杜华[1]2003年在《紫外辐射对人角质形成细胞的细胞周期调控的影响》文中指出目的 建立紫外辐射损伤人角质细胞(HaCaT细胞株)的模型。研究UVB对细胞周期的进程和细胞凋亡情况，并研究了维生素E(VE)对紫外照射的保护作用以及相关基因p53和bc1-2在这些作用下的表达。方法采用细胞培养、MTT染色法、流式细胞技术、western蛋白免疫印迹法等技术观察不同剂量UVB照射下培养不同时间后的HaCaT细胞存活率、细胞周期分布及凋亡的发生以及加入抗氧化剂后的情况，以及上述情况下p53、bc1-2表达的变化。结果 1．UVB剂量不同，培养时间相同时，随剂量增加，存活率逐渐减少；照射剂量相同，培养时间不同时，随时间延长，细胞存活率下降到最低值后有恢复(照射15min除外)。2．细胞周期结果分析表明：小于5min的UVB照射剂量，随着细胞培养时间的延长，细胞增殖指数：{(S+G2)／(G1+S+G2)}不断提高；大于或等于5min的照射剂量，随培养时间延长细胞增殖指数逐渐减少。UVB以时间剂量依赖方式抑制HaCaT细胞增殖能力。3．无论是从形态学还是流式细胞图我们发现HaCaT细胞在正常情况下也存在细胞凋亡。4．随UVB剂量增加，培养时间相同时，凋亡率逐渐增加；照射剂量相同，随培养时间延长，凋亡率也逐渐增加。5．VE对UVB照射所致的HaCaT细胞生长抑制有保护作用，40μg／ml为VE最佳剂量并且予照射前和照射前后加入保护作用更佳。6．加入VE后对UVB照射后的PI值明显升高，细胞凋亡率降低了约50％。7．UVB诱导HaCaT细胞中p53和p-p53(Ser15)的表达增强，p53在照射后12h达峰值；p-p53的表达维持12h。bc1-2表达显着降低，照射后24h内都维持较低水平。8．VE的加入使UVB诱导HaCaT细胞中p53基因表达下降，检测不到p-p53(Ser15)的表达。而bc1-2表达量增加，随培养时间延长bc1-2逐渐下降。结论UVB在一定的照射剂量和培养时间内抑制人角质细胞的生长。UVB诱导HaCaT细胞发生G1期为主的细胞周期阻滞以及细胞凋亡。VE对此有拮抗作用。p53、p-p53(Ser15)和bc1-2的基因表达在UVB诱导的损伤反应中起一定作用。bc1-2参与了VE对UVB的损伤保护作用。
廖意[2]2016年在《CIRP抑制低剂量UVB诱导的角质细胞生长阻滞及凋亡作用的分子机制研究》文中指出越来越多的证据表明紫外线(UV)造成的皮肤损伤增加了皮肤癌发生的风险。皮肤癌包括基底细胞癌、鳞状细胞癌以及皮肤恶性黑色素瘤,其中基底细胞癌和鳞状细胞癌一类的非黑色素瘤皮肤癌占了皮肤癌发病的大多数。UVB过度暴露会造成细胞DNA损伤并诱导激活细胞内多种信号通路,例如细胞生长抑制以及细胞凋亡。这些信号通路的激活在决定UVB照射后细胞命运的过程中扮演重要角色。但是UVB,特别是长期低剂量UVB照射诱导皮肤癌发生的分子机制尚在研究之中。冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)在UV诱导仓鼠细胞DNA损伤的过程中首次被发现。它属于冷休克蛋白家族(CSPs)中的一员,并能够在响应冷刺激过程中起RNA分子伴侣的作用。正常细胞应激响应时,CSPs能够从细胞核转移至细胞质中,并辅助应激状态下细胞质中的翻译进程。研究报道CIRP能够保护细胞免受TNFα和具有遗传毒性的逆境诱导的细胞生长阻滞和细胞凋亡,同时还能通过p53信号通路抑制DNA损伤诱发的细胞凋亡。研究还报道CIRP与炎症反应以及多种肿瘤发生有密切的联系。另外,最新的研究证明肝脏细胞中CIRP的表达水平与信号转导和转录激活因子3(Stat3)的表达水平正相关,而Stat3调节多种细胞信号通路,包括细胞周期、细胞凋亡以及肿瘤血管生成等。研究普遍认为Stat3的磷酸化激活(p-Stat3)在紫外线过度暴露后皮肤癌发生过程中起十分关键的作用。UVB通过磷酸化Stat3蛋白705位点上的Tyr残基来激活Stat3。研究发现组成型激活Stat3多与人类肿瘤以及癌细胞密切相关。但是CIRP与p-Stat3对UVB照射后的角质细胞的调节功能还有待阐明。在本文中,我们主要研究了UVB照射处理后CIRP在调控细胞生长阻滞,细胞凋亡以及角质细胞转化中的作用,主要实验结论如下:(1)CIRP蛋白在所有测试的黑色素瘤以及非黑色素瘤皮肤癌细胞系中都表达上调;并且低剂量UVB(<5 mJ/cm2)偶发或长期照射处理都能诱导角质细胞上调CIRP的表达水平,而高剂量UVB(50 mJ/cm2)偶发照射处理却降低了CIRP在细胞中的表达水平;同时我们观察到低剂量UVB诱导CIRP上调的同时伴随着其从细胞核向细胞质中转移。(2)UVB诱导的CIRP表达上调或是过表达CIRP都增强了角质细胞对UVB诱导细胞生长阻滞及细胞死亡的抗性;siRNA瞬时沉默或是shRNA稳定沉默CIRP基因都增强了角质细胞对低剂量UVB照射处理的敏感性。(3)我们的实验结果还证明CIRP的表达对低剂量UVB诱导Stat3的磷酸化激活是必须的,但是CIRP的表达变化不改变Stat3的表达总量;p-Stat3的表达与两个已知的Stat3下游基因cyclin D1和VEGF的表达水平有关。同样,凋亡调控因子Bag-1/S的表达也与p-Stat3的表达密切相关。(4)利用S3I-201抑制Stat3的磷酸化激活,致使p-Stat3与Bag-1/S的表达量降低,同时伴随着UVB照射后细胞存活和增值能力的下降;稳定过表达Bag-1/S能够部分削弱S3I-201对低剂量UVB照射后细胞存活和增殖能力的抑制作用。(5)我们的数据还表明虽然siRNA沉默CIRP或Bag-1基因对无UVB照射处理的角质细胞中裂解PARP/PRAP的比例以及Caspase-3的激活没有影响,但是却能明显增强UVB照射处理后细胞中裂解PARP/PRAP的比例以及活化的Caspase-3的表达量。此外,稳定过表达Bag-1/S能够完全抑制UVB诱导的PARP裂解以及Caspase 3的激活。根据以上结果我们提出CIRP-p(Tyr705)-Stat3信号通路,通过分别调控cyclin D1和Bag-1/S来调控UVB照射处理后细胞的增殖和存活。本实验研究加深了我们对CIRP在低剂量UVB致癌过程中的作用的理解,研究结果证实CIRP能够作为一个新的干预低剂量UVB诱导皮肤癌形成的靶点,可以为开发皮肤癌防御和治疗的药物方法提供研究基础,并具有临床指导意义。
