叶小丽, 吕茂民, 颜奇坡, 吴健敏, 田克恭[1]2011年在《整合猪内源性反转录病毒囊膜蛋白的假型鼠干细胞病毒的包装及鉴定》文中指出目的猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)是猪-人异种移植及猪源血液代用品的研发中备受关注的病毒。PERV存在跨种传播感染人源细胞的风险,但是目前对它的宿主范围和细胞嗜性并不明确,而且PERV难以体外操作也阻碍了这一方面的相关研究。本研究旨在包装带有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Prontein,GFP)标签的PERV囊膜化的假型鼠干细胞病毒,为研究PERV的宿主细胞嗜性范围奠定基础。方法向鼠干细胞病毒载体(MSCV)内插入GFP报告基因,并经菌落PCR、酶切及测序鉴定;将真核表达质粒pHCMV-env、反转录病毒载体MSCVneo-GFP和辅助质粒pGag-Pol叁质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,72h后收集转染细胞培养上清,低温超速离心浓缩上清液后直接感染HEK293T细胞,对病毒的感染性进行检测,并利用流式细胞仪对病毒滴度进行监测。结果成功将GFP插入反转录病毒载体;包装病毒感染HEK293T细胞结果表明,假型病毒粒子包装成功并且具有感染性,流式分析检测病毒粒子滴度为1.4×10~3(cfu/ml)。结论包装得到的表达GFP的整合猪内源性反转录病毒的假型鼠干细胞病毒粒子具有有效的感染性;该研究结果为深入研究PERV的宿主范围和细胞嗜性及PERV与感染细胞的相互作用提供了安全、有效的技术支持。
颜奇坡[2]2010年在《中国特有小型猪内源性反转录病毒感染性克隆的构建与鉴定》文中认为异种移植,就是通过将动物器官、组织、细胞等移植到人体内,来解决机体组织器官功能障碍并达到治疗的目的。而人源供体器官的严重短缺,就需要通过异种移植作为替代途径解决。猪源器官的器官大小、生理学特点等都与人类相近,被认为是最合适的异种移植供体。异种移植中除了各种排斥反应、组织器官相容性等考虑外,最主要的担忧就是异种移植人兽共患病的跨种传播。研究发现猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV)体外能够感染包括人源细胞在内的多个细胞系,严重阻碍了猪→人异种移植的研究进程。我国有着异常丰富的猪种资源,其中各种小型猪是适合医学实验研究和人类异种移植的优良品种。目前我国的小型猪品系主要有:五指山猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪、版纳小型猪等。在解剖学特征、生理学特性、营养代谢等方面与人类极为相似,非常适合用于人的异种器官移植,将来很有可能发展成为异种移植的优良供体。本研究室在对我国主要小型猪PERV存在及表达情况的研究中发现,所有不同种系中均存在PERV,但病毒拷贝数不同,其中五指山猪基因组中PERV的拷贝数较低,因而更适合于异种移植。PERV以前病毒DNA形式整合到猪细胞基因组中,并随染色体的复制而复制,因此无法从正常的细胞或组织中彻底消除。虽然大部分的研究结果均表明PERV并不引起任何感染性疾病,而且PERV感染人源细胞后也没有发生细胞病变,但这种隐性感染是否会如同其它反转录病毒一样通过潜在的与宿主细胞相互作用引发肿瘤或者癌变?一旦猪源器官或细胞移植到高度免疫抑制的患者体内时,PERV的跨种感染及表达情况又是如何?其潜在的病理效应仍然是个不可轻视的问题。深入研究PERV分子生物学特性,能够了解病毒的生命调控过程,阐明病毒感染、组装、整合机制,为研究PERV与宿主细胞间的相互作用、探索PERV感染人源细胞后可能产生的效应奠定分子基础。