王东根[1]2003年在《关于我国人类肝脏蛋白质组研究策略探讨》文中提出随着人类基因组计划的逐步完成，人类蛋白质组研究已经成为21世纪生命科学领域的主要任务和焦点之一。国际人类蛋白质组组织于2001年成立，提出“人类蛋白质组计划”，2002年，该组织正式宣布启动由中国领导的“国际人类肝脏蛋白质组计划”。为了发挥我国在该计划中的主导作用，全面保障计划的启动与实施，同时推动我国人类蛋白质组研究发展，国家科技部拟制定“中国人类肝脏蛋白质组研究计划”，以推动我国人类蛋白质组研究发展。本项研究以文献调研和专家咨询为主，较为系统地概述了蛋白质组研究现状和发展趋势，总结了我国人类肝脏相关蛋白质组研究工作的现状和存在问题，提出了我国人类肝脏蛋白质组研究任务体系和技术体系。运用软科学研究手段，通过专家个人评分和专家综合评议等方法，定性与定量相结合，分析了我国人类肝脏蛋白质组计划优先发展领域和关键技术，并提出了发展策略。 上述研究，为科学制定“中国人类肝脏蛋白质组计划”提出了依据和参考，同时也为同类研究工作提供了借鉴。
孙玉琳[2]2008年在《应用不同蛋白质组研究策略分离鉴定肝脏和胰腺肿瘤相关蛋白》文中研究说明肝脏是机体物质代谢、能量转换和免疫调节的重要器官,生物学、化学致癌因素和遗传因素与肝脏肿瘤,如肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinomas,HCC)的发生发展相关。由于缺乏有效的早期诊断方法,HCC的五年生存率不足10%。虽然甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是目前临床上应用最为广泛的HCC诊断标志物,但是至少20-30%的HCC患者血清AFP水平不升高。因此,目前迫切需要寻找更为敏感和特异或能与AFP联用使用的HCC诊断标志。本研究对比分析不同AFP表达特性的肝癌和正常肝细胞系的蛋白质组成差异,鉴定到166个差异表达蛋白质,从中选择5个蛋白质进行深入的组织学和血清学验证,发现Annexin A2和TGM2(Tissue transglutaminase 2)有可能成为HCC潜在的候选标志分子。同时,参与了人类肝脏蛋白质组计划(Human liver proteomeproiect,HLPP)中健康肝标准和样本采集方法的制定、健康肝标本库的建立和表达谱数据的生物学意义解读等内容,发现表达谱数据充分反映了禁食状态下健康肝脏的生理和代谢特点,为深入研究疾病肝的蛋白质组改变提供了重要的参照数据。胰腺癌是恶性程度极高的实体瘤之一,由于起病隐匿,进展迅速,缺乏早期特异性症状和有效的治疗手段,五年生存率不足5%。目前常用的标志CA19-9灵敏度和特异度不高,诊断价值有限。为寻找新的胰腺癌血清标志,利用无血清器官培养方法,富集并浓缩了胰腺癌细胞分泌、释放到血液中的肿瘤相关蛋白,构建了胰腺癌相关的游离蛋白表达谱。分别在正常胰腺和胰腺导管腺癌中鉴定了150个和533个游离蛋白。生物信息学分析显示,分别有35%和43%的蛋白定位于细胞外和细胞膜,涉及细胞发育、免疫、应激反应等生物学过程,为认识胰腺癌生物学性质及其发生发展机制,发现新的胰腺癌相关标志分子提供重要参考。
宋艳萍[3]2007年在《C57BL/6J小鼠和健康成人肝脏内质网蛋白质表达谱研究》文中研究说明内质网作为内膜系统的核心，具有参与蛋白质合成、转运，糖原分解和脂类、胆固醇合成等功能。肝脏中，内质网还参与内源的疏水代谢产物和异源物质的生物转化。内质网功能的失调能引起细胞的功能异常和一系列疾病。为了深入了解内质网在肝脏中所发挥的重要功能，我们对C57BL/6J小鼠和成人健康肝脏内质网蛋白质组进行了研究。作为人类肝脏蛋白质组计划(Human liver proteome project, HLPP)一部分，本研究采用了联合提取细胞器的策略，可以同时从同一个肝脏匀浆液中获得内质网、胞浆、线粒体、细胞膜和细胞核多种细胞器样本。联合提取细胞器的技术策略一方面可以充分利用样品，尤其是难以获得的临床样本；另一方面可以有利于将来对来自同一匀浆液的各个亚细胞组分进行系统比较。样品的准备是组织来源的亚细胞组分分离的关键，本文首次对新鲜样本、冻存液冻存样本和直接冻存样本提取的细胞器进行了比较，提出了一种备选的除新鲜组织之外的样品准备方案，即冻存的肝匀浆液方式，该方法尤其适合于不方便新鲜获得的临床样本及满足样本建库的需求。另外，我们通过综合评价提出，直接冻存的肝脏组织所提取细胞器不适合用于表达谱研究。在获得了高度富集内质网组分的基础上，我们分别构建了C57BL/6J小鼠和成人健康肝脏内质网的蛋白质表达谱。由于肝脏样本的复杂性和内质网自身组成的多样性，我们有必要选择一种适合分离复杂样本的高通量蛋白质鉴定技术路线。SDS-PAGE结合nano-LC-ESI-MS/MS技术策略，是一种被广泛采用的通量化蛋白质组技术路线。本研究在选用该技术策略基础上，同时引入了质谱分段扫描的分离模式(Gas phase fractionation，GPF)，该模式根据m/z比在肽段水平上对其进行第叁维的分离。结果表明，分段扫描的引入分别从肽段和蛋白质水平上增加了50％的鉴定率，从而有效扩展了内质网蛋白质组。另外对分段扫描所捕捉到的电荷性质进行分析，发现980-1600波段能够有效地捕捉到容易在全波段扫描丢失掉的单电荷肽段。在高通量的3-D蛋白质鉴定技术路线基础上，采用反库评价方法对蛋白质可信度进行评估，在大于95％置信度、双肽段以上匹配的高可信度卡值的标准下，分别有1065、921种蛋白质在小鼠肝脏滑面、粗面内质网中得到鉴定；1254和920种蛋白质在成人肝脏滑面和粗面内质网中得到鉴定。