赵慧慧[3]2014年在《扇贝多肽经由P16和RASSF1A基因甲基化抑制UVB诱导的HaCaT细胞恶性转化》文中研究说明目的建立模拟日光紫外线B辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化的病理模型,从Gadd45a、DNMTs、P16和RASSF1A基因甲基化的角度,研究扇贝多肽(PCF)抑制UVB诱导的HaCaT细胞恶性转化的分子机制,为扇贝多肽防治UVB辐射致皮肤癌提供理论依据。方法采用CCK8法筛选并确定UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化的单次辐射剂量,Gimsa染色观察细胞形态初步确立UVB辐射诱导HaCaT细胞恶性转化的终点,软琼脂克隆形成实验、明胶酶谱法检测MMP-9蛋白酶的分泌证明UVB辐射诱导HaCaT细胞恶性转化模型的成功。实验设计分为4组：正常对照组、UVB模型组、UVB+2.84mmol/LPCF, UVB+2.84mmol/L维生素C阳性对照组。经平板集落形成实验,软琼脂集落形成实验,流式细胞术检测细胞周期确立PCF对UVB诱导的HaCaT细胞恶性转化的抑制作用；RT-PCR检测甲基转移酶DNMTs(DNMT1、DNMT3a, DNMT3b)mRNA经时(UVB辐射4、8、16、20次)表达；蛋白印迹法检测GADD45a, DNMT3b, P16及RASSFIA蛋白经时(UVB辐射4、8、12、16、20次)表达。以高分辨率溶解曲线(MS-HRM)检测PCF对处于UVB诱导的HaCaT细胞恶性转化各阶段(4次、12次、20次)中P16、RASSF1A基因甲基化的程度。结果UVB(波长峰值297nm)照射的辐照强度约在1luw/cm2,单次辐射剂量10mJ/cm2,辐射次数20次,总辐射剂量200mJ/cm2时,成功建立UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化模型；2,84mmol/LPCF比VC更明显抑制UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化(P<0.05)。DNMT1和DNMT3amRNA的经时表达显示UVB辐射HaCaT细胞DNMT1和DNMT3a的表达量与辐射前相比差异无统计学意义(I>0.05); DNMT3b的mRNA和蛋白的表达呈现逐渐升高的趋势,UVB辐射20次后其表达量达到高峰(P<0.05); Gadd45a蛋白经时变化显示UVB辐射4次时即可检测表达量达到高峰,随后表达量逐渐下降,UVB辐射20次后蛋白表达到低谷(P<0.05)；P16和RASSF1A蛋白经时变化显示UVB辐射后表达量逐渐下降,UVB辐射20次后蛋白表达到低谷(P<0.05)；PCF和VC均可抑制P16和RASSFIA基因的甲基化(P<0.05),促进P16, RASSFIA和GADD45a蛋白的表达(P<0.05),抑制DNMT3b蛋白的表达(P<0.05)且与VC相比,PCF效果更显着(P<0.05)。结论国际上首次建立模拟日光紫外线B辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化模型,揭示P16和RASSFIA基因的高甲基化与HaCaT细胞恶性转化密切相关。证明扇贝多肽通过调节DNMT3b和GADD45a基因表达而抑制P16和RASSF1A基因的高甲基化,阻上UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化。
康顺爱[4]2009年在《姜黄素抗紫外线辐射损伤保护作用及其机制》文中研究说明紫外线(ultraviolet, UV)主要作用于皮肤,其中中波紫外线(ultraviolet B, UVB)主要通过生成活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基损伤表皮的角质形成细胞,导致细胞氧化应激反应,诱导细胞凋亡是UVB辐射氧化损伤细胞的最终结局。天然植物姜黄素(curcumin, Cur)的化学结构是由两个邻甲基化的酚和1个β-二酮组成,是多羟基酚类化合物,能够增加机体的抗氧化酶含量,如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等,这些抗氧化酶可通过增强机体的抗氧化能力清除ROS自由基,从而降低紫外线辐射引起的氧化损伤作用;Cur还具有防止膜脂质过氧化作用,维护线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψ)的稳定性,阻止其释放细胞色素c(cytochrome c, Cyt c),通过调节凋亡相关蛋白如Bcl-2、Bax和caspase-3的表达,进而达到对机体的保护作用。本研究通过UVB辐照诱导人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)氧化损伤模型的建立,探讨Cur抗紫外线辐射损伤保护作用及其机制。