然而,由于RNA病毒体外操作困难,对反转录病毒的复制、组装和侵入分子机制,病毒生活周期以及病毒与宿主细胞相互作用等的研究进展一直停滞不前,直到二十世纪七十年代末,随着反向遗传学技术的推广以及感染性克隆技术的广泛应用,RNA病毒的研究瓶颈得到突破并取得了诸多重大成就,该技术实现了在DNA分子水平上对RNA病毒的体外操作,是用于研究病毒组成结构以及生物学功能很好的方法,也称之为病毒拯救。在国外,目前已构建成功PERV-A、PERV-B等多株不同猪种感染性克隆,并对其复制机制以及分子生物学功能进行系统研究,而我国至今尚未见PERV感染性克隆构建的相关报道。本研究以五指山来源小型猪为研究对象,构建五指山猪来源PERV感染性克隆,为下一步研究五指山猪PERV分子生物学特性奠定基础。首先根据GenBank上PERV序列(No.EF133960)设计两对引物分别用于扩增PERV 5’half和3’half两个片段,并根据pBluescriptⅡSK+载体特点,在5’half的5’端添加Sal I酶切位点。3’half的3’端添加Xba I酶切位点,两片段重迭处均有PERV中唯一的NheI酶切位点,首先通过PCR扩增得到五指山猪PERV前病毒全基因,根据基因克隆和重组等技术获得pBluescript SK+-WZS-PERV全基因克隆,并经菌落PCR和酶切鉴定正确。根据此方法共构建9个PERV前病毒全基因克隆用于感染性克隆的筛选。将9个全基因克隆分别转染HEK293细胞后,经PCR、RT-PCR鉴定分析,结果发现仅有1个全基因克隆转染后细胞中有PERV叁种结构基因的存在与表达,将该克隆命名为WZS-PERV(2)。收集转染后的细胞培养上清,感染新的HEK293细胞,通过PCR鉴定PERV已经整合入HEK293细胞基因组中。将病毒盲传6代,采用基于SYBR Green I的实时荧光定量RT-PCR方法对PERV mRNA表达情况进行初步分析,结果均为阳性,此外,相对定量分析结构显示各代次间PERV mRNA表达情况存在差异。采用SDS-PAGE电泳及Western Blot检测分析PERV-Gag蛋白的表达情况,在WZS-PERV(2)转染以及病毒感染后的HEK293蛋白样品中均出现60kDa、40 kDa、27 kDa的预期条带,说明细胞中存在PERV-Gag蛋白的特异性表达。同时运用间接免疫荧光法分析PERV在HEK293细胞中的表达情况,激光扫描共聚焦显微镜观察到PERV感染后HEK293细胞胞浆中显示绿色荧光,进一步证实细胞中表达了PERV-Gag蛋白。通过透射电子显微镜观察到较典型的PERV病毒粒子。对感染性克隆进行序列测定后发现,序列中gag、pol、env叁个编码基因均具有完整的ORF,以及两端的LTR,基因组全长为8939bp,将序列与GenBank中其他PERV序列进行比对分析,同时进行文献调研,结果发现,在该序列的LTR中含有典型的21bp(417bp～437bp)-24bp(438bp～461bp)-37bp(464bp～500bp)区域,即与文献中报道的PERV A/C重组毒株的LTR区域具有相同的特点,但存在数个碱基的突变,该结果初步说明:在本研究中获得的五指山猪来源的PERV感染性克隆具有PERV-C亚型的LTR及PERV-A亚型的受体结合区(RBD)序列,因此也属于PERV A/C重组毒株,而且该克隆能够在体外感染人胚肾细胞HEK293,即具有嗜人性特点。此外,通过生物信息学方法分析还发现,在LTR序列中的21bp-24bp-37bp区域,存在NF-Y等多个转录因子结合位点,因此该区域应为影响嗜人性PERV感染性的区域。结合前期对五指山猪的研究工作还发现,五指山猪近交系繁育多代后, PERV的序列中发生了较多的G→A突变,结合目前天然免疫抗病毒分子猪APOBEC3F(pA3F)效应机制分析,我们推测,可能是APOBEC家族成员pA3F的作用使PERV发生了较多G→A突变,但具体的作用机制以及发生突变的原因还有待进一步验证,因此本研究也为PERV变异特征及其机制研究提供线索。本研究在成功构建我国五指山猪来源的PERV前病毒全基因克隆后,首次构建并筛选获得PERV感染性分子克隆,这对于阐明嗜人性PERV的生物学特性,探索PERV感染人源细胞后可能产生的潜在的生理病理效应,以及分析和评价其在猪-人异种移植中的病原安全性都具有重要意义。在感染性克隆的基础上,还可以对PERV各编码基因进行改造,通过缺失、突变、嵌合以及修饰等方式,更好的对关键编码蛋白区域进行功能分析,帮助了解PERV生命调控过程和潜在致病分子机制,进行抗病毒研究。此外,PERV感染性克隆还可用于反转录病毒载体、新型核酸疫苗等研究,为最终实现猪→人异种移植奠定分子基础。
