张建华1 林洪1, 2 刘升湘1 俞雄杰1 郁毅刚2(通讯作者)
(1解放军73131部队医院 363000)
(2解放军第一七五医院暨厦门大学附属东南医院神经外科 福建漳州 363000)
【摘要】 目的 探讨实弹演习火炮打击后兔肺爆震伤的病理变化及P38表达特点。方法 闽南山地师团进攻实弹演习，设置6组。远离演习场的空白对照实验兔组（A组），火炮打击区域设置炮火覆盖山体反角隐蔽组（B组）和迎面角隐蔽组（C1-C3组），各组均含实验兔6只。火炮打击后6 h，各组存活兔处死后取肺中叶近肺门处组织，HE染色观察其病理损伤形态，免疫组化染色观察P38的组织表达。结果 与A组比较，B组和C组兔肺组织均可见肺膜下点片状出血和明显的组织水肿，HE染色示后两组肺泡细胞局灶性坏死、肺泡壁破坏及间质水肿伴炎细胞浸润，C组病理损伤明显强于B组。免疫组化结果示后两组肺组织内P38染色强度、范围和阳性细胞率均高于A组，且C组P38免疫反应程度高于B组。结论 火炮打击后兔肺组织呈明显的出血、水肿、细胞坏死等爆震伤病理表现。反角掩体保护有助于减轻肺脏损伤。P38过表达与肺脏损伤病理程度显著相关，它参与了兔肺爆震伤的分子病理调控，是该型损伤治疗的潜在靶标。
【关键词】兔 火炮打击 肺脏 爆震伤 P38
【中图分类号】R36 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）34-0064-03
Pathological alterations and histological expression of P38 in rabbit pulmonary blast injury induced by artillery strike
Zhang Jianhua1 and Lin Hong 1, 2, Liu Shengxiang1 Yu Xiongjie1 Yu Yigang 2*
(1,The Hospital Affiliated 73131 troops of PLA; 2, Department of neurosurgery, the 175th Hpspital of PLA (Affiliated Dongnan Hospital of Xiamen University), Zhangzhou, Fujian, 363000)
【Abstract】 Objective: To investigate the pathological characteristics and histological expression of P38 in rabbit pulmonary blast injury induced by artillery strike. Method: When the mountain division in South Fujian lanched a military exercise, we used 30 rabbits for the following experiments by equally allocating them into blank control group (Group A) which was far away from the exercise field,reverse-shelter-protecting group (Group B), and forward-shelter-protecting group (Group C). Six hours after artillery strike, the surviving rabbits were sacrificed for their lung middle lobe lung tissues nearing the pulmonary hilar. HE staining was performed to observe the pathological morphous, and immunohistochemical study to investigate the histological expression of P38. Results: Compared with the rabbit lung tissues in Group A, those in Group B and C exhibited focal to broad hemorrhage underneath the lung membrane and obvious parenchymatous edema. HE staining showed that lung tissues in the latter two groups experienced focal necrosis of alveolar cell, disruption of alveolar wall, and interstitial edema with extensive infiltration of inflammatory cell, the pathological injury was markedly severer in Group C than that in Group B. Immunohistochemical results showed that the intensity and scope of P38 expression and the percentage of positive cells in lung tissues from Group B and C were significantly higher than those from Group A. In addition, the immunoreactivity of P38 was much higher in Group C than that in Group B. Conclusion: Rabbit lung exhibits obvious pathological alterations of pulmonary blast injury such as hemorrhage, edema, cellular necrosis, etc., after artillery strikes. Reverse-shelter-protection helps the alleviation of lung injury. Overexpression of P38 significantly correlates with the pathological degree of lung injury and potentially involves in the molecular regulation of pulmonary blast injury of rabbit, suggesting that it is a potential therapeutic target.