采用本实验室根据Gene Ontology(http://www.ebi.ae.uk/ego/)开发的软件GOfact工具对小鼠肝脏内质网蛋白质表达谱数据进行功能注释，结果显示除内质网所特定的功能模块得到了显着富集外，我们很意外的发现滑面内质网相对富集了钙结合蛋白质。将我们的数据与文献报道的内质网蛋白质组(大鼠分泌途径蛋白质组，1237个蛋白质)进行比较，两者共有662个蛋白质，分别占自身和大鼠数据的53.5％和42.5％。我们推测这部分共有的蛋白质可能是组成型表达蛋白质，对维持内质网的基本生理学功能发挥重要作用。Gene Ontology超几何分析证明了这个推测。分别将两者共有和特有的蛋白质进行进行GOfact超几何分布分析，结果表明结构分析活性和维持细胞稳态的蛋白质在共有蛋白质中显着富集；而应激反应(压力应激、生命物刺激应激和免疫应激)和基因表达调控功能模块在特有蛋白质中富集。提示共有蛋白质相对富集了一些恒定表达的结构蛋白质，而特有蛋白质则相对富集了一些调控型表达的蛋白质或穿梭蛋白质。根据串联质谱的谱图数对鉴定蛋白质进行半定量，已经成为目前广泛采用的蛋白质定量方法之一，在此我们采用了一种基于期望值最大化(EM)校正过质谱谱图计数的方法对所鉴定的蛋白质进行量化。然后采用spearman相关的方法对其分别在粗面、滑面和胞浆中的定量分布进行聚类。结果分别发现了一批与粗面、滑面和胞浆标志性蛋白共聚类的蛋白质，根据Swiss-Prot的定位注释分析，除部分已知定位于该细胞器的蛋白质，还有大量的未知定位信息的蛋白质分布其中，包括217个数据库中提示仅在转录水平检测到的新蛋白质。同时我们还意外的发现了4个与已知定位认识不相符的蛋白质，分别是Nmi、Ifi35、Cdk5和Drgl，我们的数据显示，该类蛋白质在共聚类分析中以高可信度定位于内质网(相关系数大于0.95，p＜0.05)中，而据数据库和文献报道这些蛋白质定位于胞浆中。我们采用了荧光共定位的方法，首批验证了Ifi35在内质网中的定位。本研究作为HLPP计划中的一部分，首先对样本保存方式及细胞器提取策略进行了系统的比较和评价，在此基础上所形成的冻存肝脏匀浆液备选保存方法和细胞器联合提取技术方案已成为中国人类肝脏蛋白质计划中亚细胞蛋白质表达谱构建的标准操作规范(Standard operation procedure，SOP)。采用引入气相分段扫描的叁维(3-D)蛋白质鉴定技术策略和高于国际通用的数据卡值标准(大于95％置信度、双肽段以上匹配)，我们分别从6，152、6，935个非冗余肽段中获得了921和1065个高信度蛋白质。通过对这些蛋白质的定量和聚类分析，发现了217可能定位于内质网上的未知功能蛋白质和4个与已知定位认识矛盾的蛋白质，采用荧光共定位方法首批确证了Ifi35的内质网上定位。
孙婕[4]2017年在《基于离心式富集装置和抗体的蛋白质酪氨酸磷酸化分析新方法》文中指出蛋白质组学是大规模、高通量、系统化研究某种细胞、组织或生物体中所有蛋白质的组成及其功能的学科。翻译后修饰对蛋白质的功能和活性起至关重要的作用,因此,蛋白质组学研究不仅包括蛋白质的定量、定性分析,还包括蛋白质的修饰种类和修饰位点鉴定。目前常见的蛋白质组学研究策略有两种:“Top-down”和“Bottom-up”。“Top-down”以完整蛋白质为研究对象,通过对完整蛋白质分子质量的测定和碎裂谱图的解读,实现对其序列覆盖率100%的测定。“Bottom-up”是目前应用最为广泛的蛋白质组学研究策略,它的流程是将复杂的蛋白质样品酶解成肽段,再通过色谱等方法将其分离后,进一步使用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)进行分析,通过碎裂谱图与蛋白质数据库的匹配情况来鉴定肽段,从而获得相应蛋白质的信息。该策略非常适用于大规模分析鉴定复杂蛋白质组样本。近几十年来,质谱技术不断发展,尤其是生物质谱广泛应用于蛋白质的分析鉴定,为蛋白质组研究提供了高通量、快速、精确、灵敏的检测方法。随着蛋白质组学研究不断深入,应用也愈发广泛。通过对生命活动过程中蛋白质的表达、修饰和功能调节机制的异常进行蛋白质组研究,人们能够深入认识生命的生理过程和病理变化,从而为从细胞和分子水平揭示人类疾病的机制提供理论基础,并为药物研发提供靶点,为疾病的早期诊断和预后提供分子标志物。酪氨酸磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰已成为近年来组学研究的热点领域。酪氨酸磷酸化及其激酶参与调控多个重要的生物过程,包括细胞增殖、细胞周期进程、细胞凋亡、血管生成、细胞迁移、基因转录和代谢反应等。它是细胞信号转导中的关键因子,且在肿瘤的发生发展中起到关键性作用。酪氨酸磷酸化及其激酶活性的研究在抗肿瘤药物靶点的研发中具有十分重要的意义。然而,由于酪氨酸磷酸化仅占蛋白质总磷酸化含量的不足0.1%,因此规模化的酪氨酸磷酸化鉴定面临着重大技术挑战。常见的酪氨酸磷酸肽富集方法主要有金属氧化物亲和色谱和抗酪氨酸磷酸化抗体免疫沉淀。然而,这两种方法均存在一定缺陷。二氧化钛无偏性地将丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸肽富集出来,往往鉴定结果中仅含有1%~2%的酪氨酸磷酸肽,大量的非酪氨酸磷酸肽在质谱检测时会抑制酪氨酸磷酸肽的信号;抗体免疫沉淀的方法虽然是针对酪氨酸磷酸肽特异性富集的方法,但应用于复杂样品时,由于样品的高度复杂性和抗体亲和力的有限性,导致抗体富集时也会存在大量非特异性吸附肽段。针对这些难题,我们建立了一种先以二氧化钛富集磷酸肽,再以抗体富集酪氨酸磷酸肽的富集策略。