实验结果表明,UVB辐照损伤HaCaT细胞的存活具有时间和剂量依赖性,即随着辐照剂量的加大和培养时间的延长,HaCaT细胞的存活率显着降低;细胞的凋亡率随着辐照剂量的加大而显着提高;UVB辐照后可显着增加细胞中的ROS、一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,提高乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量和胞浆游离钙离子浓度(concentration of free intracecellular calcium, [Ca2+]i),同时降低SOD和GSH-Px含量和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψ)。揭示了UVB辐照通过提高细胞氧化应激反应和脂质过氧化水平而破坏线粒体膜结构,从而增加了线粒体膜的通透性。同时,UVB辐照增加了促凋亡蛋白Bax、Cyt c和caspase-3的表达量,降低了抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量,揭示了线粒体内凋亡相关蛋白的表达及其mRNA水平变化与凋亡发生之间的规律,通过启动线粒体凋亡途径和caspase-3凋亡途径,使细胞凋亡增加。UVB辐照HaCaT细胞后立即加入Cur,细胞的ROS、NO、NOS及MDA含量和LDH漏出量显着降低,并可显着提高HaCaT细胞的存活率和SOD及GSH-Px含量,表明Cur可抑制ROS自由基的生成和提高抗氧化酶活性,从而减轻细胞的氧化损伤;Cur可通过消除细胞周期阻滞,保持细胞周期进程的正常进行,促进细胞的生长;Cur能够提高Δψ和降低[Ca2+]i,维持HaCaT细胞线粒体膜电位的稳定及通透性,减少Cyt c蛋白漏出,降低促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达,增强抗凋亡蛋白Bcl-2表达,从而降低HaCaT细胞凋亡百分率。因此,Cur通过以上各因素的相互调节,达到对HaCaT细胞的保护作用。本研究为Cur的基础研究和临床应用及药物的开发利用提供了理论和实验依据,同时也进一步为辐射损伤的防护提供了重要的实验依据。
吴晓萍[5]2007年在《人皮肤角质形成细胞的蛋白质组学研究》文中指出本论文建立了人皮肤角质形成细胞(Keratinocyte，KC)和人皮肤表皮蛋白质组学研究的核心技术平台，并在此基础上，分别从时间、病理状态(银屑病)和角质形成细胞特异的细胞因子(人成纤维细胞生长因子7和人成纤维细胞生长因子10，即hFGF-7和hFGF-10)刺激等叁个层面对人皮肤角质形成细胞蛋白质组的影响进行了初步研究，为阐明体外长期培养对人皮肤角质形成细胞影响的可能机制、皮肤病(银屑病)的发病机制、以及角质形成细胞特异的细胞因子对人皮肤角质形成细胞作用的可能机制等提供理论依据。第一章长期培养对人皮肤角质形成细胞的影响目的：建立人皮肤角质形成细胞的体外分离、培养和传代的方法，并建立人皮肤角质形成细胞蛋白质组学研究的核心技术平台，探讨体外长期培养对人皮肤角质形成细胞蛋白质组的影响，为进一步研究体外长期培养对人皮肤角质形成细胞影响的可能机制奠定基础。方法：取幼儿环切术后包皮，用DispaseⅡ酶消化法分离表皮，用Defined K-SFM培养基进行体外培养，胰酶和EDTA联合消化传代，相差显微镜下观察培养细胞的形态，采用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定，并用细胞计数法测定原代到第7代细胞的群体倍增时间(PDT)。制备原代和第7代体外培养的人皮肤角质形成细胞的总蛋白样品，采用非线性IPG预制胶条(pH3-10，17cm)进行第一维等电聚焦，第二维分子量垂直电泳采用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。对双向凝胶电泳的条件进行优化。采用PDQuest图像分析软件对获得的双向凝胶电泳图谱进行比较分析。选取2个原代和第7代角质形成细胞的差异表达蛋白质点，进行胶内酶切、串联飞行时间质谱(ABI 4700 TOF-TOF)分析。利用MASCOT在线检索工具，将质谱检测得到的数据在NCBInr数据库进行检索，并通过半定量RT-PCR对2个差异表达蛋白质的mRNA水平进行检测。结果：体外培养的原代人皮肤角质形成细胞，细胞形态为圆形或椭圆形，随着细胞传代次数的增加，细胞形态发生很大改变：细胞形状不规则，胞核周围出现许多空泡。荧光显微镜下培养细胞的胞浆呈黄绿色，为角蛋白阳性染色。原代细胞的增殖速率较慢，约需10天达到融合，PDT为116小时，传代后细胞增殖迅速，第2、3、4代PDT显着缩短，第5代以后PDT明显延长，细胞增殖速度减慢，第8代细胞长时间不能融合。建立并优化了人皮肤角质形成细胞总蛋白的双向凝胶电泳方法，获得了蛋白质分离效果较好的双向凝胶电泳图谱。采用PDQuest软件对原代和第7代人皮肤角质形成细胞总蛋白的图谱进行分析，得到原代人皮肤角质形成细胞凝胶的匹配蛋白质点数为751，而第7代人皮肤角质形成细胞凝胶的匹配蛋白质点数为806，匹配率分别为75.3％和80.8％。采用串联飞行时间质谱对选取的2个表达量在第7代角质形成细胞中显着下调且分辨率较好的蛋白质点进行质谱分析，获得了相应的肽质量指纹图谱(PMF)，通过MASCOT在线检索工具检索NCBInr数据库，鉴定差异蛋白质1为与脂肪酸运输和代谢相关的PA-FABP，差异蛋白质2为与细胞凋亡调控相关的Galectin-7。