韩双艳[1]2004年在《单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的构建及免疫学性质研究》文中研究表明单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex Virus Ⅱ，HSV-2)主要引起生殖器粘膜感染，临床表现为生殖器疱疹(genital herpes，GH)。GH近年来发病率明显上升，成为许多国家和地区的重要性病，是我国八大性病之一。HSV-2初发感染后，可在中心神经系统潜伏，终生复发。HSV-2易经性接触传播，可形成亚临床感染、潜伏感染、复发感染，目前尚无特效药物控制其发生和复发。接种疫苗是预防和治疗HSV-2感染最有希望的方法之一。DNA疫苗可激发全面的免疫应答，是研制抗HSV-2感染疫苗的主要方向。 本研究从临床分离的野生株中克隆保护性抗原编码基因gD2(Arg92-Ala302)，构建重组真核表达质粒pVAX-gD。研究pVAX-gD在体外的表达，评价其激发动物产生免疫反应的能力及对动物的保护作用。 首先采用组织培养、透射电镜观察，分离鉴定一株造成严重复发的单纯疱疹病毒Ⅱ型野生株。根据Gene Bank提供的HSV-2糖蛋白D基因(gD2)序列设计PCR引物，特异性扩增野生株gD2全长片段，将其克隆于pUCm-T载体中。gD2基因的测序结果表明：与Gene Bank提供的HSV-1 gD DNA碱基同源性达84.6％，氨基酸同源性达82.7％；与HSV-2 gD DNA碱基同源性达98.4％，氨基酸同源性达95.7％。 BIMAS、SYFPEITHI软件分析gD2全长氨基酸序列，表明：MHC Ⅰ、Ⅱ类分子识别的抗原表位集中于野生株gD2的Arg92-Ala302之间。PCR扩增获得gD2(Arg92-Ala302)基因片段，将其与真核表达载体pVAX1在体外重组。经单双酶切鉴定，获得重组真核表达质粒pVAX-gD。 将重组真核表达质粒pVAX-gD转染哺乳动物细胞COS-7，RT-PCR检测到gD2的mRNA表达。SDS-PAGE电泳显示，pVAX-gD转染的COS-7细胞裂解液中出现一条分子量约23kD的蛋白条带，与gD2(Arg92-Ala302)理论分子量一致。免疫印迹实验表明该蛋白条带可被gD2单克隆抗体特异识别。细胞免疫组化证实gD2蛋白在细胞胞浆表达。 重组真核表达质粒pVAX-gD肌注免疫豚鼠，发现：pVAX-gD组豚鼠血清的中和指数远远大于同期pVAX组和NS组。pVAX-gD可诱导豚鼠产生高滴度gD2IgG，维持近叁个月。外源特异性抗原再刺激时，迅速发生再次免疫应答。MTT法检测脾淋巴细胞增殖显示pVAX-gD具有一定的刺激脾淋巴细胞增殖能力。抗病毒攻击实验表明pVAX-gD能有效地保护豚鼠抵抗HSV-2病毒感染，延缓初发感染，减少复发，具有明显的免疫保护作用。
关蕾[2]2006年在《单纯疱疹病毒Ⅱ型CTL表位gD DNA疫苗的构建及免疫学性质研究》文中研究表明生殖器疱疹(genital herpes，GH)主要由单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex Virus Ⅱ，HSV-2)感染所致。GH近年来发病率明显上升，是当前全球范围内对人类健康危害较严重的性传播疾病。HSV-2初发感染后，感染者易终生携带病原体，并以潜伏感染的形式局限在感觉神经后根。该病易复发，目前尚无彻底治愈的方法，且发病率逐年上升。研制有效的生殖器疱疹病毒疫苗，是预防和治疗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染的关键。近年来，新型的DNA疫苗由于能诱导出较好的细胞免疫和体液免疫而日益受到重视。 为研制有效安全，免疫原性好的疫苗，各国学者一直不断地探讨，本研究针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)包膜糖蛋白gD以及包膜糖蛋白gB的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位，构建重组真核表达质粒pVAX-gD-CTL。研究重组质粒pVAX-gD-CTL在COS-7细胞中的表达，评价其激发动物产生免疫反应，特别是细胞免疫反应的应答。 首先根据Gene Bank提供的HSV-2 333株糖蛋白D基因(gD)序列设计PCR引物，以已构建好的pc-gD为模板，特异性扩增HSV-2 gD片段，将其克隆于pVAX1载体中构建质粒pVAX-gD，再将其双酶切后引入CTL片段，构建重组质粒pVAX-gD-CTL，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆进行酶切及测序鉴定。将重组真核表达质粒pVAX-gD-CTL转染哺乳动物细胞COS-7，免疫组化、蛋白电泳及免疫印迹方法鉴定重组质粒的表达情况。