我们发展了一种用于磷酸肽富集的新型离心式富集装置,该装置使二氧化钛串联反相填料,将磷酸肽的富集、清洗、洗脱和分离通过自制的离心装置集成一体。在此基础上,结合抗体免疫沉淀建立了酪氨酸磷酸肽的富集新策略。该富集装置简化了实验步骤,减少了样品损失和人为因素干扰;而且离心式、平行化的样品处理方式可显着提高分析通量。为了得到了最优的富集方法,我们对这种策略的实验条件进行细致的考察和优化。首先是磷酸肽富集方法的优化,在离心式富集装置的基础上,我们考察了包括酶切肽段与TiO2的质量比,洗脱液的乙腈比例,结果表明,当酶切肽段与TiO2的质量比为1:4,洗脱液乙腈比例分别为2%、5%、8%、10%、40%时,富集效果较好。1 mg鼠肝蛋白中可鉴定到磷酸化位点10793个,对应7333个磷酸化修饰肽段。在此基础上,我们研究了抗体富集实验条件,包括不同公司的抗体,起始蛋白量,抗体清洗方式等。我们将优化后的策略成功用于小鼠肝脏蛋白质酪氨酸磷酸化肽段的富集和质谱鉴定,共计鉴定849个酪氨酸磷酸化肽,对应545个蛋白质,其蛋白功能与文献报道的已知酪氨酸磷酸化修饰蛋白功能相符。这为深入研究酪氨酸磷酸化修饰提供了有力支持,显示了该富集策略在蛋白质组学研究中的应用潜力。肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的肿瘤之一,死亡率仅次于肺癌。大多数肝癌患者在确诊时已失去手术切除的机会,因此寻找有效的肝癌药物治疗靶点以及早期诊断的标志物具有重要意义。运用蛋白质组学研究方法,比较正常和病理状态下的肝癌细胞或组织中酪氨酸磷酸化蛋白的表达和修饰量的差异,对发现肿瘤相关特异性靶点具有重要意义,可为肝癌的临床诊断、病理研究、药物靶点筛选提供理论依据和基础。我们以小鼠肝脏为样品建立的酪氨酸磷酸肽富集策略应用于人的肝癌组织和其癌旁组织的酪氨酸磷酸肽富集与鉴定。从77例肝癌病人的癌组织中共鉴定到970个非冗余的酪氨酸磷酸化蛋白,1492个酪氨酸磷酸化位点;从癌旁组织中鉴定到962个非冗余的酪氨酸磷酸化蛋白,1424个酪氨酸磷酸化位点。这一数据有助于深入研究酪氨酸磷酸化修饰在肝脏生理病理过程中的调节机制。本实验也进一步证明自制的离心式富集装置和抗体结合的酪氨酸磷酸肽富集策略可以应用于复杂临床样本,该装置在其他蛋白质翻译后修饰的富集与鉴定中也有良好的应用潜力。
唐刘君[5]2009年在《大规模人类肝脏蛋白质相互作用网络研究》文中研究说明肝脏承担了物质代谢、胆汁分泌、生物合成和解毒等重要生理功能。蛋白质相互作用是蛋白质执行功能的重要方式,也是细胞功能调控网络的结构基础。肝脏蛋白质相互作用网络的研究,不仅可以认识肝脏生理功能的分子调控机理,发现蛋白质互相联系的内在规律,还可能发现许多未知蛋白质的功能和已知蛋白质的新功能线索,并有助于从网络层面上认识肝脏疾病发生机制,发现新的生物标志物和药物靶点。本研究建立了适合规模化蛋白质相互作用发掘的酵母双杂交技术平台,并对人类肝脏重要蛋白质的相互作用进行筛选,采用多种方法对所获相互作用数据进行了评估,构建了人类肝脏蛋白质相互作用网络框架,进一步分析了该网络的特征及可能的生物学意义。论文分为两个部分:一、人类肝脏蛋白质相互作用网络框架构建及特性分析。研究并发展了高通量阵列筛选技术、高通量质粒抽提技术、高通量转化细菌和酵母技术等,再整合已建立的高通量载体构建技术组成了大规模阵列式酵母双杂交技术平台,其通量达到每天筛选384×384阵列,即每天检测约15万个可能的相互作用。在此基础上以构建的总数约10000个酵母双杂交克隆的阵列库为起始,建立了系统的相互作用阵列交配筛选过程。约3500个诱饵质粒和5100个猎物质粒被分别转入MATα和MATa酵母菌株中,通过自激活实验淘汰不适合筛选的克隆。余下的克隆,每12个猎物克隆形成一个亚库(pool)与每一个诱饵克隆进行交配(mating)筛选,为第一轮一对库筛选(pooled mating)。筛选中能激活LacZ报道基因而在X-gal分析中呈阳性的二倍体酵母细胞被判断为候选阳性克隆。所有在第一轮筛选中被判为候选阳性的诱饵与相应的12个猎物分别进行一对一的第二轮杂交筛选,能激活HIS3和URA3报道基因而在四缺选择性培养板上生长和/或激活LacZ报道基因在X-GAL分析中呈阳性的克隆判断为阳性。只有能通过两次独立筛选的相互作用被计入真阳性。本研究共检测了超过1500万对的配对(3000诱饵与5000猎物),得到涉及939种蛋白质的991对相互作用,初步建立了人类肝脏蛋白质相互作用网络的基本框架。为验证所获数据的可靠性,首先随机挑选了384对相互作用蛋白质进行一对一重-杂交(re-mating)验证,阳性率为87%。随后我们选出10对相互作用采用免疫共沉淀实验验证,结果8对为阳性,虽然,验证数据规模还较小,但仍提示在所获蛋白质相互作用数据中含有较多可被其它独立方法验证的相互作用,具有较高的可靠性。我们进一步采用生物信息学方法评价了数据的可靠性,包括已知相互作用分析和PRINCESS软件分析。结果发现在991对相互作用中有64对(占6.5%)为文献报道相互作用,这一比例高于Rual J.F.等报道的大规模人类蛋白质相互作用研究的比例3.4%(95/2754)。采用整合相互作用的功能相关性、定位、相互作用结构域、模式生物相互作用等信息发展的PRINCESS软件分析打分,410对相互作用得分大于2分,即超过40%为高可信度相互作用,该比例略高于其它两个规模化人类蛋白质相互作用研究数据的评分。这些结果表明我们获得的数据具有较高的可信度。为了直观地描述相互作用形成的网络并分析网络的特点及其生物学意义,我们将获得的相互作用进行了可视化分析和网络拓扑结构分析,发现人类肝脏蛋白质相互作用网络具有类似其它真核生物蛋白质相互作用网络的小世界、无尺度特点。