最后通过半定量RT-PCR确证第7代角质形成细胞中PA-FABP和Galectin-7的基因转录水平较原代角质形成细胞相应的基因转录水平显着降低，并对PA-FABP和Galectin-7的生物学功能及其在体外长期培养对人皮肤角质形成细胞影响中的可能作用进行了初步分析。结论：成功建立了人皮肤角质形成细胞的体外分离、培养和传代的方法，并建立了人皮肤角质形成细胞蛋白质组学研究的核心技术平台；与原代人皮肤角质形成细胞相比，第7代细胞的PA-FABP和Galectin-7表达下调，提示细胞的脂肪酸运输和(或)代谢可能发生了改变，细胞的凋亡调控能力可能下降。第二章正常和银屑病表皮的蛋白质组学研究目的：建立人皮肤表皮蛋白质组学研究的核心技术平台，应用蛋白质组学的方法研究正常和寻常型银屑病表皮蛋白质组的差异，进而由差异蛋白质推测银屑病发生和发展的可能机制。方法：取正常人环切术后包皮和寻常型银屑病患者皮损区皮肤，用DispaseⅡ酶消化法分离表皮，分别制备正常和寻常型银屑病患者皮损区表皮的总蛋白样品，采用非线性IPG预制胶条(pH3-10，17cm)进行第一维等电聚焦，第二维分子量垂直电泳采用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。采用PDQuest图像分析软件对获得的双向凝胶电泳图谱进行比较分析。选取正常和寻常型银屑病患者皮损区表皮的差异表达蛋白质点，进行胶内酶切、串联飞行时间质谱(ABI 4700 TOF-TOF)分析。利用MASCOT在线检索工具，将质谱检测得到的数据在NCBInr数据库进行检索，并通过半定量RT-PCR对鉴定的差异表达蛋白质aB-Crystallin的mRNA水平进行检测。结果：建立了人皮肤表皮总蛋白的双向凝胶电泳方法，获得了蛋白质分离效果较好的双向凝胶电泳图谱。采用PDQuest软件对正常和寻常型银屑病患者皮损区表皮总蛋白的图谱进行分析，得到正常表皮双向电泳凝胶的匹配蛋白质点数为876，而寻常型银屑病皮损区表皮双向电泳凝胶的匹配蛋白质点数为794，匹配率分别为79.6％和72.2％。采用串联飞行时间质谱对选取的在寻常型银屑病患者皮损区表皮中5个表达量显着上调和1个表达量显着下调的差异蛋白质点进行质谱分析，获得了相应的肽质量指纹图谱(PMF)，通过MASCOT在线检索工具检索NCBInr数据库，鉴定这些差异蛋白质为一些与细胞增殖、凋亡、分化和炎症浸润等相关的蛋白质，其中在寻常型银屑病患者皮损区表皮中表达上调的5个差异蛋白质点分别为：S100 calcium binding protein A7-1ike 1、Psoriasin、αB-Crystallin、Peroxiredoxin 2 isoform b、Transglutaminase 3，precursor，在寻常型银屑病患者皮损区表皮中表达下调的1个差异蛋白质点为溶酶体半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin B。最后通过半定量RT-PCR确证寻常型银屑病患者皮损区表皮中αB-Crystallin的基因转录水平较正常表皮相应的基因转录水平显着升高，并初步探讨了差异蛋白质在寻常型银屑病发生和发展中的可能作用。结论：成功建立了人皮肤表皮蛋白质组学研究的核心技术平台；通过蛋白质组学的方法鉴定的差异表达蛋白质可能与寻常型银屑病角质形成细胞的过渡增殖、自发凋亡减弱和异常分化等密切相关。目的：构建含角质形成细胞特异的细胞因子hFGF-7、hFGF-10基因的重组腺病毒，通过重组腺病毒感染，在人皮肤角质形成细胞株(HaCat)中分泌表达hFGF-7、hFGF-10，并在建立人皮肤角质形成细胞蛋白质组学研究的核心技术平台的基础上，应用蛋白质组学的方法研究hFGF-7、hFGF-10的表达对HaCat细胞蛋白质组的影响，进而由差异蛋白质推测hFGF-7、hFGF-10对HaCat细胞作用的可能机制。方法：用PCR方法合成hFGF-7、hFGF-10基因片断并克隆到pET3c载体上，获得重组质粒pET3c-hFGF-7和pET3c-hFGF-10。分别以获得的两种重组质粒为模板，PCR扩增得到5’末端含BglⅡ位点、3’末端含HindⅢ位点的hFGF-7、hFGF-10基因片断，与穿梭载体pAdTrack-CMV连接，获得的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hFGF-7和pAdTrack-CMV-hFGF-10经PmeⅠ线性化后，通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-hFGF-7和pAdEasy-hFGF-10，经酶切鉴定后转染HEK-293细胞，在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒rAd-hFGF-7和rAd-hFGF-10。用重组腺病毒感染HaCat细胞，Western blotting检测培养上清中的重组hFGF-7、hFGF-10；MTT法检测重组腺病毒对HaCat细胞增殖的影响：重组腺病毒对HaCat细胞周期的影响通过流式细胞术检测。制备四组细胞总蛋白(HaCat、空载体腺病毒Ad感染组、重组腺病毒rAd-hFGF-7感染组和重组腺病毒rAd-hFGF-10感染组)。采用非线性IPG预制胶条(pH3-10，17cm)进行第一维等电聚焦，第二维分子量垂直电泳采用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。采用PDQuest图像分析软件对获得的双向凝胶电泳图谱进行比较分析。选择4个重组腺病毒感染后表达量增加的蛋白质点，进行胶内酶切、串联飞行时间质谱(ABI 4700 TOF-TOF)分析。