成都市第三人民医院病理科 610000
摘要：目的：比较各种细胞块制备方法，以寻求简便、快捷、效果佳，利于诊断的细胞块制备方法，以此提高体液内肿瘤细胞病理诊断的检出率及准确性，以及利用免疫组织化学法对体液中细胞进行类型鉴别，和进行耐药基因表达产物的检测，并且提高恶性胸腹水的治疗效果。方法：琼脂、蛋清、戊二醛以及直接细胞块的制备。结果：50例胸腹水同时采用琼脂、蛋清、戊二醛以及直接体液离心制作细胞块，经固定、脱水、浸蜡、包埋、制片、HE染色，其中直接离心沉淀制作细胞块石蜡切片有7例查见癌细胞，余为琼脂制备4例、蛋清制备2例、戊二醛制备3例。结论：直接细胞块制备方法简单，操作步骤少，不易出差错，结果稳定，不需要特殊的材料和设备，可与平常的日常工作一起进行，HE及免疫组织化学染色背景清晰，效果满意。
关键词：细胞块；琼脂；蛋清；戊二醛
【Abstract】 Objective：To compare a variety of cell block preparation methods to find simple fast and good effect，which will help diagnose the cell block preparation methods.Tumor cells in body fluids in order to improve the detection rate of pathological diagnosis and accuracy，and the use of immunohistochemistry to identify the type of cells in body fluids，and for the detection of drug resistance gene expression products，and improve the treatment of malignant pleural effusion.Methods：agar，egg white，glutaraldehyde and direct cell block preparation.Results：50 cases of pleural effusion while using agar，egg white，glutaraldehyde，and direct production of body fluid centrifugal cell block，the fixation，dehydration，dipping wax，embedded，producer，HE staining，cells which produce direct centrifugation paraffin blocks have seven cases investigated，see cancer，more than for agar preparation in 4 cases，egg white preparation in 2 cases，glutaraldehyde prepared in 3 cases.Conclusions：Direct cell block preparation method is simple，small steps，not easy to go wrong，the results are stable，does not require special materials and equipment，with the usual daily work together，HE and immunohistochemical staining background of clear，satisfactory results.
【Key Words】 Cell block；Agar；Egg；Glutaraldehyde。
引言 病理细胞学因其简单易行，安全可靠，费用低，病人痛苦少或无痛苦，几乎无损伤，诊断迅速，可反复检查，多部位取材，在临床病理学得到广泛应用。但其不同于组织学，获取的有效成分有限，且没有组织学形态的支撑，对于良恶性肿瘤、恶性肿瘤分型等有一定局限性。因此，快速、多量的采集细胞有限成分，加以固定对病理细胞学的诊断有莫大的帮助。在此，采用了琼脂、蛋清、戊二醛以及直接离心细胞块的制作，并将其制作过程以及结果加以比较，推荐适合于临床病理的方法。
一．材料与方法
（一）材料 选用成都市第三人民医院病理科2011年4-6月所收到的胸腹水50例。800型离心沉淀器，Shandon Excelsion高级全自动组织脱水机。
（二）方法 将所收到的体液都分别进行琼脂、蛋清、戊二醛、以及直接离心制作细胞块石蜡切片。
1.琼脂细胞块制备法（图表1）：（1）将收到的胸腹水静置10 min后，倾去上清液，，摇匀后取底部混浊液体14ml至离心管，3000转/分，离心5-10分钟，反复3-5次。（2）离心完成后弃去上清液，沉渣中倒入10%的中性福尔马林固定1h。（3）吸干液体。（4）滴加少许融化的琼脂，摇动试管使其充分混合，3000转/分，离心，5-10分钟。此时，琼脂已凝固。（5）将琼脂块取出，切成大小合适的块状放入包埋盒。
2.蛋清细胞块制备法（图表2）：（1）将收到的胸腹水静置10 min后，倾去上清液，，摇匀后取底部混浊液体14ml至离心管，3000转/分，离心5-10分钟，反复3-5次。（2）固定：离心完成后弃去上清液，沉渣加鸡蛋清3ml，用扁平的竹签轻轻刮取试管底部的细胞，尽量使细胞成团悬浮于蛋清中，离心5分钟（2000转/分）。（3）去除多余蛋清，沿管壁轻轻加入10%中性福尔马林固定液2ml。蛋清遇到福尔马林立即凝固使细胞成团状，轻轻摇动，让细胞团块悬浮于固定液中，过夜。（4）轻轻取出细胞团块，用包埋纸包好，放入包埋盒。