【Key words】rabbit artillery strike lung blast injury P38
在野战火炮打击下，以肺脏为代表的空腔脏器爆震伤占全身多发伤的30%～50.4%，是伤员致残、致死的重要原因[1]，其特征性病理变化是冲击波的超压和负压引起原发性直接暴力损伤和炎症反应导致的继发性损伤[2]。对肺爆震伤病理生理学机制的深入研究有助于伤员的战术战伤救治。鉴于既往动物模型存在不能全方位模拟战场条件的局限性，我科协同驻闽南某山地师在实弹演习时直接构建战时炮火覆盖下的兔肺爆震伤模型，采用不同掩体位置保护实验兔，观察兔肺病理损伤及肺组织内丝裂原活化蛋白激酶P38（mitogen-activatedproteinkinases P38，P38-MAPK）的表达变化，为肺爆震伤的战场救治提供病理学依据。
1 材料与方法
1.1 时间和环境条件 南方秋季中午山地环境。环境温度16℃-28℃，湿度43%～65%。
1.2 动物及试剂 清洁级健康成年雄性新西兰大耳白兔30只，体重2.5-3.0 kg（购自厦门大学医学院动物中心）。一抗为P38多抗（稀释度为1∶80）。二抗为羊抗兔IgG血清（稀释度为1∶2000）。以上试剂及SP免疫组化试剂盒和HE染色试剂盒均购自兰州明珠生物技术公司。
1.3 实验分组 实验兔常规饲养，按随机区组设计分成5组，设置远离演习场的空白对照实验兔组（A组,6只），火炮打击区域设置炮火覆盖山体反角隐蔽组（B组，6只）和迎面角隐蔽3组（C1-C3组，各6只），其中迎面角隐蔽组分别置于炮靶间距10米，20米，30米处。空白对照组实验兔置于阵地10 km外营区喂养；反角隐蔽组和迎面角隐蔽组实验兔分别置于炮靶后反角或前迎面角10米远处深约1米掩体内，上覆盖硬质木板、松枝，留通气道。
1.4 兔肺爆震伤模型构建 各组实验兔演习前2小时放置到位。实弹演习现场由诸多火炮单元实施间断性炮火覆盖，全过程2 h，工兵排爆并清理阵地后进场取回实验兔。
1.5 病理研究 火炮打击结束6 h后用按5ml/kg体重剂量于耳缘静脉缓慢注射200g/L氨基甲酸乙酯麻醉，股动脉放血致死，开胸抽除胸腔积液，游离并摘取肺中叶近肺门处组织，4% 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋并切片。确保每只实验兔的肺组织有至少5张连续性切片以供后续的HE染色和免疫组化染色，病理染色由一名病理科技师独立完成。由两名病理医生按既往研究方法 [3] 评估所有切片的免疫反应分数（Immunoreactive Score，IRS），取其均值进行后续的统计比较。
1.6 统计方法 数据以均值±标准差形式表示。用LSD 检验（Least-significant difference）统计各组肺组织IRS评分差异。统计由SPSS14.0软件执行。P<0.05视作显著统计差异。
2 结果
2.1 肺爆震伤模型兔死亡率及临床表现 各组均无直接火力命中。反角隐蔽组实验兔全部存活，部分精神萎靡（3/6）、反应迟钝（4/6）、少部分外耳道出血（2/6）。迎面角18只实验兔现场死亡9只；余9只表现为伏地不起（3/9）、反应迟钝（6/9）、伴外耳道出血（7/9），其中3只实验兔呼吸急促、浅快、口唇发绀，平卧拒食，至处死时间节点前2小时内相继死亡，死亡率67.7%（12/18）。
2.2 肺脏HE染色结果 空白对照组肺脏切片HE显示，肺脏粘膜层、粘膜下层和外膜层结构完整、均匀，可见肺泡及肺内支气管和间质小动脉，支气管被覆假复层柱状纤毛上皮。核居中，肌浆红染。未见炎症细胞（图1A、1B）隐蔽组肺脏切片HE显示，肺泡结构存在。胞体肿胀，间隙狭窄，部分泡壁破坏。可见少量水肿。胞间少量红细胞分布，间质炎细胞浸润。（图1C、1D）；迎面角隐蔽组肺脏切片HE显示，肺泡结构紊乱，部分坏死，崩解，细胞数少。粘膜内膜、下层、外膜分界不清，基质渗出明显，夹杂水肿及聚集的多量红细胞填塞。血管痉挛狭窄，微血栓形成。炎症细胞浸润（图1E、1F）。
2.3 免疫组化肺脏组织p38-MARK的表达 各组肺脏组织中均有p38-MARK表达，主要在上皮细胞及结缔组织胞核中表达，形态学及免疫反应强度差异明显。空白对照组仅见个别细胞胞质、胞核黄染，p38-MARK少量表达（+）（图2A、2B）；反角隐蔽组，可见部分胞质、胞核黄染（++），p38-MARK中量表达。细胞肿胀，密集（图2C、2D）；迎面角隐蔽组，可见半数以上内皮细胞胞质、胞核膜均黄染，聚集红细胞黄染明显。间质充满渗出液和红细胞。p38-MARK大量表达（++++）（图2E、2F）。迎面角组、反角隐蔽组p38-MARK免疫反应强度均高于对照组，迎面角组p38-MARK免疫反应强度亦高于反角隐蔽组。
