哈尔滨医科大学附属第三医院 黑龙江哈尔滨 150040
【摘 要】目的：探讨全反式维甲酸（ATRA）和三氧化二砷（As2O3）对人子宫内膜癌HEC-2B细胞体外生长的抑制作用及其与分化相关基因NDRG1的相关性。 方法：采用MTT法比较ATRA和As2O3对HEC-2B细胞的抑制作用，应用Western blot法检测细胞中NDRG1基因蛋白表达情况。 结果：1×10-7-1×10-5mol/L 的ATRA和1.0-16.0umol/L的As2O3能够抑制子宫内膜癌细胞的生长，这种抑制作用呈剂量和时间依赖性（P<0.05）。结论：ATRA和As2O3能够抑制HEC-2B细胞的生长，这种抑制作用可能和NDRG1蛋白下调有关。
【关键词】子宫内膜肿瘤；全反式维甲酸；三氧化二砷；分化相关基因NDRG1；HEC-2B细胞
【中图分类号】R737.33 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）6-0128-02
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 子宫内膜癌HEC-2B细胞购自上海拜力生物科技有限公司；全反式维甲酸（ATRA）为Sigma公司产品；亚砷酸氯化钠注射液购自哈尔滨伊达药业有限公司；新生胎牛血清为Hyclone产品；DMEM高糖培养干粉为Gibco产品；MTT、DMSO购自哈尔滨弘博生物公司；蛋白marker（SM0671）为Fermentas产品；NDRG1抗体（5196）为CST产品；GAPDH抗体（5632-1）Rabbit Monoclonal Antibody为Epitomics公司产品；山羊抗兔IgG抗体（CW0103）购自康为世纪公司。
1.2 细胞培养 人子宫内膜癌HEC-2B细胞培养于含10%胎牛血清、100u/mL青霉素及100u/mL链霉素的DMEM高糖培养液中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，每日观察细胞生长情况，细胞单层贴壁生长，待细胞贴壁80%左右时行传代处理，取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法 处于对数生长期的细胞，当细胞汇合度达80%左右时，制成单细胞悬液，浓度为5x104/mL，以每孔100ul接种于96孔板，设置调零孔，调零孔加入200ul培养液。4h后代细胞贴壁分别加药处理，分为对照组和ATRA处理组、As2O3处理组，每组设5个复孔。ATRA组和As2O3组分为5个浓度梯度，分别加入96孔板中，每孔100ul，对照组加入100ul培养液，继续放入培养箱中培养。待细胞加药处理48h和72h后，每孔加入5mg/mlMTT各20ul，继续孵育4h，弃去96孔板中的培养液和MTT，加入150ul DMSO，摇床上振荡10min后，经酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度（A）值。细胞生长抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）x100%。每组实验重复3次，计算平均值。
1.4 Western blot 试验 设置ATRA5×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L和As2O32.0、4.0、8.0mmol/L处理48h的HEC-2B细胞为实验组，设未加药物的HEC-2B细胞为对照组，收集细胞，以PBS冲洗2次，1000rpn，离心5min。用PBS液悬浮细胞分别移至1.5 ml的EP管中，5000rpn，4℃，离心10min后去上清，每管中加入含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解10min后，14000rpn，4℃，离心10min，取上清，按bradford法进行蛋白定量，加入上样缓冲液，99℃，煮5min，备用。进行SDS-PAGE电泳，配置10%的分离胶，4%的浓缩胶，每孔按总蛋白量30ug上样，一侧加入预染的蛋白marker以确定目的蛋白位置。将分离的目的蛋白转移至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉的封闭液室温封闭1h，加入1:1000的NDRG1抗体和1:10000的GAPDH抗体，4℃过夜。洗膜后加入1:5000稀释的二抗羊抗兔IgG，室温1h，洗膜后于暗室中在ECL发光剂中反应2-3min，压X光片20min，显影和定影。
