张欣, 付亚萍, 周君莉, 郭秀平, 刘文真[1]2014年在《水稻规模化转基因技术体系构建与应用》文中指出水稻作为重要的粮食作物和遗传转化的模式植物,其遗传转化一直受到广泛重视。自世界首例转基因水稻于1988年获得成功以来,水稻遗传转化技术体系迅猛发展,尤其是1994年首次通过农杆菌介导实现对粳稻的高频转化,经过近20年的发展,水稻遗传转化技术体系已经比较完善。目前,应用于水稻中的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法,一些实验室也采用花粉管通道法、电击法、PEG转化法等。其中,农杆菌介导的转基因方法以其低成本、易操作、转化效率高、单位点插入比例高、后代表达稳定等特点已经成为水稻转化的主流方法,约占水稻转基因报道总数的80%以上。虽然国内外刊物时有转基因方法改进的报道,但是由于种种原因,水稻的转化还受一些因素的限制,例如部分粳稻品种和籼稻受基因型的限制十分明显,转基因效率普遍较低,严重制约了转基因技术在水稻生产中的应用;某些转基因程序过于繁琐,耗时长,成本高,不但导致效率低,而且长时间的组织培养诱发逆转座子转座引起无性系变异干扰了功能研究和育种工作。因此,迫切需要建立高效、安全、规模化和标准化的水稻转基因技术体系。文章综述了国内外水稻转化技术的发展历程,重点回顾了近5年中国水稻规模化转基因技术研究进展,包括围绕不同水稻基因型高效转化体系优化及建立,对影响农杆菌转化效率及植株分化频率等诸多因素如水稻基因型、外植体类型、农杆菌菌株和质粒载体、培养基组分、共培养时间、侵染方式等方面的研究和探索。整合国内外已有研究结果进行技术集成创新,分别以粳稻和籼稻成熟胚、幼胚为外植体,采用农杆菌转化方法,通过优化受体材料和愈伤状态、农杆菌侵染浓度和分化温湿度、工艺流程标准化等多种组分,突破了成熟胚分化难的技术瓶颈,整合了无选择标记等安全转基因技术,实现了粳稻和部分籼稻转化技术的标准化和工厂化,初步建立了安全、高效、规模化水稻转基因技术体系。但与国际先进水平相比,尤其与一些跨国生物技术公司相比,在转化规模和转化效率方面仍然存在较大差距。认为安全、高效、规模化是转基因水稻新品种培育和产业化的重大技术瓶颈。建立水稻主栽品种快速、高效、稳定的转化系统,开发安全型转化技术,开展多基因、大片段基因转化,实现转基因的定点整合和时空控制表达等是水稻转基因技术的发展趋势,针对水稻规模化转基因技术体系存在的问题,提出了相应的对策,对于促进转基因水稻新品种培育和功能基因组学研究具有一定参考价值。
张笑寒[2]2016年在《CRISPR/Cas9定点编辑OsGA20ox2基因降低水稻株高研究》文中进行了进一步梳理株高是水稻(Oryza sativa L.)的重要农艺性状之一,与水稻产量具密切关系。水稻植株过高容易引起倒伏,适当降低株高可使水稻的抗倒伏能力、耐肥性和密植性增加,进而提高水稻的叶面积指数和产量。水稻的株高发育受多个基因调控。OsGA20ox2基因编码水稻GA20氧化酶,其突变会导致水稻株高降低。OsGA20ox2基因突变体在水稻生产上的应用推动了20世纪农业生产上的绿色革命,使世界水稻产量大幅提高。本论文研究探讨了利用CRISPR/Cas9技术,对水稻品种日本晴及贵州地方水稻来拢的OsGA20ox2基因进行定点编辑,可获得OsGA20ox2基因突变的植株,且因该技术中T-DNA的插入位点与作用位点相分离,可通过对转基因后代进行自交或回交,以获得不带有转基因元件的突变体植株。以水稻成熟种子为材料,研究并优化了影响农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化的因素。根据已公布的水稻OsGA20ox2基因序列,进行生物信息学分析并设计目标靶点,构建带有草胺膦抗性及OsGA20ox2基因靶点的特异性CRISPR/Cas9植物表达载体。通过农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化方法,将其转入水稻,经除草剂筛选及PCR分子鉴定,获得了转基因水稻植株,对其主要农艺性状进行了测定及分析。