苯甲酸（钠）、山梨酸（钾）作为防腐剂，其能有效抑制霉菌、酵母菌、肉毒杆菌等的生长，是国家允许使用的食品添加剂［1］，但过量添加，经常食用对人体有一定的伤害［2］，特别是苯甲酸（钠），长期食用易引起苯中毒，对肝脏、肾脏等器官造成损害。目前苯甲酸、山梨酸检测方法有：国家标准检验方法［3］，吸收光谱法［4］，液相色谱法［5］，离子色谱法［6］、气相色谱法［7］，液相色谱-质谱联用仪法［8］。超高效液相色谱-PDA法未见报道，本文建立超高效液相色谱-PDA法测定熟肉制品中苯甲酸、山梨酸。样品处理简单，干扰少，线性范围宽，出峰快，精密度高，准准确度好，适于熟肉制品中苯甲酸、山梨酸的检测。
1 实验部分
1.1仪器与试剂：
1.1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色谱仪,配PDA检测器，Empower工作站，VORTEX-5型漩涡混匀器，TGL-22型低温高速离心机，Mill-Q纯水器。千分之一电子天平 匀浆机、恒温水浴锅，超声波发生器。0.22μm水相滤膜
1.1.2 标准物质 苯甲酸、山梨酸标准储备液GBW（E）100169,：1.00mg/mL（中国计量科学研究院）
1.1.3标准使用液（100mg/L）：取标准储备液各2.50mL于25mL容量瓶中，用甲醇+乙酸铵（20mmol/L）溶液（5+95）定至25.00mL。
1.1.4试剂 甲醇（色谱纯），乙酸铵为（色谱纯），石油醚（30-60沸程（分析纯）。乙酸锌（优级纯）亚铁氰化钾（优级纯），无水乙醇，氨水。
1.1.4.1乙酸锌溶液（220g/L）：称取乙酸锌110.0g，加入15mL冰乙酸，加纯水溶解定至500mL。
1.1.4.2.亚铁氰化钾溶液（106g/L）称取亚铁氰化钾50.3g，用纯水定至500mL
1.2仪器工作条件：
色谱柱50mm*3.0mm,5.0um，柱温：25.0℃，样品室温度：25.0℃；，进样量：5uL，流速0.6mL/min，检测波长：232nnm，流动相：A为甲醇，B为20mmol/L乙酸铵溶液，5%A+95%B等度洗脱。
1.3试验方法：
称取匀浆试样约1.000-2.000g，加水20mL，10ml石油醚（30-60沸程),涡旋混匀，于40℃水浴5min,并轻摇，加0.25mL氨水，1.00mL乙醇，混匀，于40℃水浴超声20min，冷至室温，加亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液各1.0mL，混匀，放置10min，于10000r/min离心5min，去掉有机层，将水相转移至50mL容量瓶中；于残渣中再加水20mL，涡旋混匀后于40℃水浴超声20min，于10000r/min离心5min，合并水相于50mL容量瓶中，并用水定至刻度，混匀。取适量上清液过0.22um滤膜，按仪器工作条件进行测定。
2 结果与讨论
2.1色谱行为
2.1.1山梨酸、苯甲酸混合标准色谱图（a）
2.1.2样品检测出山梨酸色谱图（b）
2.2色谱条件的选择
2.2.1检测波长
3D波长扫描范围为200-400nm，实验选取225nm、230nm、232nm、235nm、240nm经扫描，结果表明：波长232nm线性好，灵敏度高，试验选取232nm波长进行测定。
2.2.2色谱柱
国标采用C18色谱柱（250mm*4.6mm,5um）或等效色谱柱，进样量10uL，流速1.0mL/min。本方法采用C18色谱柱（50mm×3.0mm，5um）流速为0.6mL/min，苯甲酸山梨酸都能较好的分离。出峰时间苯甲酸：1.284min，山梨酸：1.733min。
2.2.3流动相选择
方法采用流动相A为甲醇，B为20mmol/L乙酸铵溶液进行等度洗脱。对2%A+98%B、3%A+97%B、5%A+95%B、7%A+93%B等度洗脱检测，试验表明5%A+95%B效果满意。方法采用5%A+95%B等度洗脱。
2.3样品处理：熟肉制品含盐量较高，为减少盐分对色谱柱的污染，样品完全去除蛋白质情况下，尽量减少乙酸锌及亚铁氰化钾溶液加入量。盐分高，分离效果较差，缩短色谱柱寿命，分别用0.5ml、1.0ml、1.5ml、的乙酸锌及亚铁氰化钾进行测试，0.5ml因蛋白质沉淀不完全，回收率较低，1.00ml、1.5ml回收率无显著差异，因此本法选择1.00ml乙酸锌及亚铁氰化钾溶液对样品处理。
2.4标准曲线及检出限
用（5+95）甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液配制0.05,0.1,1.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100mg/L的山梨酸、苯甲酸混合标准溶液，按仪器工作条件对其进行测定，并绘制标准曲线。结果表明：山梨酸、苯甲酸的质量浓度均在0.05-100mg/L范围内与其对应的峰面积呈线性关系，配制0.02mg/L混合标准溶液，根据3倍信噪比计算方法的检出限，并计算当称样量为1g、定容体积为50mL时对应的方法检出限。线性回归方程和相关系数及检出限结果见表1
结论：成功建立了超高效液相色谱法-PDA同时测定熟肉制品中苯甲酸、山梨酸。该方法样品需要量小、处理简单，方法灵敏，检测限为0.25mg/kg，可满足不同含量样品的测定；采用Waters C18色谱柱（50mm×3.0mm，5um）进行分离，在0.6ml/min流动相进行等度洗脱，苯甲酸、山梨酸2min内完全分离，出峰时间短，分离效果好，干扰少；扫描波长232nm线性好，灵敏度高，线性范围0.00～0.10mg/L，相关系数0.99995～0.99999，回收率苯甲酸93.8%～99.5%，山梨酸93.3%～99.2%；相对标准偏差0.50%～0.92%，准确度高，精密度好。综上所述，该方法可以用于熟肉制品制品中苯甲酸、山梨酸常规检测。
参考文献
［1］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 GB2760-2014食品安全国家标准食品 添加剂使用标准［S］.
［2］崔明，王欣亭，孙婷，等..苯甲酸与山梨酸的危害与检测方法［J］.品牌与标准化，2015（9）：51-53.
［3］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.国家食品药品监督管理总局GB5009.28-2016 食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定［S］.
［4］李秋萍，卓婧，周淑晶.吸收光谱法同时检测食品中苯甲酸与山梨酸［J］.分析测试学报2012(12)：1556-1561.
［5］任兴权，任璐.肉制品苯甲酸、山梨酸的测定［J］.中国食品添加剂，2017（12）：192-196.
［6］屈晶，周光明，刘婷. 离子色谱电导抑制法测定食品中4中添加剂［J］.西南大学学报，2010（1）：63-67.
［7］赵维佳，向增旭，张琼. 气相色谱法测定食品中山梨酸苯甲酸方法［J］.粮油食品科技，2006（6）：51-53.
［8］王祖翔，任连兵，蒋俊，等.高效液相色谱串联质谱法测定调味料中的痕量苯甲酸与山梨酸［J］.分析测试学报，2011（6）:665-669.
论文作者:罗靖 熊缘 徐买成 李红梅
论文发表刊物:《医师在线》2018年5月下第10期
论文发表时间:2018/8/22
标签：山梨论文; 苯甲酸论文; 色谱论文; 亚铁论文; 溶液论文; 氰化钾论文; 乙酸铵论文; 《医师在线》2018年5月下第10期论文;