随后我们以实验数据、生物信息学分析和大量的文献调研为依据,试图从面、线、点叁个层次挖掘信息,即面(对重要信号通路的调节网络)、线(重要生物学过程间的交联)、点(重要功能蛋白质的作用或调控机制)等,并从每个层次选一个实例进行了详细分析,即NF-κB信号通路的网络化调节、潜在的生物学过程间的交联—GATA2- Smad4的相互作用、揭示重要功能蛋白的作用机制—MCC-GTF2E2以及MCC-TCEB3的相互作用。为进一步挖掘和揭示获得数据的生物学意义奠定了基础。二、人类肝脏代谢相关蛋白质相互作用蛋白质的发掘。物质代谢是肝脏功能的一个重要特点,同时阵列库所含蛋白质数量有限,为获得在阵列库中不包含的蛋白质的相互作用,我们选择人类肝脏代谢相关的27个蛋白质作为诱饵,对成人肝cDNA文库进行筛选。每种诱饵经文库转化至少获得超过1X106独立克隆。能激活叁个报道基因中两个以上的相互作用克隆计入阳性。500个初步阳性克隆,其中叁阳性克隆数128个,两阳性数372个,大约221个克隆被成功测序,其中符合阅读框的猎物为109条,去除冗余后获得73对相互作用。对这些相互作用对进行酵母回转验证,总体回转阳性率为52%,其中B、C类的回转阳性率为62%,提示我们的相互作用中可能存在一定的假阳性,需经其它方法进行验证。随后我们采用多种生物信息学分析方法,包括已知相互作用、基因共表达、GO (Gene ontology)功能注释、相互作用结构域、模式生物同源性比较和网络拓扑结构等,对所得相互作用的可信度和生物学相关性进行系统的评价。在我们的相互作用数据中,有4对已知相互作用,占所有相互作用的5.5%;有35对相互作用的猎物和诱饵共同出现在同一文献中;15对相互作用的诱饵和猎物具有相同的生物学功能或参与相同的生物学过程;8对相互作用的诱饵和猎物有相互作用结构域存在;1对相互作用具有模式生同源性。这些结果显示我们获得的相互作用具有较高的可信度,是对阵列法筛选获得人类肝脏蛋白质相互作用数据的有效补充。通过其它独立实验验证所获相互作用的工作目前正在进行之中。本论文建立了高通量阵列式酵母双杂交技术平台,可为规模化开展不同物种和不同物种间如病原微生物蛋白质与人类蛋白质相互作用研究提供有效的技术支持。同时,构建的人类肝脏蛋白质相互作用网络,揭示了许多未知蛋白质的功能和已知蛋白质的新功能线索,并有助于从网络层面上认识肝脏生理功能调控和疾病发生机制,发现新的生物标志物和药物靶点。
田楠[6]2008年在《常见抗精神病药物的蛋白质组学研究》文中研究表明精神分裂症是一种常见的精神疾病,其发病率约1 %。目前普遍认为精神分裂症是一种受遗传因素和外界环境共同作用的复杂疾病。蛋白质是多种因素相互作用下基因转录后的最终表现形式,基于蛋白质的研究手段提供了诠释精神分裂症致病机制的最佳方法。血浆(或血清)和脑脊液等体液样品可以在疾病发生和发展的过程中随时抽取,是疾病研究的理想材料。本研究采用蛋白质组学技术研究了抗精神病药物(利培酮)治疗前后的10例首发精神分裂症患者血浆蛋白质组的变化,我们发现:载脂蛋白A-I,运甲状腺素蛋白及视黄醇结合蛋白在治疗后显着上调,而α1-抗胰蛋白酶在治疗后表现为显着性下调。本研究是对先前我们小组关于精神分裂症患者与正常对照的血浆蛋白质组比较研究的一个独立验证。结合先前的研究,我们认为急性反应期蛋白表达水平改变与患者体内炎症反应体系的改变有关;载脂蛋白A-I的变化是与精神分裂症的病理过程相关的;运甲状腺素蛋白和视黄醇结合蛋白的变化可能不是由药物引起的变化,它们所参与的维生素A的代谢调控通路对精神分裂症的发生存在重要的调控机制。精神分裂症的治疗主要依赖于抗精神病药物的使用。肝脏是药物代谢的主要场所,几乎任何一种临床药物都会产生潜在的、复杂的肝脏损伤。我们采用蛋白质组学技术对抗精神病药物处理的大鼠肝脏进行分析,期望找到关于药物导致肝脏损伤机制以及抗精神病药物选择/筛选的有益信息。本研究中我们分别给与Sprague-Dawley大鼠34天的氯丙嗪、氯氮平、思瑞康叁种抗精神病药物处理,利用双向电泳技术建立了大鼠肝脏蛋白质组2Dgel数据库,并鉴定了123个蛋白点对应80种蛋白。通过与未经药物处理的大鼠肝脏蛋白质组比较,251个清晰的蛋白点参与匹配分析,经统计分析发现33个蛋白点对应26种蛋白在抗精神病药物处理的大鼠肝脏中表达量显着改变,特别是3-巯基丙酮酸转硫酶,抗氧化物酶,细胞色素b5,细胞角蛋白,14-3-3蛋白,δ4-3酮类固醇5β还原酶以及3α羟类固醇脱氢酶变化极其显著(P值<0.01)。本研究结果支持抗精神病药物能够诱导细胞产生氧化应激的论点;另外我们还发现胆汁酸异常可作为抗精神病药物对肝脏损伤的信号标记。结合最近的研究,我们提出假说:抗精神病药物处理后可能在肝细胞和神经细胞中存在相同的氧化应激改变。这需要进一步的实验支持。尽管本研究仍不能完全揭示抗精神病药物对肝脏影响的精确机制,但为今后联合其他方法(如代谢组学)揭示药物毒性机制以及药物的选择/筛选提供了证据及方向。