主要研究成果如下:(1)农杆菌介导的水稻剑河红谷遗传转化过程受诸多因素影响,通过GUS基因的表达水平对影响农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化因素进行研究。农杆菌菌液浓度、真空处理时间和真空渗透压强是直接影响水稻茎尖遗传转化的因素。研究表明,在转化条件为农杆菌菌液浓度OD600为0.8、真空处理时间8 min、真空渗透压强20 kPa时,GUS基因表达水平最高,同时植株存活率也较高。该遗传转化条件为通过农杆菌介导法将OsGA20ox2基因靶点特异的CRISPR/Cas9植物表达载体转化水稻奠定了基础。(2)对已公布的水稻OsGA20ox2基因进行生物信息学分析,采用E-crisp在线工具,设计了CRISPR/Cas9基因编辑靶点,并构建了携带除草剂抗性筛选标记基因bar及水稻OsGA20ox2基因靶点特异性CRISPR/Cas9植物表达载体。以日本晴和贵州地方稻种来拢为材料,以农杆菌介导水稻茎尖遗传转化水稻,经除草剂草胺膦筛选及PCR分子检测,获得了转基因水稻来拢4株,转基因水稻日本晴植株12株。(3)对转基因水稻植株进行农艺性状考察。结果表明,转基因日本晴平均株高为71.3 cm,而野生型日本晴平均株高为85.8 cm,转基因日本晴比野生型低16.9%;转基因来拢平均株高为159.0 cm,而野生型来拢平均株高为179.8 cm,转基因来拢平均株高比野生型来拢低11.58%;差异均达到显着水平(P<0.05)。然而,转基因水稻与其野生型品种在有效分蘖数、剑叶长、剑叶宽、穗长、有效穗粒数等农艺性状上,均无明显差异。研究表明,采用CRISPR/Cas9技术对水稻OsGA20ox2基因进行定点编辑可引起水稻株高降低,同时对其他农艺性状的影响不大,可见,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向创制水稻突变新种质是一种具有重要应用价值的途径。
苏家琦[3]2005年在《农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立和水稻转EPSP基因的初步研究》文中提出水稻是一种世界性的重要粮食作物,是我国40%左右粮食的来源。水稻生长受多种胁迫因素的影响,其中杂草是影响水稻单产的主要因子之一。通过基因工程的方法可获得具有除草剂抗性的水稻新品种,不但能有效的控制杂草的危害,同时可以解决杂交水稻制种中假杂种问题。农杆菌介导法是目前普遍应用的水稻转基因方法,但由于水稻品种间遗传差异很大,且对植株再生和转化反应的基因型依赖很大。因此如何建立一种高效、稳定、实用的再生系统和转化系统仍有许多问题需要细致深入的研究。 本实验主要通过将从抗除草剂微生物中获得的EPSP(5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶)基因转移到水稻受体中,并优化水稻的组织培养方法和受体的遗传转化系统,并得到以下的结果。 1.由幼胚诱导产生的愈伤组织,继代能力,分化能力和接受外源基因的能力都比成熟胚诱导的愈伤组织强。选用幼胚诱导的愈伤组织作为遗传转化的受体,可以提高转化效率。 2.2,4—D是诱导水稻产生愈伤组织最重要的激素,通过观察不同浓度下水稻愈伤组织的诱导情况,得出最适的2,4—D浓度为2mg/L。在此浓度下诱导的愈伤组织继代能力强,且诱导率高。 3.在成熟胚培养过程中,进行去除胚乳的处理,可以提高愈伤组织的分化率。 4.在分化前进行干燥处理可以显着提高愈伤组织分化率。 5.水稻作为单子叶禾本科植物对卡那霉素具有一定的天然的抗性。使用卡那霉素抗性基因(nptⅡ)作为筛选标记效果低于使用潮霉素,在实验中,我们采取延长筛选时间的方法,起到了一定的筛选效果。 6.获得抗性小苗