吕茂民[3]2002年在《猪内源性反转录病毒的相关研究》文中认为猪作为实验动物已经在胚胎学、肿瘤学、免疫学以及人类多种疾病的研究中得到了广泛的应用。由于猪的心血管系统、消化系统、皮肤系统等与人类具有较大的相似性，一直是人类异种器官移植的首选供体，并且猪→人异种移植的研究也取得了令人鼓舞的进展。 1997年，Pateince等首次发现猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)在体外可以感染人的多种细胞，这一发现引起了人们对异种移植安全性的广泛关注，人们担心带有PERV的猪源细胞或器官一旦植入高度免疫抑制的人体内会否突破种间屏障造成人源大流行。因此，猪内源性病毒的研究与检测是猪→人异种器官移植、人用猪源生物制品等生物安全性的基础，也是进行高等级医学实验的前提。 我国已经开展了猪→人异种器官移植的相关项目，但PERV的研究尚属空白。为了开发利用我国小型猪猪种资源并为实验用猪的病原安全性提供可靠的评价，我们开展了PERV的相关研究工作。 我们结合国内开展的相关科研项目进行了PERV的前期研究工作，现分述如下： 1．PERV特异性检测方法的建立及对猪源传代细胞系的检测。根据已发表的PERV相关序列，合成了6对引物，应用PCR的方法对4株猪源细胞DNA样品及COS-7细胞DNA对照样品进行检测并对反应条件进行了优化，结果表明此方法能特异性地检测出PERV前病毒的存在情况：应用RT-PCR的方法对5种细胞的RNA样品进行检测PERV表达情况，结果显示所建立的RT-PCR方法也是特异的。PERV特异性检测方法的建立为我们后面的研究工作打下了基础。 2．中华实验小型猪中内源性反转录病毒的存在与表达。应用PCR和RT-PCR的方法，对来源于中华实验小型猪外周血淋巴细胞(PBL)的DNA和RNA样品进行了系统的检测。结果表明，在所有被检样品中均有PERV前病毒的存在，且存在于基因组中的前病毒均能以mRNA的形式进行表达。由于囊膜基回具有一定的变异性，根据env基因的不同通常将PERV分为叁种个问的亚到，即 PERV－A、PERV－B和 PERV－C。应用分型引物对被检样品进行了分型检测，结果显示在所有的样品中均有A和B亚型的存在与表达，只有两例检出了C亚型前病毒的存在；所有样品中均未检出PERV（的表达。本研究对我国特有小型猪的实验动物化具有重要意义。 3．中华实验小型猪来源的PERV囊膜基因的克隆与同源序列比较。应用RT．PCR 的方法从中华实验小型猪外周血淋巴细胞RNA样品中钓取了PERVenv基因，并克隆至pGEM＊载体。序列测定表明，所克隆的env基因含有2004个核着酸。经序列分析证实，该片段含有一个完整的读码框架，长为1983hp，编码660个氨基酸，为PE RVRV－A亚型。同源序列比较．显小，该基因与法系大白猪来源的P＊RV叭1的囊膜基因具有97％的序列同源。他与欧洲小型猪来源的PERV囊膜基因具有82％的序列同源性。序列测定的结果为进一步从分于水平研究PERV奠定了基础。 4．猪内源性反转录病毒感染人HEK293细胞模型的建立。为了证实PERV对人源细胞的感染，首先，将含有neo基因的质粒pIRESneo通过脂质体转染了 293细胞，并培育了 G418抗性的 HEK293细胞。然后应用 PK15和 G418抗。叮293细胞共培养、经G418加压筛选的方法成功地建立了PERV感染HEK293细胞的模型。这一感染模型的成功建立，为今后的研究工作提供了一个极好的实验平台，也有利于对PERV的病原安全性作进一步的评价。 综上所述，本课题的研究工作己具有了良好基础，为进一步深入研究PERV创造了条件，也为进行PERV安全性评价提供了依据。
