1是Miki在Hall等研究的基础上通过遗传连锁分析发现的，因此基因与遗传性乳腺癌有关而命名。BRCA1基因定位于17q21，约81kb，含有高达41.5%的Alu重复序列和4.8%的其它重复序列，含有23个外显子。BRCA1编码蛋白的N末端序列含有一环状结构域（ringdomain），能够与BRCA1相关环状蛋白（BARD1）组成环2环异二聚体[6]。BRCA1在多个重要通路发挥肿瘤抑制作用，维护基因组稳定性，其作用有转录调控、DNA损伤修复、细胞凋亡及细胞周期调控等，如果BRCA1基因结构发生改变，那么它抑制肿瘤发生的功能将会受影响。
有研究显示BRCA1蛋白的表达在正常结直肠粘膜、腺瘤、结直肠癌中逐渐下降，验证了在结直肠癌中存在BRCA1基因缺失；且肿瘤分化越差、Duke’s分期越低及有淋巴结转移者，BRCA1的缺失越显著，提示它的表达缺失可能导致抑癌功能失活，促进肿瘤的生长和发展[7]。本文研究结果显示，随着BRCA1蛋白阳性程度越强，癌细胞增殖指数越低，凋亡指数则越高，阳性组和阴性组之间差异具有显著性（P<0.001），表明BRCA1作为一种抑癌基因，其存在可能抑制了肿瘤细胞的增殖，而促进了凋亡。
EGFR是一种跨膜糖蛋白，由原癌基因C-erbB-1编码，相对分子量为170KD，定位于第7号染色体短臂，其分子N末端可结合表皮生长因子（EGF），暴露于细胞膜外。通过不同形式的可变剪切产生多种特殊受体蛋白，从而在影响多种细胞信号转导途径。丝裂源活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酞肌醇-3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）是EGFR蛋白活化的两条主要信号通路，还有非经典的JAK-STAT信号通路等。外来配体通过与EGFR结合使其磷酸化，产生二聚体使下游信号转导通路激活，如MAPK和PI3K等通路，产生生物学效应。EGFR蛋白广泛表达于间质、上皮及神经等组织，其作用包括调节细胞分化、分裂、生长和组织修复等，EGFR的异常与多种肿瘤有关。多种恶性肿瘤中存在EGFR过度表达或突变，如肝癌、胃癌、乳腺癌、头颈部鳞癌。高表达的EGFR通过对肿瘤细胞多个方面的调控促进肿瘤的进展，包括血管生成、细胞增殖、黏附、侵袭、转移及抑制凋亡等。有研究结果显示，结直肠癌分化程度越低、临床病理分期越晚、及有淋巴结转移者，EGFR蛋白的表达的阳性率越高，提示EGFR表达升高与结直肠癌发生、进展有关，可以有效反映结直肠癌生物学行为[3]。本文研究结果显示，随着EGFR蛋白阳性程度越强，癌细胞增殖指数越高，凋亡指数则越低，阳性组和阴性组之间差异具有显著性（P<0.001），表明EGFR作为一种原癌基因，其表达增强可能通过促进细胞的增殖、抑制凋亡导致肿瘤的发生、发展。
综上所述，抑癌基因BRCA1可能具有抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡的功能，其表达低下或缺失可能促进直肠癌的发生、发展；而原癌基因可能具有促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡的功能，其高表达可能促进直肠癌的发生、发展。因此，检测结直肠癌组织中BRCA1和EGFR的表达可以有效提示患者的预后。在结直肠癌治疗过程中，提高BRCA1蛋白的表达或使其再表达，降低EGFR蛋白的表达可以抑制癌细胞增殖、诱导凋亡，具有一定的临床意义。
参考文献：
[1]Miki Y，Swensen J，Shattuck-Eidens D，et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1[J]. Science，1994，266（5182）：66-71.
[2]黄羽，黄克强. 结直肠癌组织乳腺癌易感基因1与表皮生长因子受体的蛋白表达及其临床意义[J]. 广西医学，2017，1（39）：35-38.
[3]Yasuhiro Ito eatl，Prognostic Significance of ki-67 Labeling Index in Papillarry Thyroid Carcinoma.World J Surg（2010）：3015-21.
[4]韩静绮. ERCCI与BRCA1在非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达及临床意义[J]. 中国现代医药杂志，2009，11（1）：24-25.
[5]West H L，Franklin W A，Mccoy J，et al. Gefitinib therapy in advanced bronchioloalveolar carcinoma：Southwest Oncology Group Study S0126[J]. J Clin Oncol，2006，24（12）：1807-13.
[6]沈洁，谢觉醒，张卫中，等. 散发性肝细胞性肝癌BRCA1基因D17S855位点的遗传不稳定性研究[J]. 解放军医学杂志，2008，33（9）：1059-61.
[7]徐光辉，李玉，叶胜龙，等. 结直肠癌组织中ERCC1和BRCA1的表达及其与铂类化疗疗效的相关性[J]. 复旦学报（医学版），2011，38（4）：315-23.
作者简介：黄羽（1982 ～），女，本科，主治医师，研究方向：乳腺肿瘤病理。
*通信作者：黄克强（1978 ～），男，硕士，副主任医师，研究方向：胃肠道肿瘤病理；
论文作者:黄羽,黄克强
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第23期
论文发表时间:2018/10/9
标签：细胞论文; 阳性论文; 蛋白论文; 肿瘤论文; 凋亡论文; 基因论文; 指数论文; 《中国误诊学杂志》2018年第23期论文;