黄惠英1 郑辉2 杨树3 刘丹4 郭富强3（通讯作者）
【摘 要】 目的 探索通过氮气干燥结合球囊损伤比格犬颈动脉内皮细胞，辅以高脂饮食，观察能否建立比格犬颈动脉粥样硬化狭窄模型。方法 19只健康雄性比格犬随机分为2组，A组（假手术组 n=4）和B组（动脉粥样硬化狭窄造模组 n=15）。A组仅分离右侧颈总动脉但不损伤；B组用氮气干燥结合球囊损伤右侧颈总动脉内皮细胞，两组均高脂饮食饲养2个月。行颈部血管彩超和数字减影血管造影（Digital subtraction angiography，DSA）检查，对比术前、术后变化，观察比格犬颈动脉狭窄和粥样硬化斑块形成情况。用SPSS17.0软件包进行t检验,以P<0.05视为差异有统计学意义。结果 造模后2个月颈部血管彩超结果显示:A组颈动脉内膜光滑，无狭窄和斑块形成；B组造模侧颈动脉可见不同程度的狭窄和斑块形成。DSA检测结果显示：B组狭窄率显著大于A组（P=0.000）。结论 通过氮气干燥结合球囊损伤比格犬颈动脉内皮细胞，辅以高脂饮食，能够建立比格犬颈动脉粥样硬化狭窄模型。
【关键词】 比格犬； 氮气干燥； 球囊损伤； 脂饮食； 颈动脉粥样硬化狭窄
Establish Beagles’carotid atherosclerotic stenosis model. Huang Huiying1 Zheng Hui2 Yang Shu3 Liu Dan4 Guo Fuqiang3*. 1.Leshan People's Hospital of Neurology, Leshan 614000；2.Chengdu First People's Hospital of Neurology,Sichuan Chengdu,610072；3.Sichuan Provincial People's Hospital of Neurology,Sichuan Chengdu,610072；4.Liangshan Second People's Hospital of Neurology,Sichuan Liangshan,615000；
【Abstract】 Objective To explore whether the models of carotid atherosclerotic stenosis in Beagles can be established by the way of balloon injury and nitrogen drying of endothelial cells in their carotid arteries with high-fat diet .Methods 19 healthy beagles in male were randomly divided into 2 groups, group A (sham group, n = 4) and group B (atherosclerotic group n = 15). Carotid artery of right was only separated in group A ,not injuried ; group B was injured by the way of balloonjury and nitrogen drying of endothelial cells in their carotid arteries, both of them supported by high-fat diet. Vascular ultrasound and DSA was used to observed the carotid artery stenosis and atherosclerotic plaque formation two months after modeling. Results Carotid intima of group A is smooth, which show by results of the vascular ultrasound , without stenosis and plaque formation; Carotid arteries of group B can be seen varying of degrees of stenosis and plaque formation. DSA results show group B is much larger than group A in stenosis rate(P <0.005).Conclusion The model of carotid atherosclerotic stenosis in Beagles can be established by the way of balloon injury and nitrogen drying of endothelial cells in their carotid arteries with high-fat diet .
【Key words】 Beagles； Nitrogen drying； Balloon injury； High-fat diet； Carotid atherosclerotic stenosis