3 讨论
胸部损伤是现代战创伤的重要类型和研究热点。在非直接暴力损伤的情况下，火炮打击形成的强大冲击波（含应力波和剪切波）常对肺脏、听器和胃肠道等空腔脏器形成爆震损伤。肺爆震伤的发生机制在于冲击波抵达后首先对伤员胸壁产生压迫，使胸腔骤然缩小，增高的胸腔压力向内传导给肺脏，引起肺实质的出血、水肿；冲击波经过之后，受压变形的胸廓瞬间弹回，所形成的胸腔负压又使肺脏急剧向外扩张，再次加重肺实质损伤以及肋膈角、纵隔、肋间隙出血；最终形成多发的肺挫裂伤、血气胸及肋压迹[4, 5]。肺爆震伤伤员在外表上可无明显损伤，除非出现严重的呼吸急促、口唇发绀等临床症状，在战场救护中容易被忽视。与之相印证的是，在我们当前的研究中即便是那些看起来毫发无损的实验兔，其肺脏依然存在较轻程度的病理损伤。此外既往研究指出，肺爆震伤伤员如未能及时救治，则可因全身应激反应、损伤部位炎症级联反应和免疫反应等诸多继发性损伤而病情加重，严重者可出现重度肺出血、肺水肿、肺大泡、以及血气胸而影响呼吸功能甚至危及生命[6, 7]。
随着灾害医学的发展和临床上因各类爆炸导致的肺爆震伤伤员的增多，我们对肺爆震伤病情发展的认识逐渐加深[8]。肺爆震伤急性期致死率很高，与冲击波强度呈正相关，与距离冲击波起始点的距离呈负相关，现有的院前急救模式往往难以挽救生命[9]。李兵仓等人的研究结果表明，爆炸瞬时（0.46ms）实验动物肺部承受的超压达到(25.4±3.1)×102kpa 会导致动物直接死亡[10]。我们当前的研究观察到，位于迎面角掩体隐蔽组的肺爆震伤兔死亡率高达67%，而反角掩体隐蔽组实验兔的肺部损伤则明显减弱。现代战争的火炮打击强度持续加大，这对我们修筑战场工事提出了更高的要求。一方面应尽量设计反角掩体，一方面掩体挖掘必须达到一定的深度。
通气-血流比例失调造成的低氧血症是肺爆震伤病生改变的中心环节[11]。肺爆震伤以肺出血和肺水肿为突出特点，微血管通透性的增加早于这些临床表现并在其中发挥了基础性作用[12]。本研究中HE染色结果提示损伤部位毛细血管内皮细胞明显肿胀、血管腔狭窄、内皮细胞灶性脱落或间隙增大、内皮与基底膜分离形成腔隙，与既往研究结果是一致的。毛细血管膜结构的破坏直接导致了血浆白蛋白、纤维蛋白、红细胞、炎性细胞等大量渗出并集聚在肺泡腔内，并且内皮细胞的功能性和器质性损伤可妨碍肺泡II型上皮细胞（AT-2）合成及分泌肺表面活性物质（PS），进而导致肺顺应性降低、肺泡表面透明膜形成和弥漫性微肺不张[13]。肺泡腔内炎性渗出液的大量蓄积本身也导致更多有效肺泡膜面积“丢失”而出现严重弥散障碍。肺爆震伤导致的疼痛性呼吸受限和应激性全血高凝状态也进一步加剧了通气-血流比例失衡和呼吸功能障碍[14]。
炎症级联反应等介导的继发性肺损伤也在肺爆震伤的病情演进中扮演着重要角色，早期抗炎治疗对肺爆震伤的病情发展具有明确的临床意义[15]。Gorbunov等人对胸部爆炸伤模型动物的血浆、支气管肺泡灌洗液及肺组织进行了ELISA测定，结果表明爆炸伤后3-6小时内肺内NO、TNF-α和IL-8等多种炎症因子水平即出现进行性增高[16]。应该指出的是，冲击波造成的原发性肺损伤是后续炎细胞的趋化、迁移、聚集以及炎症递质的广泛释放的解剖基础。Brasel等开展的流行病学调查也表明，年龄和创伤严重度评分是胸部创伤预后不良的独立危险因素 [17]。正如我们在HE染色结果中所观察到的，肺爆震伤模型兔的肺间质内布满了中性粒细胞和单核巨噬细胞，并且其充布程度在迎面角掩体隐蔽组实验兔中较反角掩体隐蔽组明显增加，这也说明继发性炎症反应与原发损伤程度有关。
作为促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族成员之一,P38蛋白激酶能促进炎症细胞的聚集和活化,调节转录因子的活性及细胞因子的合成，对炎症反应的调控有着关键性的作用。本研究进一步证实，伴随着肺爆震伤的病情发展，受伤肺组织内P38染色强度、范围和阳性细胞率显著增高，而在正常肺组织内P38呈不表达或弱表达。P38过表达程度也与原发损伤程度密切相关，迎面角掩体隐蔽组实验兔肺组织内P38表达的IRS评分较反角掩体隐蔽组明显增高。既往研究指出，P38的表达和活化与细胞凋亡密切相关，它同时也与下游诸多炎症因子的表达和释放构成了一个正反馈循环。黄翠萍[18]等人研究证实肺泡巨噬细胞内P38活化后可上调胞核NF-kappaB、iNOS和NO的内生性表达，陈旭林[19]等人还发现活化型P38可参与TNF-α和IL-1β等下游炎症介质的表达调控，而TNF-α和NF-kappaB被认为是肺部炎症反应的关键因子。这些炎症因子的表达和释放反过来又进一步促进了P38的磷酸化激活。因为下游炎症因子繁多，针对它们的靶向治疗可因为旁路代偿而最终归于失败，这提示我们针对上游P38的靶向治疗可能对肺爆震伤的病情发展有着更好的治疗效果。既往研究表明，吡咯异咪哒唑衍生物SB203580是P38激酶的抑制剂，SB203580能够特异性地抑制单核细胞产生细胞因子IL-1和TNF-α[18]。这也为P38对肺爆震伤的靶向治疗提供了分子生物学依据。