张孟倩[4]2009年在《RSV CP在水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽作用下的致病机制研究》文中研究指明由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病是亚热带和温带稻区最重要的病毒病之一。在我国的粳稻产区一般会造成20% - 30%的损失,特别是近年来已上升为影响范围最广、危害最大的一种水稻病毒病。水稻条纹病毒外壳蛋白(CP)是一种与症状密切相关的蛋白,本文利用PCR扩增获得水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和RSV CP基因,分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体,构建了二者的融合基因PR-CP和PR-S-CP,并根据农杆菌EHA105菌株介导法转化水稻的需要,分别将RSV CP与PR-CP连接到水稻转化常用载体pTCK303,通过转基因手段初步研究水稻叶绿体引导肽在RSV致病过程中所起的作用,为进一步探究RSV的致病机理打下基础。利用农杆菌EHA105菌株的介导,将构建的植物表达载体转入水稻模式品种日本晴的成熟愈伤组织。对转化体系的研究表明,NB培养基中2.3mg/L的2,4-D的使用促进了愈伤组织的分生能力,在分化培养基中加入10mg/L的KT和0.5mg/L的NAA,提高了愈伤组织的分化效率,农杆菌培养液中100μM As(乙酰丁香酮)的加入有效地诱导了农杆菌Vir基因的活化,从而促进了外源基因的整合并使转化效率得到提高。利用PCR方法对转化得到的水稻进行目的基因检测,确定获得T0代转基因水稻27株(其中转CP基因苗12株,转PR-CP基因苗15株)。收获转基因植株T1代种子,在含潮霉素(30mg/L)的NB培养基中,20天后观察其发芽情况,发现T1代种子中,抗性和敏感性种子按3:1的比例分离,说明了整合入T0代基因组的目的基因向T1代的稳定遗传。从转基因苗的表型症状上看,转CP基因植株在农艺性状上与对照差异不大,转PR-CP基因植株则有明显的矮化、生长缓慢症状,说明进入叶绿体的CP会对水稻的正常生理产生了一定的影响。
李凤玲[5]2006年在《水稻转基因受体系统的建立及农杆菌介导法转基因的初步探讨》文中研究表明水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一。长期以来，稻米一直是我国一半以上人口的主粮。随着生活水平的提高，人们对稻米营养品质的要求也越来越高。其中，微量元素、蛋白质和必需氨基酸是人们主要关注的营养特性。赖氨酸和甲硫氨酸是人和动物必需的两种氨基酸，在人和动物体内不能自身合成，必须从食物中直接摄取。缺乏这两种氨基酸会造成人体代谢紊乱，甚至引发某些生理机能性疾病。但是水稻作为人们的主食，其赖氨酸和甲硫氨酸含量却很低。此外，水稻中微量元素铁的含量也较低，人乳铁蛋白(human lactoferrin，hLF)是一种具有多种生理功能的糖基化蛋白，可以可逆性地结合两个铁离子，hLF具有的生物学功能若能为水稻所利用，则将大大增加稻米内铁的生物有效性。水稻生产需要改善稻米的微量元素、蛋白质和必需氨基酸的含量，才能适应人们的需求变化。利用传统育种手段可以改良水稻的品质农艺性状，但缺点是育种周期长见效慢。实践证明，利用基因工程手段将控制不同农艺性状的多个基因构建在同一载体的同一T-DNA上，导入目标水稻中，可以有效地改善稻米的品质。 在水稻基因工程中，为实现理想的转化效果，必须建立一个稳定、高效、易于再生的受体系统。本文以四个水稻品种为试验材料，研究了影响成熟胚和幼胚培养效果的一些主要因素，并且对成熟胚诱导培养基进行了改良，旨在建立一套稳定、高效的遗传转化体系。并且应用农杆菌介导转化法将构建在同一载体T-DNA上的人乳铁蛋白基因(hLF)、高赖氨酸基因(SB401)和高甲硫氨酸基因(RZ10)转入水稻受体中，研究的结果如下： 1．不同灭菌剂对外植体的灭菌效果不同。单一灭菌剂灭菌效果不如灭菌剂组合对种胚灭菌效果明显，用70％酒精3分钟+10％次氯酸钠10分钟+0.1％升汞15分钟的灭菌剂组合对水稻种胚灭菌效果最好。 2．蔗糖不是培养基唯一碳源，培养基中用麦芽糖和蔗糖各一半混合使用或者单一用蔗糖作为碳源效果都比较好。若考虑到成本问题，则使用蔗糖作为诱导培养基碳源比较合适，但应注意其他糖类对组培的影响。 3．不同琼脂浓度对水稻愈伤组织的诱导效果不同。在诱导培养基中添加8g／L的琼脂粉时出愈率最高，诱导和培养效果最好。