马玉媛, 吕茂民, 吴建敏, 丁芳, 徐述[4]2006年在《我国小型猪内源性反转录病毒的相关研究》文中进行了进一步梳理随着移植医学和免疫学研究的进展,也由于人源供体器官的短缺,猪被选定为最合适的异种移植供体。现今,猪心脏瓣膜已成功地移植入人体内,猪皮肤已作为烧伤病人的暂时覆盖物,猪胰岛细胞已被植入糖尿病人体内,猪→人异种移植已展现出十分诱人的前景。
丁芳[5]2006年在《猪内源性反转录病毒的检测、启动子活性分析及载体构建》文中研究表明临床上，供体器官的严重短缺，使人们将目光转向了异种移植。到目前为止，猪被认为是最适合的异种移植供体。但研究发现，以前病毒DNA形式整合进猪体细胞基因组中的猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)在体外能够感染多种人源细胞，这引起了人们对异种移植安全性的广泛关注。我国有着丰富的小型猪种资源，目前已经开展猪-人异种器官／组织移植的相关研究，但有关小型猪中PERV的携带、表达情况以及内源性释放毒株的生物学特性方面报道甚少，因此有必要开展这方面的研究工作，了解我国小型猪中PERV存在的本底，为异种器官受体提供安全可靠的器官，同时通过分析PERV5′非编码区的启动子活性，为进一步研究PERV的生物学特性搭建技术平台。另外，由于传统的逆转录病毒载体在介导基因转移的过程中存在着包装病毒的滴度较低以及某些病原的安全问题，而基于PERV的长末端重复序列构建的逆转录病毒载体则有可能解决这些问题，因为PERV是猪在进化过程中获得的反转录病毒序列，每个细胞中PERV的拷贝数约为8-15个，尚未发现其致病性，并且由于在猪源细胞中有同源序列的存在，转染载体至猪源细胞有可能获得较高的包装病毒滴度。目前国际上对PERV的研究均着眼于异种移植中其病原安全性的评价等方面，至今尚未见有利用其作为逆转录病毒载体的报道，因而，本研究也构建了以PERV长末端重复序列为调控序列的逆转录病毒载体。本研究主要进行以下叁个方面的工作： 1．中国五指山猪中PERV存在与表达情况的调查 检测分析猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus；PERV)在中国五指山猪中的携带、表达情况。首先根据军事医学科学院野战输血研究所已建立的PCR、RT-PCR方法，应用通用的env基因分型方法检测PERV env-A、env-B、env-C在我国主要小型猪种之一的五指山猪基因组中的存在与表达情况。随后又对五指山猪中PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)及囊膜基因(env)的存在与表达进行检测。结果发现：从病毒存在的情况看，我国五指山猪基因组中普遍存在PERV，其阳性率达100％。PERV的存在以A亚型最高(97.01％)，其次为B亚型(94.03％)，此次未检测到C亚型的存在；从病毒的表达情况看，PERV-B亚型的表达率高于A亚型，但所有的样品均未检测到PERV-C型的表达。从病毒主要结构蛋白的存在与表达情况看，五指山猪基因组中不仅存在PERV