利用MASCOT在线检索工具，将质谱检测得到的数据在NCBInr数据库进行检索，并通过半定量RT-PCR和Western blotting对其中的差异表达蛋白质VDAC2在四组细胞中的mRNA水平和蛋白质水平进行检测。结果：成功构建了含hFGF-7、hFGF-10基因的重组腺病毒rAd-hFGF-7和rAd-hFGF-10。重组腺病毒可高效感染HaCat细胞，培养上清与hFGF-7、hFGF-10抗体呈阳性反应。重组腺病毒可促进HaCat细胞的增殖，并可改变HaCat的细胞周期，进入S期和G2期的细胞比率增加。获得了蛋白质分离效果较好的双向凝胶电泳图谱。采用PDQuest软件对四组细胞总蛋白的图谱进行分析，得到对照组HaCat细胞和Ad感染组双向电泳凝胶的匹配蛋白质点数为516和535，匹配率分别为67.5％和70.0％；而重组腺病毒rAd-hFGF-7、rAd-hFGF-10感染组双向电泳凝胶的匹配蛋白质点数为602和587，匹配率分别为78.8％和76.8％。采用串联飞行时间质谱对选取的4个重组腺病毒感染后表达量增加的蛋白质点进行质谱分析，获得了相应的肽质量指纹图谱(PMF)，通过MASCOT在线检索工具检索NCBInr数据库，鉴定这些差异蛋白质为一些与细胞凋亡、细胞骨架调控、蛋白质降解等相关的蛋白质，包括：VDAC2、Proteasome alpha 1 subunit，isoform 2、Gelsolin-like capping protein和Protein disulfide isomerase-associated 3 precursor。最后通过半定量RT-PCR和Western blotting在mRNA和蛋白质水平上验证了差异表达蛋白质VDAC2在重组腺病毒rAd-hFGF-7、rAd-hFGF-10感染的HaCat细胞中表达上调，并初步探讨了差异蛋白质VDAC2在hFGF-7和hFGF-10生物学功能中的可能作用。结论：通过细菌内同源重组成功构建了重组腺病毒rAd-hFGF-7和rAd-hFGF-10，制备出的重组腺病毒感染HaCat细胞后分泌表达hFGF-7、hFGF-10，并可促进HaCat细胞的增殖，改变HaCat细胞周期。通过蛋白质组学的方法鉴定的差异表达蛋白质VDAC2可能与hFGF-7，hFGF-10的抗细胞凋亡生物学功能相关。
徐松[6]2017年在《海藻糖对角质形成细胞的非MTOR依赖性自噬调控机制及其抗紫外线损伤效应研究》文中研究表明[目的]紫外线是皮肤常见的应激源。目前紫外线照射如何对角质形成细胞进行自噬调节并不清楚。MTOR蛋白是哺乳动物细胞中的重要信号调节因子。MTOR信号在角质形成细胞中的作用仍不清楚。研究表明海藻糖通过诱导哺乳动物细胞自噬发挥有益作用。然而,无论是海藻糖或其他糖类是否可以诱导角质形成细胞自噬仍未知。自噬诱导剂海藻糖是否具有紫外线保护效应仍未知。[方法]对原代角质形成细胞给予不同剂量UVB照射,在不同的时间点分析自噬流和自噬体形成。UVB照射后,使用雷帕霉素孵育分析自噬抑制是否可以恢复。人角质形成细胞系HaCaT细胞和原代角质形成细胞给予MTOR抑制剂后,分析自噬调控和MTOR信号。分析MTOR抑制剂处理对UVB和UVA暴露后的DNA损伤信号、内质网应激、JNK和凋亡。对HaCaT细胞给予不同浓度的海藻糖处理,孵育至不同的时间点,观测自噬标志性分子事件的变化。进而,分析自噬关键调控信号。给予葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖和山梨醇处理分析自噬调控变化。分析海藻糖处理对UVB损伤的HaCaT细胞的LDH释放、克隆形成以及凋亡活性。[结果]UVB照射抑制人角质形成细胞自噬流,但MTOR信号下调,且雷帕霉素不能恢复自噬抑制。角质形成细胞MTOR信号对MTOR抑制剂雷帕霉素、依维莫司、Torin1和pp242敏感,但MTOR下游信号的调控状态不同。仅有雷帕霉素可以诱导自噬。MTOR信号对UVB不敏感,但对UVA敏感。雷帕霉素、依维莫司或pp242处理不影响UVB所诱导产生的系列细胞事件,包括BIP和PERK下调,组蛋白H2A和JNK激活以及caspase 3和PARP剪切。海藻糖处理增加HaCaT细胞LC3-I向LC3-Ⅱ转换,AO染色阳性囊泡和GFP-LC3点状聚集。说明具有可以诱导自噬。海藻糖处理并没有影响MTOR信号,这表明海藻糖诱导的自噬通过非MTOR依赖性途径。在蔗糖或棉子糖处理的HaCaT细胞中也可以观察到非MTOR依赖性自噬诱导,但在葡萄糖、麦芽糖和山梨醇处理的HaCaT细胞中则不能观测到这种诱导,表明自噬诱导能力不是糖类的共性。虽然海藻糖处理对细胞增殖具有抑制作用,但它对暴露于UVB的细胞具有提高细胞活力和抑制异常克隆形成的作用,并且对UVB诱导的凋亡没有抑制作用。[结论]UVB以非MTOR依赖性方式抑制角质形成细胞自噬。抑制角质形成细胞MTOR信号可以不伴随自噬诱导,在UVB触发的细胞反应中MTOR通路不发挥核心作用。海藻糖、蔗糖和麦芽糖是角质形成细胞的非MTOR依赖性自噬诱导剂。海藻糖在UVB损伤的角质形成细胞中展现了良好的细胞保护效应。