张红霞, 邓启云, 吴俊[6]2010年在《农杆菌介导水稻转基因技术的原理与应用研究进展》文中提出农杆菌介导转基因技术最近几年取得很大进展,为了推动我国水稻转基因研究工作,对农杆菌介导转基因的原理、实验研究过程和各种影响因素进行了综述。
郑晔[7]2008年在《水稻高效转基因体系的建立及其应用研究》文中研究说明植物转基因技术是获得具有优良性状的转基因作物和植物基因功能研究的重要手段。在过去的二十年,植物转基因技术已有很大的改进,转基因效率及转化的物种数有了很大的提高。但是,到目前为止,仍有不少植物种或品种不能进行转基因,或转基因效率很低。通过研究,进一步提高植物转基因的效率,具有重要意义。本研究一方面从农杆菌介导的水稻转化技术着手,探讨了植物中参与农杆菌转化过程的基因在提高水稻转基因效率方面的功效。另一方面,研究以高效基因干涉技术为基础,对水稻铁营养代谢途径中重要基因进行了抑制表达,明确了该体系在水稻中的基因干涉效果,并初步研究相关基因的功能。主要实验结果如下:1.通过在水稻中超表达拟南芥AtH2A1基因来对农杆菌介导的水稻转化技术做出优化,提高了水稻的转化效率。以粳稻日本晴为材料,将带有AtH2A1基因的超表达载体pTF101.1-H2A1及空白对照pTF101.1分别转到日本晴中,并且对T1代转基因种子进行转化效率分析。发现在超表达AtH2A1基因的T1代转基因种子诱导的愈伤与空白对照诱导的愈伤相比,侵染效率提高了44%。2.另一方面,本研究采用Gateway高通量技术,对5个水稻铁营养相关基因构建相应的7个RNAi干涉载体,干涉的基因包括构建了分别针对水稻尼克酰胺合成酶OsNAS1、OsNAS2、OsNAS3,Fe~(2+)转运体OsIRT1和OsIRT2基因。这些载体转入水稻日本晴野生型和naat1突变体后发现,T1代转基因苗均有不同程度的干涉效果。其中在OsNAS1,OsNAS2共同干涉载体转入naat1突变体后,naat1突变体的表型回复到了野生型,为明确NAS基因在水稻铁代谢中的作用奠定了基础。
叶兴国, 王艳丽, 丁文静[8]2006年在《主要农作物转基因研究现状和展望》文中研究指明近15年来,大豆、水稻、玉米、小麦等主要农作物转基因研究取得了较大进展,几乎各种遗传转化方法在这些作物上都取得了成功,尤其是农杆菌介导法,不仅在难转化的双子叶作物大豆上取得了成功,而且在单子叶作物水稻、玉米、小麦上先后取得了突破。同时,将一些与重要性状如抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、品质改良、发育调控、营养吸收等改良有关的外源基因转入了主要农作物。转基因大豆、玉米、棉花、油菜已经大面积种植,产生了极大的经济效益。2004年全球转基因作物的种植面积达到了8100万公顷。对大豆、玉米、水稻和小麦等主要农作物转基因研究进展和产业化现状进行了综述,并对主要农作物转基因研究中存在的问题进行了分析。
刘俊利[9]2007年在《水稻BADH2基因RNA干涉表达载体的构建与遗传转化》文中研究指明甜菜碱是植物在盐、干旱或其它胁迫下在细胞中迅速积累的一种相容性有机小分子化合物，它在细胞中的积累与植物抗盐性的提高密切相关。大多数生物体内的甘氨酸甜菜碱的合成需要两步反应。其中，甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)催化甜菜碱醛生成甘氨酸甜菜碱。水稻是世界上重要的粮食作物之一，对盐胁迫较敏感。稻田盐碱化是造成水稻减产的主要环境因素之一。所以对水稻耐盐性的研究和改良是当今农业发展的重要研究课题之一。众多研究结果都表明，BADH基因家族和植物的耐盐性抗旱性有关。在很多单子叶植物(包括水稻)中，都发现与双子叶植物BADH功能相似的两个同源基因BADH1及BADH2。推测这两个同源基因也与植物耐盐抗旱有关。本实验室构建了水稻BADH2的RNAi载体，并利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将其导入多个水稻品种幼胚、成熟胚诱导的愈伤组织，再生形成完整的转基因水稻植株。