李梦林[7]2014年在《尿液是疾病标志物的理想来源》文中认为生物标志物是指与生理或者病理生理过程相联系的可监测的变化,更好的寻找标志物对疾病的预防、诊断、治疗具有重要的意义。作为寻找疾病标志物的“金矿”,尿液是研究疾病标志物的理想来源。与最常用于检测标志物的血液来源相比,它可以无创、大量的获取,并且由于不受稳态的调节,可以容纳并积累更多、更大的变化。尿液的一部分组成成分来源于血液滤过物,因此它不仅可作为研究泌尿系统生物标志物的理想来源,也在一定程度上可以反映血液或者整个机体的状态。本论文第二章节我们先探讨了尿液作为标志物来源的优势,即在相同的条件下,尿液中可以找到更多的变化信息。通过抗凝剂肝素或阿加曲班改变雌性SD大鼠的凝血状态,用蛋白质组学的方式检测给药前后血液和尿液中蛋白的改变。在同样的鉴定策略及分析条件下,尿液中发现更多的变化蛋白。在阿加曲班干预组中,检测到尿液中变化的蛋白有62个,血液中变化的蛋白仅有1个。在肝素干预组中,尿液中变化的蛋白有27个,血液中变化的蛋白仅有3个。Western blot显示转铁蛋白(transferrin)和血红素结合蛋白(hemopexin)在血液和尿液中的变化趋势与质谱结果一致。本实验提示尿液是更敏感的蛋白生物标志物的来源。因为尿液可以累积机体的很多变化,它更容易受到各种因素如性别、年龄、生活方式等的影响,造成尿液在尿量、蛋白含量等方面的动态波动。研究影响尿液蛋白质组的因素,弄清各因素对尿液的具体干扰,将有助于我们在进行其它尿液蛋白研究时,人为地减少这些因素带来的影响,进而获得更为准确的疾病标志物信息。进食、应激、手术后常引起短暂性血糖升高,这可能是疾病标志物研究的一个干扰因素。所以在本论文第叁章节,我们研究了短暂高血糖对尿液的影响,发现正常人在血糖短暂升高后,尿中仅有一个蛋白发生改变。表明在正常人中,短暂高血糖的影响很小,基本可以忽略不计。既然尿液是重要的标志物来源,对尿液蛋白质组进行准确且深入的鉴定,全面了解尿液中蕴含的蛋白种类、来源、功能等信息,对尿液中疾病标志物的研究非常有必要。在本论文第四章节,我们通过叁维分离的方式,对正常人尿液蛋白进行有效分离,并结合高精度质谱,对人尿液蛋白质组进行了全面深入的鉴定。在将标准设为每个蛋白至少有两条多肽得到鉴定且FDR<1%的条件下,我们共得到高可信的尿液蛋白4657个,其中绝大多数蛋白第一次在尿液中得到鉴定。这将有助于我们更好的了解肾脏的生理功能、尿液的生物学意义,并为标志物的寻找提供重要的参考价值。在另一方面,我们也提倡采用多种方式来寻找疾病标志物,毕竟尿液不能包含所有的疾病变化信息。在本论文第五章节,我们在实验室前期工作的基础上,进一步探讨了离体肝脏灌流技术在肝脏疾病标志物研究中的重要意义。离体肝脏灌流技术可以保持器官结构的完整性,灌流液可以富集肝脏分泌的蛋白,在寻找分泌蛋白疾病标志物方面具有应用价值。我们获得了walker-256肿瘤细胞肝转移前后的灌流液差异表达蛋白,挑选5个蛋白在8只肿瘤模型组、8只对照组中验证。最终发现蛋白TWHAB可以作为肝转移癌的潜在标志物。我们认为在现有条件下,通过离体器官灌流的方式来寻找疾病标志物是重要的补充策略。本论文中,我们探讨了尿液是疾病标志物的理想来源,初步研究了其影响因素,对其中的蛋白组成进行了全面的鉴定,并提出了研究疾病标志物的补充策略,对疾病标志物的研究具有重要的意义。
王蕾[8]2010年在《肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁形成机制的初步探索》文中进行了进一步梳理目的：肝包虫侵入人体后,会在人体的肝脏部位形成病灶-包囊。在这个过程中,正常的肝脏组织不断发生细胞调亡、免疫应答等反应,并且在病灶的周围不断出现纤维化的组织结构,即靠近虫体的外囊和靠近肝实质的外膜。本文旨在寻找肝包虫周围纤维囊壁形成的影响因素和影响因子。1.对正常肝脏组织和病旁肝脏组织蛋白质组学的分析,寻找在表达谱上的差异。2.利用生物信息学软件分析SSH文库数据,查找转录组的差异,并对文库进行复制保存。方法：1.通过蛋白质双向电泳,寻找在病旁肝脏组织中差异表达的蛋白；2.利用抑制消减杂交技术,从转录组上,寻找差异基因；3.通过细菌培养等技术,对SSH文库进行复制。4.应用生物信息学软件,处理获得基因序列和蛋白质信息。5.采用RNA斑点杂交技术,对获取的差异基因进行初步验证。结果：1.针对纤维化肝脏组织的特殊性,对肝脏蛋白质各种提取条件的进行了优化,摸索到了提取纤维化肝脏组织的方法,包括裂解蛋白质裂解液的各种成分及浓度、提取条件等。最后确定使用尿素浓度为8M的裂解液来溶解蛋白质,通过间断超声处理核酸,45000g离心力以保证蛋白质组的完整性。2.在进行蛋白质双向电泳时,通过对样品上样量的调节、胶条的选择、水化聚焦条件的优化、凝胶染色方法选择等条件的摸索,寻找到了适合病旁肝脏组织双向电泳的方法和条件。使用了800μg的上样量、pH5-8的预制胶条、80000Vhr聚焦时间、考马斯亮蓝染色,获得了较高质量的双向电泳凝胶图谱。3.用PDQuest软件分析和质谱检测,共获得了72个差异蛋白点,并通过数据库分析,确定42个差异蛋白的名称及分类。这些蛋白主要分为以下几类：物质代谢及能量代谢相关占16%,病灶发生发展相关和免疫相关的各占了13%,次生代谢相关的占10.5%,细胞凋亡及炎症反应相关、物质运输相关各占7.9%,生物合成相关、细胞骨架、耐药性相关、肝脏损伤指示蛋白、信号传导相关各占了5.3%,未知蛋白有7.7%.4.通过Seqman、DNAstar、ESTin等软件分析,将前期构建的SSH文库数据处理后,在NCBI提交67条EST序列,Genebank号为：G0349048-G0349115；并获得了20个基因的不同cDNA序列信息。5.利用细菌培养、文库复制等技术,将构建的cDNA文库进行了复制,减少了操作时,文库被污染的概率。6.通过RNA斑点杂交,共验证了5个差异基因在病旁肝脏组织中的表达情况。其中,P40、P150、细胞色素氧化酶Ⅲ亚基在病旁肝脏组织中高表达；ATP合酶、半胱氨酸蛋白酶在病旁肝脏组织中表达下调。结论：1.通过对差异蛋白质的分析,发现了一部分蛋白质在肝包虫病的发生发展过程中起到一定的作用,如免疫反应相关的蛋白、细胞凋亡及炎症相关蛋白、物质运输相关蛋白等,在病灶发生过程中,都发生了不同程度的表达变化。2.通过抑制差减文库数据分析和RNA斑点杂交,确定了部分差异基因在病旁肝脏组织中的表达情况,并初步判断这些基因可能与肝包虫病发生过程中的炎症反应有关。