1.5 统计学分析 采用SPSS10.0进行统计学处理，组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞形态学改变 镜下观察，对照组HEC-2B细胞为不规则的多角形，贴壁牢固，经As2O3和ATRA处理的实验组细胞形态不规则，呈长梭形，折光性降低，细胞核/细胞质比值减小，胞质内颗粒增多，随着时间的延长细胞伸展较大，逐渐脱壁，悬浮细胞逐渐增多，出现细胞凋亡的特征性改变。
2.2 ATRA对HEC-2B细胞的生长的抑制作用 MTT比色法结果显示ATRA浓度在1×10-7 -1×10-5mol/L时对HEC-2B细胞有明显的抑制作用，且抑制率随药物浓度的升高和作用时间的延长而增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表一和图一。
2.3 As2O3对HEC-2B细胞生长的抑制作用 MTT比色法结果显示As2O3浓度在1.0-16.0umol/L时对HEC-2B细胞有明显的抑制作用，且抑制率随药物浓度的升高和作用时间的延长而增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表二和图二。
2.4 ATRA对NDRG1蛋白表达的影响 Western blot 结果显示，与对照组比较，ATRA处理组NDRG1蛋白表达减弱，且随ATRA浓度的增加，NDRG1的蛋白表达逐渐下调。见图三。
注：C为对照组，1、2、3分别为As2O3 2.0μmol/L，4.0μmol/L，8.0μmol/L
3 讨论
全反式维甲酸是维生素A的衍生物，它潜在调节各种细胞基质形成，细胞生长和分化，同时，在胚胎形成中起着重要作用。研究显示[1]，ATRA能够改变细胞周期的分布，使多数肿瘤细胞停滞于细胞分化期，即G1期，阻止细胞向S期转化，从而减少细胞的分裂并促其分化。
三氧化二砷是中药砒霜的主要成分，在中国作为药物用于多种疾病的治疗。由于As2O3对血液系统疾病，特别是APL治疗的成功，使其完全缓解率由57%上升到98%，使得As2O3成为一种非常重要的治疗血液系统疾病的药物。胡美丽[2]等提示As2O3通过诱导细胞凋亡和导致S期、G2/M期细胞周期阻滞而抑制HEC-1A细胞生长。
NDRG1是与分化相关的基因，定位于人染色体8q24.3，长约60kb，包含16个外显子和15个内含子，编码蛋白产物含有394个氨基酸。研究显示，在某些肿瘤中NDRG1的表达较正常组织中减少，如食管癌、乳腺癌等，提示NDRG1可以抑制肿瘤生长和转移。在乳腺癌、神经胶质瘤中NDRG1作为诊断标志，其表达与预后有关。相反，在肝癌、肾癌、口腔上皮细胞癌、皮肤癌、子宫内膜癌中NDRG1高表达，提示其可能促进肿瘤生长。因此，NDRG1成为肿瘤治疗的新靶点。
参考文献
[1] 贺付成，李惠翔，高冬玲，等。全反式维甲酸对食管癌细胞增殖及其分化相关基因mRNA表达的影响[J]。中华消化杂志，2006，26（12）：833-834。
[2] 胡美丽，李利，王晓玲，等。三氧化二砷抑制子宫内膜癌生长的体内外实验研究[J]。肿瘤，2009,29（7）：616-619。
基金项目：
黑龙江省教育厅科学技术研究项目[12511343]
通讯作者：
孟媛媛 主治医师 哈医大附属肿瘤医院 。MYY13136672698@126.com
作者简介：
耿晓星（1955-），女，主任医生，教授，硕士生导师。Gxx8866@yahoo.com
论文作者:耿晓星,孟媛媛
论文发表刊物:《中医学报》2015年6月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/12
标签：细胞论文; 抑制论文; 蛋白论文; 反式论文; 甲酸论文; 作用论文; 浓度论文; 《中医学报》2015年6月第30卷供稿论文;