林向飞[7]2005年在《不同剂型的光保护药物对UVB光损伤的干预作用及其对相关调控分子影响的实验研究》文中提出研究背景: 日光中的紫外线(UV),主要为长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。在相同剂量下,UVB的光损伤作用比UVA约大800-1000倍。UVB辐射可导致自由基及活性氧的形成,引起细胞因子产生于分泌,局部及系统免疫抑制,细胞DNA损伤及突变频率增加,甚至导致皮肤光老化及皮肤癌肿。皮肤的角质形成细胞是紫外线照射的重要靶位,表皮是抵抗紫外线作用的第一道防线。UVB辐射可引起表皮细胞DNA损伤,产生光损伤产物,主要为6-4光产物((6-4)PPs)和环丁烷嘧啶二聚体(CPDs),随后光照细胞对光损伤产物主要通过核苷酸切除修复(NER)进行切除修复。在切除修复过程中,涉及到细胞周期阻滞延长,30多种基因的参与,其中p53、PCNA、RPA等调控基因表达对上述变化至关重要。西药中维生素E和传统中药黄芩、川芎及绿茶提取物茶多酚(tea polyphenols,TP)中的主要活性成分没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechingallate,EGCG)等有着广泛的生物学效应,如吸收紫外线、抗过氧化及抗肿瘤等作用,但对UVB辐射后光产物生成和清除的影响以及对调控基因的作用影响如何至今未见报道。纳米制剂具有粒径较小,载药及包封率较高,载体材料可以生物降解,毒性极低等特点。纳米亚微粒等技术在药物载体输送系统及药物新剂型
王平[8]2005年在《中波紫外线辐射损伤人角质形成细胞的分子机制研究》文中提出研究背景 表皮主要由角质形成细胞(Keratinocyte,KC)组成,极易受环境因素的损伤。日晒伤细胞(Sunburn cell)是日光中的中波紫外线(ultraviolet B,UVB)辐射损伤的KC。UVB辐射损伤KC主要通过DNA损伤引起的基因毒应激(genotoxic stress)反应,和由于活性氧(reactive oxygen species,ROS)或自由基造成的氧化应激(oxidative stress)反应所致。UVB辐射损伤KC是皮肤癌的主要原因。 细胞周期阻滞(cell cycle arrest)是UVB引发KC应激反应过程中的首发事件。在此期间,受损的KC首先通过启动细胞内复杂而精细的DNA损伤修复系统,以修复因DNA损伤产生的功能基因的突变,这些基因包括维持基因组完整性的管理基因(caretaker genes)和控制细胞增殖和分化的看门基因(gatekeeper genes)。而当DNA损伤严重而修复无望时,则会启动自杀性信号通路诱导凋亡。凋亡(apoptosis)是KC受UVB辐射损伤后,最后也是最重要的保护性应激反应。如果受UVB辐射损伤的KC不能被凋亡清除,带有功能基因异常的KC发生克隆性增生,则会诱发皮肤癌。 UVB辐射损伤KC的应激反应涉及到多种分子事件和信号传导通路。如在KC凋亡过程中的凋亡信号的级联传导;抑癌基因p53及其下游分子对KC细胞周期阻滞和凋亡的调控;核转录因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)对KC的应激反应的转录调控;细胞
程若城[9]2007年在《雌二醇拮抗紫外线所致大鼠表皮角质形成细胞损伤作用的研究》文中指出随着工业生产不断扩大和环境污染不断加剧,排入环境中能够破坏臭氧层的物质不断增加,造成大气中的臭氧层被破坏,大气臭氧层的厚度日趋稀薄,到达地面的紫外线强度日益增加,加之人们越来越崇尚户外运动,接触紫外线的机会也越来越多。日光中的紫外线是引起皮肤日晒伤、老化和皮肤肿瘤的主要环境因素。表皮主要由角质形成细胞组成,极易受环境因素的影响。紫外线中易导致角质细胞损伤的波段主要是B段紫外线(UVB),波长300—400 nm。UVB辐射损伤角质形成细胞是皮肤癌的主要原因之一。雌激素具有多方面的生理功能,如预防动脉粥样硬化、冠心病和骨质疏松等。同时许多研究提示雌激素对皮肤有着深远的影响。绝经妇女补充雌激素能够显着增加皮肤中胶原蛋白含量、皮肤厚度、弹性和水含量。但是目前关于雌激素对紫外线所致的皮肤细胞氧化损伤和凋亡方面影响的研究尚少,其作用机制也待进一步探讨。本实验通过体外培养原代大鼠角质细胞并以UVB对其进行照射,观察雌二醇拮抗UVB对照射后细胞氧化损伤及凋亡程度的影响。本实验结果表明,雌二醇有明显拮抗紫外线所致的氧化损伤和抗凋亡作用。
刘文丽[10]2011年在《过表达microRNA-23a对急性UVB照射所致皮肤光损伤干预作用及其相关靶基因预测结果验证的研究》文中研究表明研究背景和目的:紫外线(UV)辐射是皮肤癌发病病因中重要的环境因素,在相同剂量下,UVB(290-320nm)的光损伤作用比UVA约大800-1000倍,因此日光辐射的致癌效应主要归因于UVB部分。中药黄芩的主要活性成分黄芩苷是有着广泛生物学效应的黄酮类抗氧化剂,具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用。本实验小组既往研究表明黄芩苷能明显减轻UVB照射引起的小鼠表皮DNA损伤并加速光产物清除,此外外用黄芩苷可拮抗单次大剂量UVB照射造成的红斑、水肿及真皮炎症细胞浸润,从而提示黄芩苷可能对紫外线诱导的皮肤肿瘤形成具有一定的拮抗作用。然而既往研究均建立在单次UVB照射的条件下,黄芩苷是否对反复UVB照射造成的小鼠皮肤损伤具有拮抗作用,并且其可能的抗光损伤作用机制尚未被彻底阐述。COX-2是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶,具有促细胞增殖作用,参与多种癌前病变和恶性肿瘤的发生发展。Ki-67和PCNA与细胞有丝分裂密切相关,是细胞周期相关核抗原,可作为评价细胞增殖状态的指标。本部分研究以C57BL/6小鼠为实验对象,参照Katiyar等人以及本研究小组的既往研究,采用180mJ/cm2剂量UVB隔天照射一次、共10次的方法建立反复UVB照射损伤的动物模型,并外用黄芩苷溶液预处理背部照射区,采用HE染色、免疫组化及Western blot等多种方法观察黄芩苷对反复UVB照射后小鼠表皮厚度、COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表达的影响,研究其抗光损伤作用的可能机制。