何方, 洪艳, 陈勇[3]2007年在《一种新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的构建及其初步研究》文中研究表明目的：构建新型的含单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白 gD 基因的卡那霉素抗性真核表达质粒 pgD,并探讨其作为 DNA 疫苗的可能性。方法：通过 PCR 扩增和连接重组从质粒 pET-28a(+)和质粒 pcDNA3获得新型真核表达质粒载体 pcDNAkan。再通过 PCR 从重组真核表达质粒 pcDNA3-gD 上扩增出 HSV-2糖蛋白 D 全基因序列 gD,最后克隆重组获得含 gD 的重组质粒 pgD。pgD 作为 DNA 疫苗免疫小鼠,观察其对小鼠的免疫效果及保护作用。结果：pgD 免疫小鼠后能产成特异性抗体(P＜0．01),在 HSV-2病毒致死性攻毒实验中,pgD 组存活率达100%。结论：重组质粒 pgD 能诱导小鼠产生特异性免疫应答,可为 HSV 的 DNA 疫苗研制提供科学依据。
孟祥俊[4]2004年在《单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的构建及初步免疫学研究》文中提出单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）主要是由单纯疱疹病毒I型（HSV-1）直接感染角膜上皮细胞引起的点状或树枝状角膜炎；在角膜基质内发生的免疫反应，引起盘状、基质坏死性角膜炎；由于HSV-1的特性能够潜伏于叁叉神经节造成复发感染, 在机体免疫力被抑制时，潜伏感染的HSV-1可重新活化，引起HSK的复发，由于HSK的反复发作造成视力严重损害甚至失明。目前针对HSK尚无特效疗法,从非选择性的竞争抑制病毒DNA酶的抗疱疹病毒类药物到比较有选择性病毒核苷激酶的抗HSV-1药物，再加上干扰素及不同类型的抗病毒药物的联合应用，使HSV-1的感染发生控制在较低的水平，但由于抗生素、激素的不合理使用，病毒耐药株的不断出现，机体的免疫功能受到干扰以及对HSV-1潜伏机制尚不清楚和一些药物全身应用时毒副作用，使其在临床应用时受到限制，迄今还未达到理想的治疗效果，故寻求特异性强、效果更好的抗病毒药物和研制抗HSV-1的安全疫苗来预防HSV-1的感染和复发,国内外许多学者认为针对HSV-1特异性自动免疫是控制感染的最有效途径。因此，研制疫苗是单纯疱疹病毒防治的重要方向。 HSV-1疫苗按其特点和作用机理可分为灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、肽疫苗、活载体疫苗、和核酸疫苗。核酸疫苗是近十年来发展起来的一种新的疫苗形式，可以诱导机体全面的细胞免疫和体液免疫应答，在胞内寄生病原体疫苗防治上具有广阔的应用前景。由于核酸疫苗是将抗原基因的质粒DNA直接导入体内，利用其表达的抗原蛋白诱导机体的免疫应答反应，因此必须将抗原编码基因克隆入表达载体中。核酸疫苗是由病原的保护性抗原基因和载体质粒构成；核酸疫苗的构建方法是将目的基因片段插入载体；插入基因片段是病原体保护性抗原的编码基因，其可以是单个基因、完整的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列，其表达产物为病原体有效的抗原部分，可诱发机体产生保护性免疫。 本研究选用的是HSV-1 gB基因，gB糖蛋白就有较强的免疫原性，可诱
梁宁[5]2011年在《pcDNA3.1（+）/ICP27重组HSV-2DNA疫苗的构建及在真核细胞中的表达》文中提出目的:构建新型II型单纯疱疹病毒DNA疫苗,并鉴定其在真核细胞中的表达,为疫苗的免疫学效应研究打下基础。方法:在vero细胞中培养并扩增HSV-2病毒,提取总RNA,RT-PCR法扩增UL54全长基因(表达ICP27蛋白),连接至pMD19-T Simple Vector载体,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,KpnI和XbaI双酶切后将UL54片段插入真核表达质粒pCDNA3.1(+)中,构建pcDNA3.1(+)/ICP27重组质粒(即HSV-2 DNA疫苗),经双酶切鉴定和测序鉴定正确后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR、Western-blot法鉴定HSV-2 DNA疫苗在COS-7细胞中的转录和表达。结果:成功构建pcDNA3.1(+)/ICP27重组质粒,双酶切鉴定分别显示了5428bp的pCDNA3.1(+)载体条带和1551bp的UL54条带,测序鉴定与Genbank中HSV-2 UL54序列一致。在转染COS-7细胞后,RT-PCR成功检测出UL54特异性片段184bp,Western-blot法成功检测出约53kDa ICP27蛋白的表达。结论:本实验成功构建了新型单纯疱疹病毒II型DNA疫苗,并可在真核细胞中表达,为下一步研究该疫苗的免疫学效应打下坚实基础。