4 结论
对实弹演习条件下兔火炮打击致肺爆震伤的临床观察及病理研究加深了我们对肺爆震伤的病理生理学机制的认识，也为我们的战术战伤救治提供了良好指导：1、维持气道通畅并纠正低氧血症至关重要；2、纠正休克、改善血液高凝状态和肺循环十分重要；3、早期肺泡灌洗有助于清除炎性渗出，避免炎症级联反应加重病理损伤；4、P38过表达参与了肺爆震伤的分子病理调控，是潜在的治疗靶标；5、反角掩体保护有助于减轻肺脏损伤。
参考文献
[1] Susan L. Eskridge, Caroline A. Macera, Michael R. Galarneau. Injuries from combat explosions in Iraq: Injury type, location, and severity [J]. Injury, 2012, 43(10): 1678–1682.
[2] 段维勋, 易定华. 爆炸性武器致胸部损伤的致伤机制 [J]. 中国急救医学, 2002, 22(6): 362-364.
[3] Gatto F, Feelders RA, van der Pas R, et al. Immunoreactivity score using an anti-sst2A receptor monoclonal antibody strongly predicts the biochemical response to adjuvant treatment with somatostatin analogs in acromegaly [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2013, 98(1): E66-71.
[4] Garner J, Brett SJ. Mechanisms of injury by explosive devices [J]. Anesthesiol Clin, 2007, 25(1):147-160.
[5] Commandeur J, Derksen RJ, Macdonald D, et al. Experimental animal models for studies on the mechanisms of blast-induced neurotrauma [J]. BMC Emerg Med, 2012, 10(12):12.
[6] 林也容, 张建华, 郁毅刚等. 山地团进攻制式火炮打击兔应激防护模型血清自由基变化实验研究 [J]. 临床和实验医学杂志, 2012, 11(15): 1167-1169.
[7] Sosiukin AE, Boiarintsev VV, Budko AA, et al. Pathology of lungs by wounded in the armed conflicts in Northern Caucasus [J]. Voen Med Zh, 2008, 329(11): 31-35, 96.
[8] Singleton JA, Gibb IE, Bull AM, et al. Primary blast lung injury prevalence and fatal injuries from explosions: insights from postmortem computed tomographic analysis of 121 improvised explosive device fatalities [J]. J Trauma Acute Care Surg, 2013, 75(2 Suppl 2): S269-274.
[9] Dixon BL, Glenn LL. Effects of associated factors with acute lung injury in combat casualties [J]. J Crit Care, 2013, 28(3): 311.