方法:1.以6周龄大的雌性C57BL/6小鼠为研究对象,随机分为对照组、UVB组、黄芩苷组和黄芩苷+UVB组,其中,UVB组和黄芩苷+UVB组小鼠用180mJ/cm2 UVB照射背部皮肤,隔天1次,共10次;黄芩苷组和黄芩苷+UVB组小鼠于照射前30分钟在背部预照射区涂抹丙酮溶解的黄芩苷溶液(1mg/cm2)。末次UVB照射后24小时处死小鼠,取其背部皮肤以备后续实验;2.取小鼠背部皮肤切片,HE染色观察皮肤病理变化;3.取小时背部皮肤切片,免疫组织化学法观察皮肤组织中COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表达的变化;4.取小鼠背部皮肤,分离提取组织总蛋白,Western blot法检测皮肤组织中COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表达的变化。结果:1黄芩苷减轻UVB照射所致小鼠皮肤病理变化UVB照射诱导小鼠表皮层厚度增加,约5-8层角质形成细胞厚度,真皮乳头水肿,局灶性真皮浅血管周围有以淋巴细胞为主的单一核细胞浸润。黄芩苷可减轻UVB照射引起的组织病理改变,表现为表皮层增厚受抑制,厚度仅3-5层角质形成细胞,真皮层水肿及单核细胞浸润减轻;2黄芩苷降低UVB照射所致COX-2蛋白的表达自然状态下COX-2在对照组和黄芩苷组组织中呈低水平表达。UVB照射后COX-2阳性细胞数明显增加且蛋白表达水平升高,阳性细胞数达78.36±13.03%。黄芩苷+UVB组小鼠背部皮肤中COX-2阳性细胞数较单纯UVB照射组明显减少且蛋白表达水平降低,阳性细胞数仅为56.30±8.83%。黄芩苷+UVB组中COX-2蛋白表达水平虽然仍高于对照组,但较UVB组低,与UVB组比较差异具有统计学意义(P<0.05),提示照光前局部使用黄芩苷可抑制UVB照射引起的COX-2蛋白表达水平增加;3黄芩苷降低UVB照射所致Ki-67蛋白的表达自然状态下Ki-67在对照组和黄芩苷组组织中呈低水平表达。UVB照射后Ki-67阳性细胞数明显增加且蛋白表达水平升高,阳性细胞数达57.83±9.71%。黄芩苷+UVB组小鼠背部皮肤中Ki-67阳性细胞数较单纯UVB照射组明显减少且蛋白表达水平降低,阳性细胞数仅为38.69±11.76%。黄芩苷+UVB组中Ki-67蛋白表达水平虽然仍高于对照组,但较UVB组低,与UVB组比较差异具有统计学意义(P<0.05),提示照光前局部使用黄芩苷可抑制UVB照射引起的Ki-67蛋白表达水平增加;4黄芩苷降低UVB照射所致PCNA蛋白的表达自然状态下PCNA在对照组和黄芩苷组组织中呈低水平表达。UVB照射后PCNA阳性细胞数明显增加且蛋白表达水平升高,阳性细胞数达62.48±8.73%。黄芩苷+UVB组小鼠背部皮肤中PCNA阳性细胞数较单纯UVB照射组明显减少且蛋白表达水平降低,阳性细胞数仅为42.83±10.37%。黄芩苷+UVB组中PCNA蛋白表达水平虽然仍高于对照组,但较UVB组低,与UVB组比较差异具有统计学意义(P<0.05),提示照光前局部使用黄芩苷可抑制UVB照射引起的PCNA蛋白表达水平增加。结论:黄芩苷可减轻反复UVB照射所致的小鼠表皮增厚、水肿及真皮炎细胞浸润等损伤,同时降低小鼠表皮中COX-2、Ki-67及PCNA的表达,抑制UVB照射诱导的细胞增殖。提示黄芩苷可通过抑制UVB诱导的表皮细胞过度增生而发挥抗光损伤作用。研究背景和目的:microRNA(miRNA)是广泛存在于生命体中的一种正常调节机制,通过与靶mRNA的3’UTR(3’-untranslated region)碱基配对引导基因沉默复合物(RISC)抑制mRNA翻译或直接使其降解,使基因在转录后水平产生沉默,调控基因表达。miRNAs参与了动植物许多复杂的生命过程,包括细胞发育、器官生成、细胞凋亡、细胞增殖及肿瘤形成等。近来环境致癌物导致生物体miRNA表达发生变化的研究屡见报道,然而目前尚无关于抗光损伤药物miRNA靶位点的研究报告。发现并寻找出抗光损伤药物的核酸靶位点,对理解光源性皮肤损伤的发生机制有着重要意义,并对开发防治紫外线光损伤产品具有重要价值。本实验小组前期工作已在体内外实验中证实了黄芩苷可减轻UVB诱导的一系列皮肤光源性损伤,特别是黄芩苷可减少UVB照射后小鼠皮肤及人成纤维细胞中光产物环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)的产生,并加速其清除。此外我们还用microRNA基因芯片技术筛选出对照组,UVB组以及黄芩苷+UVB组叁组小鼠皮肤中差异表达的miRNAs,发现与对照组相比,UVB照射后小鼠皮肤中miRNA上调基因3个,下调基因3个。与UVB组相比,miR-23a是黄芩苷处理后唯一上调的miRNA,定量PCR方法也验证了芯片检测结果。miR-23a是近年来研究较多的miRNA之一,是一种发挥类似癌基因或抑癌基因作用的miRNA。miR-23a作为黄芩苷处理后特异性上调表达的miRNA,提示miR-23a可能是参与黄芩苷抗光损伤作用的上游调节机制,然而目前尚无miR-23a在紫外线皮肤光损伤中作用的研究报告。miRNA mimics(模拟物)是根据成熟的miRNA设计的双链分子,已完成去保护、退火和纯化等处理过程,为即用型产品,具有稳定性好、可重复性强等优点。它模拟内源成熟miRNA的功能,可以增强内源miRNA的沉默作用,用于功能获得性研究。本实验中我们采用化学合成的miR-23a mimics转染HaCaT细胞的方法,观察过表达miR-23a对急性UVB照射所致皮肤光源性损伤的干预作用,并采用生物信息学分析预测其可能调控的靶基因,再通过文献查阅确定其发挥抗光损伤作用的可能靶基因,最后结合双荧光素酶报告基因实验和Western blot法通过检测miR-23a对其靶基因的影响验证生物信息学的靶基因预测结果。