根据2010年中国脑血管病防治指南，全国每年新发脑卒中约200万人，每年死于脑血管病约150万人。缺血性脑卒中是由于脑主要动脉的血流短暂或持久减少引起，颅内外动脉狭窄是缺血性脑卒中的重要原因。动脉粥样硬化（Atherosclerosis， AS）是多种急性脑血管病的共同病理基础，颈动脉粥样硬化所致的管腔狭窄与脑卒中的发生密切相关[1]。
颅内外动脉狭窄支架成形术是近年来开始用于临床治疗颅内动脉狭窄的有效手段，但是术后再狭窄(Restenosis，RS)的发生却成为困扰和阻碍血管内支架成形术治疗发展的很大因素，其发生机制并不完全清楚。RS问题严重限制了血管内支架成形术的普及和发展。因此，减少血管内支架成形术后再狭窄机率一直是研究热点。过去, 人们在采取大量动物模型进行血管内支架成形术相关研究时, 多数动物模型忽略了AS这一病理学过程。
随着对颈As的发病机制及预防、治疗方面研究的不断深入,迫切需要建立一种As模型[2]，因为AS的动脉壁手术后愈合过程与正常动脉壁有较大差异，所以既往动物实验的临床参考价值非常有限。
比格犬(Beagles)生物学特性可靠, 遗传性稳定,来源清晰, 个体差异小, 性情温顺, 易饲养, 抗病能力强。已有研究表明利用比格犬做动物实验得到的实验数据准确[3][4]，本实验通过氮气干燥及球囊损伤比格犬颈总动脉内皮细胞，同时辅以喂养高脂饮食，以期建立比格犬颈动脉粥样硬化狭窄模型。该模型建立的目的是为进一步研究颈动脉支架置入术后再狭窄病理生理机制提供更具有临床参考价值的动物模型。
材料和方法
1．实验材料
1.1 主要实验手术器械 手术剪、眼科镊、止血钳，血管夹，8-0 带针缝合线，0号血管缝合线，显微剪，显微持针器，手术显微镜，气体流量表，氧气罐，氮气罐，心电监护仪，呼吸机等。
1.2 主要实验用药：盐酸氯胺酮注射液 （福建古田药业有限公司），枸橼酸芬太尼注射液（ 宜昌人福药业有限责任公司），肝素钠注射液 （中国江苏常州干红生化制药股份有限公司），0.9%氯化钠注射液（福州海王制药），阿司匹林肠溶片（石家庄康力药业有限公司），注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司），地西泮注射液（天津药业焦作有限公司），血管造影剂（欧莱派克公司）等。
1.3 球囊导管等：导管（美国波士顿公司），球囊 4mm×15mm（美国波士顿公司），导丝（日本泰尔茂公司），穿刺针 （日本泰尔茂公司），压力泵（美国波士顿公司）。
1.4 主要仪器和设备：彩色多普勒超声诊断仪（PHILPS IU22），血管造影机（PHILIPS）；
2．实验动物及分组 健康比格（Beagle）犬19只，雄性,体重在15-20kg之间， 由四川省医学科学院实验动物中心提供。将比格犬进行编号，按随机化数字表法将比格犬随机分为A组（假手术组 n=4），B组（动脉粥样硬化狭窄造模组 n=15）。
3．喂养情况 整个实验期间在四川省医学科学院实验动物中心饲养。所有比格犬采用独立圈养的方法,日粮为体重的4%，饮水不限。高脂饲料配制:基础饲料84．0%；牛油6．0％；花生油6．0％ ；牛胆盐1．0％；胆固醇3%。整个实验期间在四川省医学科学院实验动物中心饲养。所有比格犬采用独立圈养的方法,日粮为体重的4%，饮水不限。高脂饲料配制:基础饲料84．0%；牛油6．0％；花生油6．0％ ；牛胆盐1．0％；胆固醇3%。
4．抗血小板和抗凝准备 所有实验比格犬均在造模术前24小时及术后3天喂食阿司匹林肠溶片300mg/d，之后改为阿司匹林肠溶片100mg/d，直至实验终点。在造模过程中给予肝素钠抗凝。
5．颈总动脉粥样硬化狭窄动物模型建立
5.1术前准备：术前24小时比格犬禁饮禁食。
5.2麻醉 ①诱导麻醉：臀部肌肉注射安定注射液10mg镇静，阿托品注射液0.05mg减少比格犬唾液等分泌物。 ② 基础麻醉：诱导麻醉30分钟后，臀部肌肉注射氯胺酮注射液10mg/kg及枸橼酸芬太尼注射液0.01mg/kg。③维持麻醉：基础麻醉成功后将比格犬固定于手术台。同时，建立静脉输液通道。静脉通道建立后首先静脉缓慢推注盐酸利多卡因20 mg预防室颤。然后，持续静脉滴注麻醉液维持麻醉，滴速约30-40滴/分，并根据比格犬麻醉状态及时调整麻醉液滴速。手术全程使用普通肝素抗凝，首次剂量为100u?kg-1，以后每小时追加1000u。
5.3麻醉成功后，行气管插管保持呼吸道通畅，心电监护监测各项生命体征。
5.4球囊损伤加氮气干燥损伤右侧颈总动脉内皮细胞，建立颈动脉粥样硬化狭窄模型。
首先，颈部皮肤去毛、消毒；其次，分离暴露颈总动脉，行颈总动脉穿刺，穿刺成功后给予氮气干燥10分钟（氮气流量约120ml/分）。球囊损伤方法如下：根据血管直径大小选择相应球囊置入血管中,后用压力泵给球囊内充气至8-10个大气压，持续时间30秒，间隔60秒再次行球囊内充气，共重复3次，并且来回拖拉球囊3次；最后，缝合动脉穿刺处，逐层缝合伤口，再次消毒纱布包扎。
5.5假手术组造模：动物麻醉过程与狭窄模型组相同。手术方式如下：首先，消毒手术区域；其次，暴露、游离右侧颈总动脉；最后，右侧颈总动脉游离后随即逐层缝合伤口。