吴健敏[6]2004年在《中国特有小型猪内源性反转录病毒的检测与全基因克隆》文中研究表明临床上,供体器官的严重短缺,使人们将目光转向了异种移植。目前为止,猪被认为是最适合的异种移植供体。但研究发现,以前病毒DNA形式整合进猪体细胞基因组中的猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)在体外能够感染多种人源细胞,这引起了人们对异种移植安全性的广泛关注。我国有着丰富的小型猪种资源,目前已经开展猪-人异种器官/组织移植的相关研究,但有关小型猪中PERV的携带、表达情况以及内源性释放毒株的生物学特性方面报道甚少,因此有必要开展这方面的研究工作,了解我国小型猪中PERV存在的本底,为异种器官受体提供安全可靠的器官,同时通过构建细胞感染模型与全基因克隆,为进一步研究PERV的生物学特性及PERV对人源细胞的感染机制搭建技术平台。为此本研究主要进行以下四个方面的工作: (1) 中国特有小型猪PERV存在情况的普查 采集了6个省市10个单位、5个品种、17个猪群259份血样,通过PCR检测发现:我国小型猪基因组中普遍存在PERV,其阳性率达100%。其中以B亚型最高(95.37%),其次为A亚型(67.18%)、C亚型(42.08%),目前为止没有筛选到无PERV的阴性猪个体。PERV主要结构蛋白基因gag、pol、env不仅在小型猪基因组中存在,而且都能够转录为RNA。除了检测不到PERV-C亚型病毒的表达外,大部分A、B亚型病毒都能够表达,且A亚型的表达率高于B亚型。值得注意的是我国小型猪中各种PERV亚型病毒混合存在的现象十分普遍,有78.38%存在2种以上PERV亚型病毒混合感染,因此小型猪中存在不同PERV亚型病毒重组的可能性。 (2) 不同PERV HEK293细胞感染模型的建立 利用本实验室已经建立的G418抗性HEK293细胞(G418~R293),将五指山猪(WZS)、中国实验小型猪(ZGSY)、巴马香猪(BMXZ)、巴马小型猪(BM)及贵州香猪(GZ)外周血淋巴细胞分别与G418~R293细胞共培养,通过G418加压筛选,除去共培养体系中的猪外周血淋巴细胞,然后应用PCR及RT-PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。通过上述方法已成功建立了5个来自小型猪外周血淋巴细胞的PERV HEK293细胞感染模型,证实了猪外周血淋巴细胞来源的PERV在体外也能够感染人源细胞系,为研究PERV的生物学特性及病原安全性的评价搭建了技术平台。 (3) PERV-WZS株等病毒全基因组序列测定 本研究利用PCR及RACE技术完成了五指山小型猪、巴马小型猪及来源于HEK293细胞感染模型的猪内源性反转录病毒的全基因组序列测定,3个毒株的大小分别为8639 bp、8595 bp、8689 bp。分型检测均为PERV-A亚型病毒。遗传
张念[7]2013年在《中国特有小型猪内源性反转录病毒检测及变异特征研究》文中研究表明活细胞、组织、器官在不同物种间的移植被应用于缓解人源供体器官的短缺。考虑到器官大小、生理学特点、伦理道德等方面的问题，猪被认为是最合适的异种移植供体。然而猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus,PERV）感染人源细胞系和重度联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠的报道，使临床异种移植病原安全性成为人们关注的焦点。我国具有丰富的小型猪资源，其遗传稳定、繁殖周期短、耐粗饲等优点使其有望成为异种移植的优良供体。为了我国小型猪种资源的开发利用及提供安全可靠的供体器官，因此，在前期研究的基础上，深入开展PERV相关研究。一方面能够了解我国小型猪基因组中PERV的存在及表达状况、PERV分型及表达状况、PERV拷贝数，最终筛选出PERV低拷贝、PERV-C亚型阴性小型猪，为培育PERV阴性小型猪奠定基础；另一方面研究我国五指山小型猪PERV变异特征，为后期研究病毒的变异机制以及对异种移植病原安全性进行深入评价奠定基础。1PERV低拷贝、PERV-C亚型阴性小型猪的筛选为了减低PERV感染风险，有必要筛选PERV低拷贝、PERV-C阴性小型猪。首先，根据PERV检测引物PERV-gag、pol、env，使用PCR及RT-PCR技术对108份小型猪样品（45份贵州小型猪、63份巴马小型猪）基因组DNA、cDNA进行检测，了解PERV存在及表达情况；其次，根据PERV通用分型引物对PERV进行分型鉴定及表达检测；最后，以TFRC为参考基因，SYBR GreenⅠ染料法实时定量PCR检测PERV-C亚型阴性小型猪PERV-拷贝数。