周朋[6]2009年在《单纯疱疹病毒2型糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及免疫原性的初步评价》文中研究说明单纯疱疹病毒2型(HSV-2)是线性双链DNA病毒,属于α疱疹病毒亚科,是引起生殖器疱疹的主要病原体。HSV-2感染患者后,病毒移行至感觉神经节中并在背侧根神经节中形成潜伏感染。潜伏感染的病毒的周期性活化将使得患者表现出反复性的临床症状。孕妇感染HSV-2后,常常导致意外流产以及新生儿疱疹。现已证明,HSV-2与HIV的感染有关系,HSV-2将加重HIV感染后的症状。鉴于HSV可以形成潜伏性感染,免疫接种可能是预防HSV-2感染的最好办法。有关HSV-2的疫苗研究,已经就其灭活疫苗,减毒活疫苗,亚单位疫苗以及DNA疫苗等进行了大量的研究,建立相关的动物模型,部分疫苗已经进行临床实验,但是研究结果却不令人满意。虽然目前在HSV-2疫苗研究中存在许多的困难,但是大量的实验结果却为HSV-2疫苗的研究提供了希望,前景还是乐观的。在本研究中,我们将编码HSV-2 gD的基因进行截短,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达HSV-2 gD,采用金属亲和层析纯化重组蛋白。并建立了小鼠模型,将纯化的蛋白通过皮下注射免疫6～8周龄的Balb/c雌性小鼠。检测血清中中和抗体和IgG的水平,为HSV重组亚单位疫苗在小鼠模型中的评价奠定了基础。1 PCR法扩增目的基因,将目的基因插入到pFastBacHTA质粒中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-gD,将重组供体质粒转化DH10BacTM感受态,通过转座获得重组穿梭质粒Bacmid-gD,提取重组穿梭质粒,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,以此病毒为毒种表达目的蛋白,病毒滴度为4.8×107pfu/mL。2使用HisTrap预装柱纯化重组蛋白,超滤浓缩重组蛋白,获得的重组蛋白浓度为546.625μg/mL。目的蛋白的分子量大小介于43.0～63.3 ku之间。3将6～8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分成3组,每组10只,以重组蛋白为抗原,剂量分别为5μg/只和20μg/只,以铝盐为佐剂,在0d、7d、28d分别皮下免疫小鼠,以PBS作为阴性对照,在第7d、21d和42d时采集小鼠血液,分离血清,测定血清中IgG和中和抗体的水平,20μg组略高于5μg组。
韩双艳, 郭勇, 杨慧兰, 王捷, 杨太成[7]2004年在《新型DNA疫苗的构建及其对小鼠保护作用的研究》文中认为目的 :构建新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗 ,检测其激发小鼠产生免疫反应的能力。方法 :RT PCR鉴定单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗在COS 7细胞中的表达 ,ELISA检测血清中中和抗体水平 ,病毒攻击检测其保护效应。结果 :DNA疫苗候选株pVAX gD能在COS 7细胞中表达 ,激发小鼠产生高滴度中和抗体 ,有效保护小鼠免受致死量病毒的攻击。结论 :构建的新型单纯疱疹DNA疫苗是一株很有希望的人用生殖器疱疹疫苗