5.6术后处理：手术完毕后，将比格犬送入饲养房中独立圈养；术后3天给予青霉素160万U 肌肉注射 1次/d 及消毒伤口以预防感染；每天观察记录动物情况，给予高脂饮食喂养2月后行颈部血管彩超及DSA检查观察动物模型血管狭窄情况。
6．颈动脉彩超及DSA检查 由专业的颈动脉彩超检查人员分别于造模前、造模后1月、造模后2月进行颈动脉彩超检查，了解颈动脉狭窄程度及动脉粥样硬化斑块形成情况。造模后2月行颈动脉DSA检查了解颈动脉狭窄情况。
7．统计学处理 采用 SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。数据采用均数±标准差（x?±s）表示。两组间比较采用t 检验进行统计学分析，以P<0.05为差别有统计学意义。
结 果
1．动物的一般情况 在造模过程中共有2只比格犬死亡，死因可能为麻醉意外致心律失常，其余比格犬在造模和DSA检查后一般情况良好，能较好的进食，大小便正常，无肢体瘫痪等不良情况出现。
2．比格犬颈动脉彩超情况 彩超检查结果发现，B组实验动物造模1月时颈部血管管腔未见明显狭窄，也无斑块形成，在造模2月时颈部血管管腔有狭窄、而且有斑块形成。A组实验动物在造模后1月、2月均未见管腔狭窄及斑块形成（见图1）。
a：A组造模2月后，颈部血管未见狭窄
b：B组造模2月后，颈部血管见明显狭窄
讨 论
长期以来，因支架和大型动物较昂贵，对于血管成形术后再狭窄动物实验研究大多集中在小型动物（如大鼠、兔）血管球囊损伤术 [5][6]。这些研究大多数都不能完全模拟支架置入后的病理变化。即使在采用大型动物进行支架置入研究中，实验动物术前也较少经过特殊处理。如小型猪血管中直接置入支架研究[7]。因人类支架置入大多在动脉粥样硬化斑块形成情况下进行，故既往研究不能很好模拟临床支架置入术后的病理生理过程。
目前采用颈动脉球囊损伤造成颈动脉狭窄的造模方法已较成熟，有许多研究[6][7]都用此方法进行造模。也有实验表明[8]可以采用空气干燥法和高脂饲料喂养制作家兔颈动脉狭窄模型，但在颈动脉直接置入支架进行的动物研究尚较少。因为，我们接下来的实验需要在建立颈动脉粥样硬化狭窄模型后，在比格犬颈动脉中置入支架进行再狭窄的病理生理机制研究，实验过程中需进行DSA检查等复杂操作。实验动物选择将直接影响实验结果，我们查阅国内外文献同时结合我们的专业知识发现比格犬性格温顺，耐受性较强，且犬的颈动脉长度与人类近似，术后成活率高，可反复操作，影像学符合率高；故我们选取比格犬作为本次研究的实验动物。但是，因为犬对动脉粥样硬化相比其他动物具有更大的抵抗力，故在高脂血症建立动脉粥样硬化模型方面较小型猪和新西兰大白兔困难。故本实验给予球囊加氮气损伤比格犬颈总动脉的内皮细胞，并给予高脂饮食三种方法相结合，建立颈动脉粥样硬化狭窄模型。
本实验建立颈动脉粥样硬化狭窄模型的目的不是为了研究AS病理生理机制，而是尽量使我们建立的动脉粥样硬化狭窄的动物模型与人类动脉粥样硬化病理生理情况相同，为在此基础上进行支架置入后再狭窄的研究提供理想的动物模型。高脂诱发动脉粥样硬化早期病变模型比较符合自然状态下人类动脉粥样硬化，多继发于高脂血症的发病特点，以往许多有关动脉粥样硬化的研究也是基于高脂血症动物模型[9][10] 。既往研究表明[11]，AS的动物模型一般在造模后6周至10周时，血脂水平大幅上升，AS斑块趋于稳定；动脉血管内出现典型AS斑块，纤维帽明显，内膜明显增厚，这些变化基本符合人AS 的病理表现。结合我们进行颈动脉彩超的检查结果，我们选择造模后2月作为造模实验的终点。
本实验在造模过程中，共有2只比格犬死亡，考虑死亡原因为麻醉意外；其余比格犬在实验中及实验结束后饲养过程中均未出现异常情况，表明此法具有可操作性强、重复性好、稳定性强、易于评价等优点。
本实验通过颈动脉彩超了解造模后1月和2月血管狭窄及斑块形成的动态观察结果显示：A组在经过两个月的高脂饮食饲养后，内膜光滑，未见狭窄和动脉粥样硬化斑块形成，表明比格犬经过单纯的高脂饮食饲养两个月后，不能形成动脉粥样硬化病变；而B组比格犬颈动脉出现狭窄，部分比格犬颈动脉损伤处出现了较明显的动脉粥样硬化斑块；2月时DSA数据分析表明B组的狭窄率大于A组, 提示本实验采用的造模方法可以建立比格犬颈动脉粥样硬化狭窄模型。但是，可能因为时间较短，大多尚未形成理想的动脉粥样硬化狭窄模型（狭窄率>50%）。
综上所述，通过氮气干燥结合球囊损伤比格犬颈动脉内皮细胞，辅以高脂饮食，可以建立比格犬颈动脉粥样硬化狭窄模型，但尚需更多研究去验证此法用于动物血管动脉粥样硬化狭窄模型的可行性与有效性。
结 论
通过氮气干燥结合球囊损伤比格犬颈动脉内皮细胞，辅以高脂饮食，可以建立比格犬颈动脉粥样硬化狭窄模型。
参考文献
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论文作者:黄惠英1,郑辉2,杨树3,刘丹4,郭富强3（通讯作者
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期
论文发表时间:2016/7/18
标签：狭窄论文; 动脉论文; 比格论文; 颈动脉论文; 粥样论文; 模型论文; 血管论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期论文;