结果显示：（1）108份中国特有小型猪样品基因组中PERV存在及表达均为阳性。（2）PERV-A亚型、PERV-B亚型普遍存在于小型猪基因组中，PERV-A、PERV-B、PERV-C存在率分别为97.22（105/108）、97.22%(105/108)、39.81%(43/108)。其中贵州小型猪PERV-A、B亚型表达率为75.56%（34/45）、73.33%(33/45)，巴马小型猪表达率分别为77.78%(49/63)、76.19%(48/63)。贵州小型猪中PERV-C亚型存在率较高，可达95.56%(43/45)、其表达率为31.11%(14/45)，巴马小型猪PERV-C亚型存在及表达率均为0%（0/63）。（3）不同品系或同一品系不同个体基因组中PERV拷贝数不同，最低拷贝数2.48±0.59，最高可达57.62±8.18。对中国特有小型猪PERV亚型存在及表达进行检测，有助于了解PERV各亚型在不同小型猪品系中的分布。在此基础上筛选低拷贝、PERV-C阴性小型猪，在一定程度上能够减少病毒粒子的释放及传播，降低异种移植中PERV带来的风险，也为下一步培育PERV阴性小型猪奠定基础，对中国特有小型猪的开发利用具有重要意义。2五指山小型猪内源性反转录病毒变异特征研究为了分析近交系不同代次五指山小型猪内源性反转录病毒变异特征，用常规PCR方法扩增近交系连续五代次（共15个样品）五指山小型猪PERV-env基因全长，全长为1981bp，共获得45条核苷酸序列，运用生物信息学方法将其与参考序列进行多重序列比对和遗传进化分析。结果显示：本实验获得的PERV-env核苷酸序列中有较多碱基突变，G→A突变数目相对其他碱基明显较多， G→A突变数最多可达40个，G→A突变率最高可达60.43%。单因素方差分析表明，连续五代次小型猪PERV G→A突变数目无明显差异， G→A突变点偏好发生于负链TC、CC，且在PERV-env核苷酸序列190bp和1875bp位置均有G→A突变发生。本实验所获得的PERV-env核苷酸序列与国外小型猪PERV-A序列亲缘关系很接近，但仍存在差异。本实验将有助于深入研究pA3F对五指山猪PERV病毒复制的影响及作用机制，为进一步开展异种移植中PERV的病毒安全性评价奠定基础。
晁哲, 吴望军, 刘海隆, 孙瑞萍, 王峰[8]2018年在《海南地方猪内源性反转录病毒的检测分析》文中进行了进一步梳理为了解猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)在海南地方猪种五指山猪和海南猪基因组中的存在状况。试验利用猪内源性反转录病毒特异性引物对这两种猪的基因组进行PCR检测。结果显示:PERV普遍存在于海南地方猪基因组中,其中在五指山猪中PERV-A、PERV-B、PERV-C存在率分别是100%、100%、20.69%;在海南猪中PERV-A、PERV-B、PERV-C存在率分别是100%、100%、25.49%。该研究为海南地方猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。
马玉媛[9]2009年在《中国特有小型猪内源性反转录病毒的检测与特性分析》文中认为由于人源供体器官的短缺,人们希望借助异种移植来获得大量的组织/器官移植物,猪被选定为最合适的异种移植供体。然而,猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)在体外能够感染多种人源细胞的发现,引起了人们对异种移植病原安全性的广泛关注,即带有PERV的猪细胞/组织/器官一旦植入处于高度免疫抑制的病人体内,是否可能突破种间屏障造成人源大流行?国际上要求对人类异种移植建立远期评估的呼声越来越高,有关PERV生物学特性的研究及对PERV的病原安全性进行评价成为一个新的热点。