葛金玲[8]2007年在《IL-18协同单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的免疫学研究》文中提出目的:探讨IL-18分子佐剂在增强gB核酸疫苗抵抗HSV-1感染的免疫保护的作用,为研制新型HSV-1核酸疫苗奠定理论基础。方法:昆明小鼠随机分为叁组,分别接种pcDNA3、pgB和pgB+pIL-18 DNA疫苗,每次接种质粒100μg,每次间隔2周,第3次免疫后2周,用ELISA检测特异性抗体滴度;利用~3H-TdR掺入法进行T细胞特异性抗原刺激实验;耳廓肿胀实验检测迟发型超敏反应(DTH反应);角膜攻击实验检测核酸疫苗肌肉接种小鼠后对小鼠的保护效果。结果:与pgB单独免疫组相比,pIL-18的协同免疫可以显着增强ELISA特异性抗体滴度、血清特异性中和抗体滴度、T细胞增殖反应和DTH反应,在动物保护实验中,pIL-18的协同免疫明显增强了pgB疫苗在病毒攻击时对角膜的保护效果。结论:pgB接种小鼠后可以诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫,并具有免疫保护作用;pIL-18的协同免疫可以显着提高pgB DNA疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫水平,增强核酸疫苗对机体的免疫保护作用。为进一步构建重组疫苗并最终用于单疱病毒性角膜炎的预防奠定理论基础。
邢明伟[9]2007年在《表达AIV H7HA和H9HA基因重组鸭瘟病毒载体的构建与DNA疫苗研究》文中研究指明禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽类感染和／或疾病综合征，自1878年首次于意大利报道以来，目前己普遍存在于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。高致病性禽流感(HPAI)多以突然发病和高死亡率为主要特征，常常导致感染鸡群的全部死亡，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病。本研究首先根据GenBank所发表的AIV H7亚型HA基因的cDNA序列，利用Primer5.0软件，设计一对引物，以本实验室所保存的pMD18-T-H7-HA阳性质粒为模板扩增出H7HA基因；通过RT-PCR技术扩增了禽流感分离株CK／MJ／0823／00(H9N2)的H9亚型HA基因，并进行序列测定与分析。结果表明：经AIV H7亚型HA基因测序和序列分析，H7HA基因由起始密码子到终止密码子的核苷酸长为1692bp，编码563个氨基酸残基，与其它17个国内外参考毒株的核苷酸和推导氨基酸同源性比较，核苷酸的同源性为76.3％-84.3％，推导氨基酸同源性为83.3％-93.2％；CK/MJ/0823/00(H9N21分离株H9亚型HA基因测序及序列分析结果为：H9HA基因ORF长为1683bp，编码560个氨基酸残基，与其它17个国内外参考毒株的核苷酸和推导氨基酸同源性比较，核苷酸的同源性为67.1％-95.1％，推导氨基酸的同源性为91.9％-99.7％。将克隆到pMD18-T载体的H7和H9亚型HA基因亚克隆到载体p-3-3.1的多克隆位点中，构建AIV H7HA和H9HA基因的重组克隆载体p-3-3.1-H7-HA和p-3-3.1-H9-HA。接下来分别将鉴定正确的重组质粒p-3-3.1-H7-HA和p-3-3.1-H9-HA用XhoⅠ单酶切，分别回收携带真核表达元件H7HA和H9HA的基因。转移载体质粒pUC-TK2.9-LacZ经XhoⅠ酶切，去磷酸化后回收。再将携带真核表达元件H7HA和H9HA的基因通过XhoⅠ位点亚克隆到含有鸭瘟病毒复制非必需片段的pUC-TK2.9-LacZ转移载体质粒的XhoⅠ位点上，从而分别成功构建携带真核表达元件含有目的基因H7HA和LacZ报告基因及鸭瘟病毒复制非必需区的DPV转移载体质粒和携带真核表达元件含有目的基因H9HA和LacZ报告基因及鸭瘟病毒复制非必需区的DPV转移载体质粒，分别命名为pUC-TK2.9-LacZ-H7-HA和pUC-TK2.9-LacZ-H9-HA。最后将AIV能诱导宿主产生保护性免疫反应的主要抗原基因H7HA和H9HA作为候选基因，以具有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)作为载体，构建了含有以上两种基因的DNA疫苗。将以上构建的两种DNA疫苗转染MDCK细胞进行瞬时表达，结果在转染后48h两种质粒均获得了表达，且表达的蛋白可与抗AIV的抗体发生特异性结合，于荧光显微镜下可见绿色荧光，而质粒pcDNA3.1(+)及未转染质粒的MDCK细胞均未出现荧光，呈阴性反应。体外转染实验表明，两种疫苗质粒均能在体外获得表达，从而为下一步的动物试验提供了必要的前提条件。为了评价所构建的两种DNA疫苗的免疫效果，分别将其以每只鼠10μg的剂量分两点肌肉注射接种6-8周龄BALB／C小鼠，同时以质粒pcDNA3.1(+)和PBS作对照。2周后加强免疫，隔2周后进行第叁次免疫。各组免疫鼠在首次免疫前、后(加强免疫前)、加强免疫后(第叁次免疫前)及第叁次免疫后2周分别采血，用HI和ELISA的方法检测抗体的动态变化，同时检测外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的动态变化。