[10] 李兵仓,刘震,吴国萍等. 胸部爆炸伤后血浆及肺组织中NO、TNF-α和IL-8的变化及L-NAME的作用 [J]. 第三军医大学学报, 2001, 23(10): 1133-1135.
[11] Singh A, Deshkar AM, Kashyap BK, et al. Blast lung: experience at CIMS [J]. J Indian Med Assoc, 2012, 110(2): 126-127.
[12] 王建民,王正国,朱佩芳等.兔胸腹部爆炸伤后的血液浓缩与肺微血管通透性改变 [J]. 中国病理生理杂志, 2002, 18(9): 1049, 1080.
[13] Laterre PF,Wittebole X,Dhainant JF.Anticoagulant therapy in acute lung injury [J].Critical Care Medicine, 2003, 31(z1): s329-s336.
[14] Smith JE. Blast lung injury. J R Nav Med Serv, 2011, 97(3): 99-105
[15] Sanabria A, Valdivieso E, Gomez G. Prophylactic antibiotics in chest trauma A high guality studies meta-analysis [J].World Journal of Surgery, 2006, 30: 1843-1847.
[16] Gorbunov NV, McFaul SJ, Januszkiewicz A, et al. Pro-inflammatory alterations and status of blood plasma iron in a model of blast-induced lung trauma [J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2005, 18(3): 547-56.
[17] Brasel KJ, Guse CE, Layde P, et al. Rib fractures: relationship with pneumonia and mortality [J]. Crit Care Med, 2006, 34(6): 1642-1646.
[18] 黄翠萍, 张珍祥, 徐永健等. P38蛋白激酶和核因子κB对大鼠肺泡巨噬细胞一氧化氮合酶表达的调控 [J]. 华中科技大学学报（医学版）, 2005, 34(2): 185-188.
[19] 陈旭林, 夏照帆, 韦多等. p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路和核因子-κB/抑制因子κB通路在烧伤后促炎性细胞因子产生中的相互作用 [J]. 中华外科杂志, 2006, 44(7): 492-495.
基金项目：1全军十一五医学科研基金面上项目（06MB152）；2. 漳州市科技计划项目（Z10071）；3 .南京军区医学科研项目（12MA065）。本文内容经所在单位保密委员会审核通过。
图1. 火炮打击致兔肺震爆伤后肺组织HE染色结果 空白对照组肺脏切片HE显示，肺脏粘膜层、粘膜下层和外膜层结构完整、均匀，可见肺泡及肺内支气管和间质小动脉，支气管被覆假复层柱状纤毛上皮。核居中，肌浆红染。未见炎症细胞（图A、B）隐蔽组肺脏切片HE显示，肺泡结构存在。胞体肿胀，间隙狭窄，部分泡壁破坏。可见少量水肿。胞间少量红细胞分布，间质炎细胞浸润。（图C、D）；迎面角隐蔽组肺脏切片HE显示，肺泡结构紊乱，部分坏死，崩解，细胞数少。粘膜膜、下层、外膜分界不清，基质渗出明显，夹杂水肿及聚集的多量红细胞填塞。血管痉挛狭窄，微血栓形成。炎症细胞浸润（图E、F）。 
图2. 火炮打击致兔肺震爆伤后肺组织p38-MARK的表达 各组肺脏组织中均有p38-MARK表达，主要在上皮细胞及结缔组织胞核中表达，形态学及免疫反应强度差异明显。空白对照组仅见个别细胞胞质、胞核黄染，p38-MARK少量表达（+）（图A、B）；反角隐蔽组，可见部分胞质、胞核黄染（++），p38-MARK中量表达。细胞肿胀，密集（图C、D）；迎面角隐蔽组，可见半数以上内皮细胞胞质、胞核膜均黄染，聚集红细胞黄染明显。间质充满渗出液和红细胞。p38-MARK大量表达（++++）（图E、F）。迎面角组、反角隐蔽组p38-MARK免疫反应强度均高于对照组，迎面角组p38-MARK免疫反应强度亦高于反角隐蔽组。
论文作者:张建华1,林洪1, 2,刘升湘1,俞雄杰1,郁毅刚2
论文发表刊物:《医药前沿》2013年12月第34期供稿
论文发表时间:2014-1-15
标签：肺脏论文; 肺泡论文; 损伤论文; 细胞论文; 炎症论文; 火炮论文; 掩体论文; 《医药前沿》2013年12月第34期供稿论文;