杨冬[9]2009年在《蛋白质组水平蛋白质的结构域特征与其表达特征相互关系研究》文中研究表明结构域是蛋白质结构、功能和进化的基本单位,结构域特征决定着蛋白质的功能。因此,在蛋白质组水平进行系统性的结构域特征分析,对于全面认识生命系统蛋白质结构和功能特征以及与结构域相关的蛋白质进化规律具有十分重要的意义。自从人类和多种模式生物基因组测序完成以来,大量研究基于基因组编码的“全蛋白质组”(predicted Human Genome Encoding Proteome,以下简称“全蛋白质组”或“pHGEP”)对结构域特征进行了系统性分析,并取得了丰硕的成果,发现了一系列普遍存在的和物种特异性的结构域特征,以及与结构域“倍增”、“组合”相关的蛋白质进化规律性模式。然而,由于基因组在生物体内是相对恒定的,而基因表达具有时空特异性,这使得仅在“全蛋白质组”水平进行结构域特征分析不能回答涉及基因表达的相关问题:①特定组织/器官蛋白质组结构域分布有何特征?②结构域特征与蛋白质丰度有何关系?而这两方面问题的回答具有非常重要的意义:①利于全面认识特定组织/器官的蛋白质功能特征及其结构基础,并有望发现组织/器官基因表达普遍存在的与结构域分布相关的规律性现象;②利于全面认识“蛋白质丰度分布”基本规律。③有望发现具有重要研究价值的特定蛋白质或结构域。因此,本研究充分利用基因/蛋白质表达谱数据,分别在蛋白质表达的“定性”和“定量”两个角度研究了蛋白质结构域特征与表达特征的相互关系,并对在此过程中发现的重要研究对象—KRAB型锌指蛋白(KRAB-containing Zinc Finger Proteins,即“KRAB-ZFPs”)在红系分化中的调控功能进行了探索。肝脏是机体内复杂性仅次于脑的最大的内脏器官,但目前尚缺乏对其结构域分布特征的系统性认识。本研究对人类肝脏蛋白质组结构域分布特征进行了深入分析,并重点关注了人类肝脏生物学复杂性形成的分子结构基础。我们通过汇集已知的人类肝脏基因表达谱数据,构建了预期的人类肝脏蛋白质组(predicted Human Liver Proteome,以下简称“pHLP”),分别在整体和群体水平与pHGEP进行了比较。整体水平的分析发现:从结构域角度考虑,高混杂度、高连接度结构域及进化史上出现较早的结构域在pHLP中显着富集;从蛋白质角度考虑,多结构域蛋白在pHLP中显着富集,而单结构域蛋白显着缺失。这些结果表明人类肝脏生物学复杂性的形成更依赖于复杂的结构域组织形式,而非新的结构域类型的出现。群体水平的进一步分析发掘出一系列在pHLP中特异性富集或缺失的结构域,它们代表了肝脏特征性的生理功能的分子结构基础。对这些结构域特征的进一步分析发现:pHLP中显着富集的结构域更趋向于具有高混杂度、高连接度和古老年龄,反之亦然,这进一步证实了上述有关肝脏生物学复杂性成因的结论。以上分析表明,肝脏中各种类型结构域并不是按照它们在“全蛋白质组”中同样的比例分布于肝脏蛋白质组的,而是存在一定的偏性。那么,这种分布的偏性在人体各组织/器官中是否普遍存在呢?我们利用已公开发表的73种人体“器官/组织/细胞”(Organ,Tissue or Cell,以下简称为“OTC”)的转录组数据构建相应的预期蛋白质组,并与pHGEP进行比较分析。结果发现pHLP结构域分布特征在人体各种“OTC”中具有普适性。即各种类型的结构域在“全蛋白质组”中的分布比例与各种“OTC”蛋白质组中分布比例是不同的,而且其偏性具有一定的规律性:在结构域层次上,高混杂度、高连接度结构域及较古老的结构域显着富集;在蛋白质层次上,多结构域蛋白显着富集,单结构域蛋白显着缺失。此现象的发现,丰富了人们对“基因表达偏性”规律的认识。上述分析基于定性角度研究蛋白质结构域特征与蛋白质表达特征之间的关系,接下来我们对蛋白质结构域特征与蛋白质定量特征之一—“丰度”之间的关系进行了深入研究。我们关注了叁个最简单但其意义非常重要的蛋白质结构域特征参数:蛋白质内结构域数目(DN)、结构域覆盖率(DC)及介导蛋白质间相互作用的结构域覆盖率(PPI_DC),利用人和小鼠肝脏蛋白质组定量数据及其它4种代表性模式生物(果蝇、线虫、酶母及大肠杆菌)定量蛋白质组数据分析了它们与蛋白质丰度的相关性。结果发现:DN与蛋白质丰度存在负相关性,且随着物种进化,二者负相关性呈明显增强的趋势;DC及PPI_DC与蛋白质丰度间存在明显正相关性。已有研究表明,DN在一定程度上可代表蛋白质结构和功能的复杂度(complexity);DC是衡量蛋白质结构和功能紧密性(compactness)的重要指标;而蛋白质PPI_DC与其所在相互作用网络的复杂性呈正相关。结合我们的分析结果,可以作出如下推论:①高等真核生物(从线虫、果蝇到小鼠和人类)中,结构和功能越复杂的蛋白质,其丰度越低;②在所分析的6种模式生物(大肠杆菌、酶母、线虫、果蝇、小鼠及人类)中,结构和功能越紧密的蛋白质,越趋向于高丰度表达;③在所分析的6种模式生物中,蛋白质所在网络复杂性越强(即与之发生相互作用的蛋白质数目越多),其本身越趋向于高丰度表达。我们的研究首次认识到蛋白质结构域特征与其丰度间存在显着相关性,这对于深入认识生命系统中蛋白质丰度分布规律具有重要意义。结构域特征的系统性分析,一方面可揭示重要的规律性现象,另一方面也可提供具体的有重要意义的研究对象。本研究在分析成人肝脏蛋白质组结构域分布特征时,发现KRAB-ZFPs在成人肝中显着缺失,而本室以往进行造血期人胎肝蛋白质组数据分析时,发现KRAB-ZFPs是显着富集的。