方法:1.以HaCaT细胞为研究对象,随机分为对照组、UVB组、miR-23a Negative Control(阴性/空载对照)+UVB组和miR-23a mimics +UVB组,利用转染试剂将化学合成的miR-23a mimics/ Negative Control分别转染HaCaT细胞后接受30 mJ/cm2 UVB照射;2.MTT法检测HaCaT细胞增殖活性;3.流式细胞仪检测HaCaT细胞细胞周期及细胞凋亡率;4.免疫荧光法、免疫印迹法检测HaCaT细胞中光产物CPDs的清除情况;5.利用在线数据库targetscan预测miR-23a可能调控的下游靶基因,对所有靶基因进行基因本体论分析(GO-Analysis)和生物学通路预测,并通过文献检索选取与光损伤相关的靶基因拓扑异构酶Ⅰ(Top1)作为进一步研究对象; 6.构建融合靶基因Top1 3’UTR的双荧光素酶重组质粒,检测过表达miR-23a对Top1报告基因荧光素酶活性的影响; 7. Western blot法检测过表达miR-23a对UVB照射所致Top1蛋白表达的影响。结果:1过表达miR-23a减轻UVB照射对HaCaT细胞增殖活性的抑制30 mJ/cm2 UVB照射0、24、48和72小时后HaCaT细胞增殖活性下降,但转染miR-23a mimics预处理的HaCaT细胞在相同剂量UVB照射后的各个观测时点细胞增殖活性均明显高于单纯UVB组,提示过表达miR-23a可减轻UVB照射对细胞增殖活性的抑制作用;2过表达miR-23a减轻UVB照射所致HaCaT细胞周期阻滞和细胞凋亡HaCaT细胞在30 mJ/cm2 UVB照射后24小时大量停留在细胞周期的S期,即发生S期阻滞现象,而miR-23a mimics+UVB组S期细胞数量较UVB组明显减少,提示转染miR-23a mimics预处理可明显抑制S期阻滞发生;同时UVB照射后24小时,HaCaT细胞凋亡率升高至12.94%,说明UVB照射可诱导HaCaT细胞凋亡,而miR-23a mimics+UVB组的细胞凋亡率为仅1.46%,相对单纯UVB照射组明显减少,提示过表达miR-23a可抑制UVB照射引起的细胞凋亡;3过表达miR-23a加速HaCaT细胞中UVB照射所致光产物CPDs的清除HaCaT细胞经30mJ/cm2 UVB照射后,细胞核内立刻开始产生CPDs,在UVB照射后的各个观测时点(0、2、6和8小时),免疫荧光法和免疫印迹法结果均显示miR-23a mimics+UVB组HaCaT细胞核内CPDs的清除速度较单纯UVB照射组快,提示过表达miR-23a可加速HaCaT细胞中UVB照射所致光产物的清除;4关于miR-23a的生物信息学分析经在线数据库及基因本体论预测分析显示miR-23a排在前五位的预测靶位点是FUT9、ETNK1、RAB39B、KIAA1467和TOP1,它们主要与信号转导、DNA复制、物质代谢以及核苷酸代谢有关。Top1被预测是miR-23a调控的保守靶位点之一,经文献检索发现其在DNA修复中发挥一定作用;5过表达miR-23a降低Top1报告基因的荧光素酶活性在双荧光素酶报告基因实验中,miR-23a mimics和野生型双荧光素酶重组质粒共转染293T细胞后,Top1报告基因的荧光素酶活性较阴性转染组降低,仅为阴性转染组的45%,说明miR-23a可通过与Top1 3’UTR特异性结合降低报告基因的荧光素酶活性;6过表达miR-23a降低UVB照射后Top1蛋白的表达UVB照射后Top1蛋白表达增加,而miR-23a mimics+UVB组Top1蛋白的表达低于单纯UVB照射组,提示转染miR-23a mimics预处理可抑制UVB诱导的Top1蛋白表达增加。结论:过表达miR-23a可减轻UVB诱导的细胞生长抑制、细胞凋亡及细胞周期阻滞,并加速光产物CPDs的清除。与DNA损伤修复有关的Top1是miR-23a调控的靶基因之一,miR-23a通过调控Top1的表达发挥抗紫外线光损伤作用。miR-23a可能成为治疗皮肤光源性损伤及光源性皮肤病的新靶点。
参考文献：
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[2]. CIRP抑制低剂量UVB诱导的角质细胞生长阻滞及凋亡作用的分子机制研究[D]. 廖意. 重庆大学. 2016
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[4]. 姜黄素抗紫外线辐射损伤保护作用及其机制[D]. 康顺爱. 吉林大学. 2009
[5]. 人皮肤角质形成细胞的蛋白质组学研究[D]. 吴晓萍. 暨南大学. 2007
[6]. 海藻糖对角质形成细胞的非MTOR依赖性自噬调控机制及其抗紫外线损伤效应研究[D]. 徐松. 北京协和医学院. 2017
[7]. 不同剂型的光保护药物对UVB光损伤的干预作用及其对相关调控分子影响的实验研究[D]. 林向飞. 南京医科大学. 2005
[8]. 中波紫外线辐射损伤人角质形成细胞的分子机制研究[D]. 王平. 南京医科大学. 2005
[9]. 雌二醇拮抗紫外线所致大鼠表皮角质形成细胞损伤作用的研究[D]. 程若城. 吉林大学. 2007
[10]. 过表达microRNA-23a对急性UVB照射所致皮肤光损伤干预作用及其相关靶基因预测结果验证的研究[D]. 刘文丽. 南京医科大学. 2011
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