结果显示：(1)免疫前各DNA疫苗免疫组检测不到HI抗体，但免疫后各DNA疫苗组的HI抗体效价迅速升高；(2)ELISA检测结果显示，各DNA疫苗免疫组均不同程度的产生了抗体；(3)各DNA疫苗免疫组在免疫后外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞都有不同程度的升高。通过本研究证实，所构建的DNA疫苗能够诱导BALB／C小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。本研究克隆了AIV H7亚型HA基因和CK／MJ／0823／00(H9N2)分离株H9亚型HA基因，利用基因重组技术分别构建了含有H7HA和H9HA基因的重组鸭瘟病毒转移载体；又将AIV H7HA和H9HA基因分别插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中，从而分别成功构建了含有AIV H7HA和H9HA两种保护性抗原基因的DNA疫苗并进行了体外瞬时表达和动物体内接种试验。总之，通过本研究将为水禽流感病毒病的诊断试剂和疫苗研制提供科学的实验依据，奠定良好的技术基础和物质储备。
李光源, 贺冰, 冯非, 孟祥俊, 宋忆淑[10]2005年在《单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的构建及细胞免疫学研究》文中认为目的:构建、制备单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVⅠ)糖蛋白BDNA疫苗,检测其诱导机体产生的细胞免疫应答。方法:PCR扩增编码HSVⅠgB去除N端部分信号肽序列(39bp)的基因片段(2673bp),定向插入pcDNA3载体中,构建pcDNA3gB基因疫苗并对其进行PCR、酶切及测序鉴定。于BALBc小鼠注射免疫3次,观察小鼠CD4+、CD8+T细胞亚群的变化,CFSEPI双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果:双酶切分析结果为目的基因(2.7kb)和线性质粒pcDNA3(5.4kb);PCR扩增结果为特异产物(2.7kb);测序结果与GenBankgB基因序列同源性达99.5%;CTL活性增强;BALBc小鼠脾CD4+T细胞增加。结论:经鉴定证实了HSVⅠgB基因疫苗的构建;HSVⅠgB基因疫苗可以诱导较强的细胞免疫应答,应用于预防HSVⅠ的感染具有良好的前景。
参考文献：
[1]. 单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的构建及免疫学性质研究[D]. 韩双艳. 华南理工大学. 2004
[2]. 单纯疱疹病毒Ⅱ型CTL表位gD DNA疫苗的构建及免疫学性质研究[D]. 关蕾. 第一军医大学. 2006
[3]. 一种新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的构建及其初步研究[C]. 何方, 洪艳, 陈勇. 2007年浙江省医学病毒学、医学微生物与免疫学学术年会论文汇编. 2007
[4]. 单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的构建及初步免疫学研究[D]. 孟祥俊. 吉林大学. 2004
[5]. pcDNA3.1（+）/ICP27重组HSV-2DNA疫苗的构建及在真核细胞中的表达[D]. 梁宁. 华中科技大学. 2011
[6]. 单纯疱疹病毒2型糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及免疫原性的初步评价[D]. 周朋. 西北农林科技大学. 2009
[7]. 新型DNA疫苗的构建及其对小鼠保护作用的研究[J]. 韩双艳, 郭勇, 杨慧兰, 王捷, 杨太成. 激光生物学报. 2004
[8]. IL-18协同单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的免疫学研究[D]. 葛金玲. 吉林大学. 2007
[9]. 表达AIV H7HA和H9HA基因重组鸭瘟病毒载体的构建与DNA疫苗研究[D]. 邢明伟. 东北林业大学. 2007
[10]. 单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的构建及细胞免疫学研究[J]. 李光源, 贺冰, 冯非, 孟祥俊, 宋忆淑. 中国免疫学杂志. 2005