我国丰富的小型猪种资源有望为猪→人异种移植提供优良供体,目前已经开展异种移植的相关研究,人用转基因猪皮肤已经进入产业化阶段,但对PERV的研究尚未引起充分的重视。为了开发利用我国小型猪种资源,为异种器官移植受体提供安全可靠的供体器官,我们在前期研究的基础上,有必要深入开展PERV相关研究。一方面进一步了解我国小型猪种群中PERV的存在状况,为筛选PERV低拷贝猪奠定基础;另一方面研究我国小型猪内源性释放毒株的生物学特性,并探索嗜人性PERV感染人源细胞后产生的分子效应,为揭示PERV的潜在病理作用及进行异种移植的病原安全性评价打下基础。为此本研究主要进行了以下工作:(1)中国特有小型猪内源性反转录病毒拷贝数的检测设计并合成了检测PERV pol基因的引物,运用实时荧光定量PCR方法对中国特有小型猪基因组中整合的PERV拷贝数进行了系统检测,结果表明,五指山猪与巴马小型猪基因组中均可检测到pol基因的存在,五指山猪单细胞基因组中PERV的拷贝数为1.38±0.33至14.23±3.31之间,巴马小型猪单细胞基因组中PERV的拷贝数为2.96±0.76至58.46±3.50之间。统计学分析表明五指山猪与巴马小型猪单细胞基因组中PERV的拷贝数具有显着性差异,五指山猪基因组中整合的PERV拷贝数较低。五指山猪基因组中PERV的基因序列负荷较低,因此有希望通过选择性育种获得PERV低拷贝猪,在此基础上则易于进一步筛选出无完整PERV前病毒的小型猪个体,也易于通过基因敲除去除PERV,从而为异种移植提供合适供体。此外,基于SYBR Green I的PERV拷贝数的定量PCR检测方法,与Southern Blot检测拷贝数的方法相比具有明显的优越性,简便易行,可在短时间内检测大量样品,费用低廉,利于对猪群进行大规模筛选,既可用于实验用猪的病原安全性评价,也可用于异种移植后PERV存在与表达状况的监测。(2)五指山猪内源性反转录病毒前病毒全基因克隆与序列分析应用PCR技术将五指山猪内源性反转录病毒前病毒全基因分为两段进行扩增,然后构建前病毒全基因克隆,运用生物信息学方法对其序列进行分析,并与Genbank中收录的其他PERV全基因序列进行比对,在此基础上还进行了进化分析,构建了基于Env氨基酸序列的进化树。结果表明,五指山猪来源的PERV前病毒全长为8899bp,含有完整的gag、pol、env的ORF,两端为5’LTR与3’LTR两个长末端重复序列。序列比对分析发现PERV-WZSP与其他来源的PERV毒株高度相似但仍具有一定的差异性。进化分析结果表明PERV-WZSP与其他A亚型毒株属于同一分支,这与PCR分型鉴定的结果也相一致。此外,我们还发现该株PERV前病毒的5’LTR中有多个U3重复盒的存在,这可能会导致PERV-WZSP在宿主细胞中复制能力的增强;3’LTR中含有PERV-C亚型中的特异性序列,这将可能导致部分的PERV-C序列与PERV-A序列发生重组。然而,我们还需要进行更深入的研究来对这种推测进行验证。本研究有助于深入了解五指山猪内源性反转录病毒的分子生物学特性,并为下一步构建PERV感染性克隆奠定了良好基础。(3)嗜人性PERV感染人源细胞模型的构建与鉴定为了研究嗜人性PERV感染人源细胞后的分子效应并探索其可能的病理作用,我们首先构建并筛选具有较高反转录酶活性的PERV细胞感染模型。采用细胞共培养的方法,将五指山猪PBMC与HEK293细胞共培养24h后除去PBMC,建立五指山猪来源PERV的体外细胞感染模型。共培养后的HEK293细胞在形态、生长特性及折光性上与阴性对照HEK293细胞没有明显差异。为证实共培养后的HEK293细胞感染了PERV,采用了PCR方法检测共培养后HEK293细胞中PERV结构基因gag、pol、env的存在,采用RT-PCR检测gag、pol、env的mRNA的表达,采用Western Blot方法鉴定Gag蛋白的表达,进一步采用反转录酶活性检测实验筛选具有较高反转录酶活性的嗜人性PERV的人源细胞,结果表明共培养后第49天左右时反转录酶活性较高,于是提取此时的细胞总蛋白,用于下一步蛋白质组学分析。