实验表明，不同外植体来源影响愈伤组织的诱导和转化，并且愈伤组织的诱导和转化效果受基因型的影响。在农杆菌转化过程中，潮霉素和除草剂都是较好的筛选剂，前者筛选所得的抗性愈伤分化成苗所需时间较短；但后者筛选所得的抗性愈伤形成的苗更健壮。T_0代PCR检测表明，通过转化确已获得一定数量的转基因植株，为进一步研究水稻BADH2基因的功能奠定了基础。通过对阳性转化株及对照株进行盐胁迫试验，比较在相同浓度NaCl胁迫下阳性转化株幼苗和野生型对照幼苗的株高、根长等的抑制率，来检测转基因植株的耐盐性。在实验中，我们发现转基因水稻种子的发芽率明显比野生型对照低，发芽迟缓而且出芽不齐。这可能是由于外源载体的导入对植株原来的代谢途径产生干扰，影响了种子的正常萌发。这种现象是否是BADH2基因被沉默后的特异性状，还有待证实。
唐海娟[10]2009年在《根癌农杆菌介导的水稻转基因体系研究》文中进行了进一步梳理水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要粮食作物之一,我国40%左右的粮食依赖于水稻生产,由于其基因组相对较小,且已经完成全基因组测序,目前已成为作物基因组研究的模式作物。农杆菌介导法由于具有操作简便、转化效率高、较少的插入拷贝数以及整合机制相对简单等优点,是目前普遍应用的水稻转基因方法。但由于水稻品种间的遗传差异对植株再生和转化效率有较大的影响,因此如何建立一种高效、稳定、实用的愈伤组织再生体系和农杆菌转化体系仍有许多问题需要研究。本研究以粳稻(Oryza sativa L. ssp.japonica)品种日本晴、中花11、苏御糯、爱知旭等品种为材料,进行成熟胚和幼胚的愈伤组织诱导培养,并利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化法将实验室克隆的0sCBL5、0sCBL6、0sNHX2、ZFP177、ZFP181、0sSNAP32、OsNPSN11、0sSYP71等21个基因对两种来源的愈伤组织进行转化,建立了高效农杆菌介导的水稻转基因体系。研究结果表明,粳稻幼胚的胚性愈伤组织诱导率相对高于成熟胚,江苏地方品种苏御糯的成熟胚和幼胚的愈伤组织诱导率都很高,分别为95.2%,96.2%,胚性率也在95%左右。用农杆菌转化法将不同目标基因转化苏御糯幼胚愈伤组织,抗性愈伤转化率和抗性植株转化率分别为70.5%、52.4%,明显高于中花11和日本晴两个水稻品种的转化率。对其可能的作用机理进行了讨论。
参考文献：
[1]. 水稻规模化转基因技术体系构建与应用[J]. 张欣, 付亚萍, 周君莉, 郭秀平, 刘文真. 中国农业科学. 2014
[2]. CRISPR/Cas9定点编辑OsGA20ox2基因降低水稻株高研究[D]. 张笑寒. 贵州大学. 2016
[3]. 农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立和水稻转EPSP基因的初步研究[D]. 苏家琦. 四川农业大学. 2005
[4]. RSV CP在水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽作用下的致病机制研究[D]. 张孟倩. 福建农林大学. 2009
[5]. 水稻转基因受体系统的建立及农杆菌介导法转基因的初步探讨[D]. 李凤玲. 四川农业大学. 2006
[6]. 农杆菌介导水稻转基因技术的原理与应用研究进展[J]. 张红霞, 邓启云, 吴俊. 湖南农业科学. 2010
[7]. 水稻高效转基因体系的建立及其应用研究[D]. 郑晔. 浙江大学. 2008
[8]. 主要农作物转基因研究现状和展望[J]. 叶兴国, 王艳丽, 丁文静. 中国生物工程杂志. 2006
[9]. 水稻BADH2基因RNA干涉表达载体的构建与遗传转化[D]. 刘俊利. 四川大学. 2007
[10]. 根癌农杆菌介导的水稻转基因体系研究[D]. 唐海娟. 南京农业大学. 2009
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