此外,小鼠肝脏不同发育阶段转录组数据表明,57.6%的KRAB-ZFPs基因在小鼠胎肝造血高峰期具有相对高水平的表达。这些数据提示KRAB-ZFPs在胎肝造血期较为活跃。胎肝期造血以红系分化为主。KRAB-ZFPs作为哺乳动物特有的重要转录因子家族,其功能涉及发育、凋亡、癌变等多方面,但尚未有参与红系分化调控的报道。为明确KRAB-ZFPs是否参与红系分化调控,并挖掘可能参与红系分化调控的KRAB-ZFPs,我们选择小鼠红白血病(MEL)细胞红系分化模型进行深入探索。KAP-1是KRAB-ZFPs的通用共抑制因子;KRAB-ZFPs一般通过KAP-1作为桥梁分子募集辅助调控因子形成复合体来发挥调控功能。我们首先对MEL细胞中KAP-1进行敲低,并检测对MEL细胞红系分化的影响。结果发现,KAP-1被敲低后,MEL细胞经HMBA诱导发生成熟性红系分化过程中,胚胎型β-globin基因Ey表达明显上调。这提示,在MEL细胞中某个/某些通过KAP-1形成的复合体参与Ey基因表达负调控。为了探寻真正负调控Ey基因的转录因子,我们对MEL细胞中与KAP-1存在相互作用的分子利用IP-LC-MS/MS技术进行分离鉴定,得到16个KRAB-ZFPs及其它一些转录因子和辅助调控因子。通过进一步筛选,我们从中发现Zfp445可能参与胚胎型β-globin基因负调控。通过对MEL细胞中Zfp445进行RNAi和红系分化表型变化检测,证实Zfp445是在成熟性红系分化过程中负调控Ey基因的转录因子。Zfp445负调控Ey基因的具体机制尚待深入研究。本研究从蛋白质表达的“定性”和“定量”两个角度在蛋白质组水平系统分析了蛋白质的结构域特征与其表达特征的关系,发现了“组织/器官蛋白质组结构域特征偏性分布”及“结构域特征与蛋白质丰度显着相关性”等规律性现象;结合本室造血期胎肝转录组及蛋白质组数据分析,我们探索了KRAB-ZFPs在红系分化中的调控功能,发现Zfp445可以负调控Ey基因的转录。
张莹[10]2009年在《MALDI质谱新方法与新技术及其在蛋白质组学中的应用研究》文中指出本博士学位论文工作的主要集中于基于基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)的新方法新技术新发展及其在在蛋白质组学领域中的应用研究。在痕量多肽富集除盐的研究方面取得了创新性的进展,利用嵌段共聚物成功实现了样品高效靶上原位除盐与富集后直接用于MALDI-TOFMS分析,并成功应用到实际样品小鼠肝脏的蛋白质组学研究中。在蛋白质直接靶上酶解技术方面,发展了以树枝状聚合物-碳纳米管为基体,将胰蛋白酶固定在树枝状聚合物的表面得到可溶性的固定化酶,成功实现了蛋白质在靶板上快速酶解后直接用于MALDI-TOFMS分析,特别适用于低丰度蛋白质的高效酶解和质谱鉴定。在基质方面开展了针对磷酸化多肽、寡聚糖和磷脂离子化效率低等问题的研究工作,对基质体系进行研究,大大提高了上述叁类分子的离子化效率,为质谱高灵敏度检测提供了解决方案。在MALDI-TOFMS用于非小细胞组织切片直接分析开展了研究工作,建立了用组织成像的方法寻找非小细胞癌生物标志物的方法,发现在非小细胞肺鳞癌中发现有别于癌旁组织的m/z 3000-3500的簇峰;发现非小细胞2种亚型肺鳞癌和肺腺癌相比,有各自特征性的磷脂分子峰出现;发现癌组织中heme b(m/z 616.2)表达量远低于癌旁组织,成为区别非小细胞肺癌和癌旁组织的生物标志物。随着人类基因组序列“全书”的绘制完成,首次在分子层面上为人类揭示生命奥秘提供了一份生命“解剖图”。此后,人类对生命“密码”的解读大大加快了,进入了后基因组时代中。蛋白质组学(Proteomics)研究正是生命科学进入后基因组时代的标志之一。蛋白质组学以蛋白质组(Proteome)为研究对象。蛋白质组最初是指“由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质”。测定一个有机体的基因组所表达的全部蛋白质的设想,萌发在1975年双向凝胶电泳发明之时。1994年Williams正式提出了这个问题,而“蛋白质组”的名词则是由Wilkins创造的,它是由蛋白质的“Protein”和基因组的“Ome”字母拼接而成,发表在1995年7月的Electrophoresis杂志上。现在这一概念得到了扩展,指有机体全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式,或者说是一种细胞、组织或完整生物体在特定时空上所拥有的全套蛋白质,以及蛋白质表达后的修饰,蛋白质之间的相互作用,蛋白质的空间结构和更高级的复合物等。蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、蛋白质相互作用分析及生物信息学数据处理技术被称为蛋白质组研究的四大基本支撑技术。其中,在蛋白质鉴定方面,质谱技术是目前在鉴定蛋白质的多种方法中发展最快、应用最广泛、最具发展潜力的技术。自约翰.芬恩(JohnB.Ferm)和田中耕一(Koichi.Tanaka)分别发明了两种重要的软电离方式“电喷雾离子化(ESI)”和“基质辅助激光解析离子化(MALDI)”技术,建立对生物大分子进行确认和结构分析的方法以来,质谱目前已经成为生命科学领域最活跃的前沿研究领域之一。蛋白质组学的科学研究之所以能够取得蓬勃的发展,主要依赖于质谱技术的飞速发展以及高通量分离和分析技术的突破性进步。然而,由于蛋白质的可变性和多样性等特点,蛋白质组研究在分析技术和分析仪器上还有很多瓶颈问题有待解决。