3.戊二醛细胞块制备法（图表3）：（1）将收到的胸腹水静置10 min后，倾去上清液，，摇匀后取底部混浊液体14ml至离心管，3000转/分，离心5-10分钟，反复3-5次。（2）固定：离心完成后弃去上清液，加入3%戊二醛10ml，充分混合，3000转/分，离心5-10分钟。（3）用竹签轻轻将沉淀物取出，放入脱水盒。
4.直接细胞块制备法（图表4）：（1）将送检的体液标本静置10 min后，倾去上清液，摇匀后取底部混浊液体置于14 ml的一次性塑料试管中离心5-10 min，3000转/分，反复3-5次，离心后倾去上清液。（2）可见凝集块沉积于试管底部或一侧附壁，沿凝集块周边剪下试管壁，连同凝集块一起用包埋纸包裹，置于包埋盒。
5.脱水、透明、浸蜡：取出沉淀物用双层纱布包裹放入包埋盒，进入Shandon Excelsion高级全自动组织脱水机进行脱水，脱水时酒精温度为室温，85%酒精脱水90min，95%酒精脱水90min，无水乙醇Ⅰ脱水90min，无水乙醇Ⅱ脱水90min，二甲苯透明时温度为室温，二甲苯Ⅰ透明30min，二甲苯Ⅱ透明30min，浸蜡时温度为摄氏65度，石蜡为生物组织切片石蜡，浸蜡Ⅰ90min，浸蜡Ⅱ90min，浸蜡Ⅲ120min（其方法与普通组织一样）。
6.包埋：在包埋时将凝集块表面朝下，从多个角度切碎后再进行包埋。切片时易于切到有价值的细胞将细胞块，因为细胞在不同的层面分布密度不同。如果不切碎沉淀物包埋，所切的切面有可能细胞数量少或者没有肿瘤细胞分布在该层面。
7.切片：Leica切片机，切片厚度为4μm。
8.HE染色步骤：（1）切片在恒温干燥箱内脱蜡60min，温度为摄氏65度；（2）二甲苯Ⅰ脱蜡20min；（3）二甲苯Ⅱ脱蜡15min；（4）无水乙醇洗去二甲苯1min×2；（5）95%酒精1min；（6）90%酒精1min；（7）85%酒精1min；（8）自来水洗2min；（9）苏木精染色3min～5min；（10）自来水洗1min；（11）1%盐酸酒精分化20s；（12）自来水1min；（13）稀氨水（1%）反蓝30s，自来水洗1min；（14）伊红染色1min；（15）自来水1min；（16）85%酒精脱水20s；（17）90%酒精脱水30s；（18）95%酒精Ⅰ2min；（19）95%酒精Ⅱ1min；（20）无水乙醇Ⅰ2min；（21）无水乙醇Ⅱ1min；（22）切片在恒温干燥箱内干燥15～30min，温度为摄氏60度；（23）二甲苯Ⅰ2min；（24）二甲苯Ⅱ2min；（25）二甲苯Ⅲ1min；（26）中性树胶封片，完成制片过程。
二．结果
50例胸腹水中，直接细胞块石蜡切片中7例内查见癌细胞（其中送取活检三例，结果与细胞学结果一致），琼脂细胞块石蜡切片查见4例，蛋清细胞块查见2例，戊二醛细胞块石蜡切片查见4例。其中直接细胞块石蜡切片中细胞密度高，HE染色细胞膜、细胞质、细胞核显示清晰，着色好易于显微镜观察。
三．讨论
直接细胞块制备法与琼脂、蛋清、戊二醛细胞块制备法比较：
（一）操作便捷，细胞成分丢失少
琼脂包裹细胞成分并取出包埋时，其琼脂温度不易控制，易有空洞，切片中细胞成分较分散，后期细胞块保存易干裂；蛋清包裹细胞成分并取出包埋时，包裹效果欠佳，细胞成分丢失较多，固定时间较长，亦保存效果欠佳。
（二）细胞成分的保存
只使用戊二醛固定的样本无法阻止脱水、渗透和包埋过程对样本中脂类的抽提，因而对细胞膜的固定效果欠佳。戊二醛在稀释溶液中会自行发生一系列反应，因而应尽可能新鲜配制。相较而言，直接细胞块制备对于免疫组化和特殊染色的干扰更少。
（三）石蜡切片效果
直接细胞块石蜡切片HE染色细胞膜、细胞质、细胞核显示清晰，背景清晰，着色好易于显微镜观察，效果满意，避免了琼脂、蛋清包埋的那种模糊背景，以及着色模糊。戊二醛固定易使组织变脆变硬，不利于切片。
（四）生物危害
戊二醛带有刺激性气味，对眼睛、皮肤、粘膜有强烈的刺激作用，对环境有危害，对水体可造成污染。
四.结论
综上，我们认为直接细胞块制备方法简单，操作步骤少，不易出差错，结果稳定，不需要特殊的材料和设备，可与平常的日常工作一起进行，HE染色背景清晰，效果满意，保存效果良好，有利于免疫组织化学法对体液中细胞进行类型鉴别，提高体液内肿瘤细胞病理诊断的准确性，以及为分子病理诊断技术提供组织之外的稳定可靠的标本来源，更好的为临床治疗提供依据。
参考文献：
[1]王伯沄，李玉松，黄高升，张远强．病理学技术（M）．北京：人民卫生出版社．2000：。
[2]梁英达，凌启波，张威．临床病理学技术（M）．北京：人民卫生出版社．2011：。
[3]刘介眉，严庆汉等．病理组织染色的理论方法和应用（M）．北京：人民卫生出版社．1983：15-31。
[4]凌启波．实用病理特殊染色和组化技术（M）．广州：广东高等教育出版社．1989：180-320。
[5]谢深科，舒千玉，姚军．细胞块免疫标记在胸腹水细胞病理诊断与鉴别诊断（J）．中国医疗前沿．2011，4：1-3。
[6]邱瑞成，唐世洪，杨天真，刘玉竹．应用超声波快速石蜡技术制作细胞块（J）．实用医院临床杂志．2004，3：1-2。
[7]王永生，李玉红，任玉波．介绍一种新的细胞块制作方法（J）．临床与实验病理学杂志．2006，1：1-3。
[8]付海洋，王成勤，赵洁．快速石蜡法在胸腹水细胞蜡块制作中应用（J）．临床与实验病理学杂志．2012，7：1-3。
作者简介：邓晓玉（1985-），女，汉，成都人，医师，成都市第三人民医院，学士，主要从事细胞病理学研究。
论文作者:邓晓玉,唐艳
论文发表刊物:《健康世界》2014年22期供稿
论文发表时间:2016/4/1
标签：细胞论文; 琼脂论文; 蛋清论文; 切片论文; 石蜡论文; 胸腹论文; 病理论文; 《健康世界》2014年22期供稿论文;