如蛋白质的表达水平差异大,动态范围宽,现有的分离技术还不足以将一个生物体内所有的蛋白质分离开来:现有分析仪器的灵敏度还很难将体内微量的蛋白质精确分析,而这种微量蛋白在生命过程中起到关键性作用。随着蛋白质组学研究的进一步深入,传统的生物质谱技术平台已不足以应对蛋白质组学中高灵敏度高通量高准确度等的检测要求,所以研究和发展基于生物质谱的新技术与新方法对于促进蛋白质组学的研究显得意义重大。本论文以发展MALDI质谱分析相关的新技术新方法为切入点,开展了相关研究工作。本论文共分为五章,主要内容摘要如下:第一章主要综述了蛋白质组学研究发展概况,包括蛋白质组学的研究目的、意义、主要研究方法以及蛋白质组学在人类疾病研究中的应用。质谱仪器作为蛋白质组学研究领域中一个重要的技术支撑,本章节对质谱仪器的发展状况进行了简单的综述,包括其核心部件离子源、质量分析器和检测器技术的发展状况。着重对蛋白质组学中应用广泛的两种质谱仪器基质辅助激光解析质谱和电喷雾质谱的原理和应用进行了小结。本章还对蛋白质组学分析时面临的挑战进行了归纳,对MALDI技术研究的重要性和面临的挑战进行分析,并在此基础上提出了本课题工作的研究方向。第二章研究工作主要为嵌段共聚物PSF-b-PEO用于痕量多肽靶上除盐和富集后直接MALDI-TOFMS分析的新方法研究。我们选择微观相分离结构的嵌段共聚物PSF-b-PEO作为MALDI靶涂层,然后利用制作的聚合物涂层进行痕量多肽的靶上除盐和富集工作。嵌段共聚物结构中具有亲水和疏水的两端,在点覆样品溶液后,由于疏水端不溶解在样品溶剂中,保持嵌段聚合物在金属上的膜稳定性;亲水端则可以溶解在样品溶剂中并对盐和一些污染物具有强的吸附作用,因而在样品溶剂挥发的过程中,盐和其它污染物被牢牢地包裹在聚合物内部。点覆基质溶液后,由于盐被包裹在聚合物内部,不再进入到基质的溶剂中,而肽段会再次溶解在基质中并和基质形成结晶。并且,由于聚合物膜的疏水性使得样品会收缩在一个很小的靶点区域内,使样品在靶上得到了富集。因此无需额外清洗除盐,富集除盐后的样品就可以直接进行MALDI-TOFMS分析。第叁章的研究工作主要为以树枝状聚合物-碳纳米管为基体,将胰蛋白酶固定在树枝状聚合物的表面得到可溶性的固定化酶,成功实现了痕量蛋白质在靶板上快速酶解后直接用于MALDI-TOFMS分析。我们首先在混合酸中对碳纳米管进行酸化处理在表面形成大量羧基并通过酸化处理截短碳纳米管以及去除杂质。然后将聚酰胺-胺型树枝状聚合物(dendrimers)通过共价结合的方式结合在碳纳米管表面,并将胰蛋白酶通过戊二醛交联反应固定在聚合物的氨基端。碳纳米管表面修饰了dendrimers后,极大地增强了碳纳米管的可溶性。因此,以树枝状聚合物-碳纳米管为基体的固定化酶既具有固定化酶的稳定性高的优点又具有可溶性酶活性高的优点,并且由于它的可溶性,酶解后不需要将碳纳米管从溶液中分离即可进行质谱鉴定。以树枝状聚合物-碳纳米管为基体的固定化胰蛋白酶进行靶上酶解,效率高、速度快、酶自降解峰少,酶解完成后可以直接进行质谱检测,特别适合痕量蛋白质的酶解和鉴定。第四章研究工作主要为针对提高磷酸化多肽、寡聚糖及磷脂离子化效率开展的MALDI基质体系研究。通过在基质溶液中添加磷酸铵盐提高磷酸化肽的离子化效率;合成了新型离子基质2,3,4-叁羟基苯乙酮/N,N-二甲基苯胺(2,3,4-THAP/DMA),2,3,4-叁羟基苯乙酮/吡啶(2,3,4-THAP/Py),2,4,6-叁羟基苯乙酮/N,N-二甲基苯胺(2,4,6-THAP/DMA)和2,4,6-叁羟基苯乙酮/吡啶(2,4,6-THAP/Py)提高寡聚糖离子化效率;此外,还扩展了非极性基质[2E-3-(4-叔-丁基苯基)-2-甲基丙-2-亚烯基]丙二腈(DCTB)的应用范围,发现其在提高磷脂离子化效率方面有着重要的贡献。大大提高了上述叁类分子的离子化效率,为质谱高灵敏度检测提供了解决方案第五章研究工作主要为MALDI质谱成像技术用于非小细胞肺癌组织切片分析的研究。MALDI质谱成像技术用于直接分析组织切片已在基础与临床医学研究中迅速发展。通过对冰冻组织切片表面的质谱扫描可以快速直观地得到组织中的分子如蛋白,多肽等的分布信息。我们采用质谱成像技术对人的非小细胞肺癌组织切片及癌旁组织切片进行了研究,对质谱直接组织表面分析的方法进行了优化,初步建立了以质谱成像法寻找非小细胞肺癌中的生物标志物的方法。结果表明,肺鳞癌组织中有m/z3000-3500范围内的特征性簇峰出现;发现非小细胞2种亚型肺鳞癌和肺腺癌相比,有各自特征性的磷脂分子峰出现;以及在肺癌组织中heme b表达量远低于癌旁组织。质谱用于直接组织切片分析技术能够直观地在分子水平上反映出癌组织和正常组织间的差异,有望进一步提高肺癌临床诊断的准确度。
参考文献：
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[5]. 大规模人类肝脏蛋白质相互作用网络研究[D]. 唐刘君. 中国人民解放军军事医学科学院. 2009
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[8]. 肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁形成机制的初步探索[D]. 王蕾. 石河子大学. 2010
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[10]. MALDI质谱新方法与新技术及其在蛋白质组学中的应用研究[D]. 张莹. 复旦大学. 2009
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