(4)嗜人性PERV感染人源细胞后的蛋白质组学分析PERV感染人源细胞后,细胞并不产生任何形态学的改变或生长状态的改变,为了揭示嗜人性PERV感染人源细胞后究竟产生了怎样的分子效应,并探索其是否具有与其他γ群反转录病毒类似的致病性,我们运用比较蛋白质组学方法从全细胞水平上对嗜人性PERV感染人源细胞后的蛋白质表达的变化进行研究。通过2-DE比较分析感染PERV的HEK293细胞与阴性对照HEK293细胞的总蛋白谱,采用高解析离子淌度质谱分析鉴定差异表达的蛋白,鉴定出10种差异表达蛋白,与对照相比,其中6个为上调蛋白,4个为下调蛋白。通过实时定量RT-PCR与Western Blot验证,证实差异表达结果可靠。这些差异蛋白参与信号转导、细胞凋亡、蛋白合成等生命过程,其中有数种蛋白与肿瘤的发生发展有关。该研究结果有望为深入研究嗜人性PERV与人源细胞的相互作用及PERV感染后的分子效应等提供一定的线索,也提示了PERV感染后可能会对细胞的生长、生理功能等造成影响,甚至存在潜在的致病性。本研究为研究PERV感染人源细胞后潜在的分子效应奠定了基础,对于异种移植中PERV的病毒安全性评价具有重要意义。
徐斯日古楞, 吕茂民, 吴健敏, 章金刚[10]2003年在《中国巴马小型猪内源性反转录病毒的检测》文中研究指明目的 :对我国特有巴马小型猪内源性反转录病毒 ( porcine endogenous retrovirus,PERV)的存在与 m RNA的表达情况进行检测 ,了解巴马小型猪内源性反转录病毒的携带情况。方法 :根据以往建立的 PCR、RT-PCR检测方法 ,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的 DNA和RNA样品进行 PERV核心蛋白基因 ( gag)、多聚酶基因 ( pol)及囊膜基因 ( env)的存在与表达进行检测 ;同时 ,根据目前通用的 env基因分型方法检测 PERV env-A、env-B、env-C的存在与表达。结果 :在 1 2个被检的 DNA样品中均检出了PERV特异性 DNA的存在 ;同样 ,在 1 2个被检的 RNA样品中均有 PERV特异性 RNA的表达 ,且所表达的 PERV均为 A型和 B型 ;其中有9个 DNA样品检测出 PERV-C型的存在 ,所有样品中均未检出 C型 PERV的表达。结论 :检测结果表明 1 2个被检巴马小型猪基因组中存在着内源性反转录病毒序列 ,且能以 m RNA的形式表达 ,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。
参考文献：
[1]. 整合猪内源性反转录病毒囊膜蛋白的假型鼠干细胞病毒的包装及鉴定[C]. 叶小丽, 吕茂民, 颜奇坡, 吴健敏, 田克恭. 第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编. 2011
[2]. 中国特有小型猪内源性反转录病毒感染性克隆的构建与鉴定[D]. 颜奇坡. 中国人民解放军军事医学科学院. 2010
[3]. 猪内源性反转录病毒的相关研究[D]. 吕茂民. 中国人民解放军军需大学. 2002
[4]. 我国小型猪内源性反转录病毒的相关研究[C]. 马玉媛, 吕茂民, 吴建敏, 丁芳, 徐述. 中国实验动物学会第七届学术年会论文集. 2006
[5]. 猪内源性反转录病毒的检测、启动子活性分析及载体构建[D]. 丁芳. 华中农业大学. 2006
[6]. 中国特有小型猪内源性反转录病毒的检测与全基因克隆[D]. 吴健敏. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[7]. 中国特有小型猪内源性反转录病毒检测及变异特征研究[D]. 张念. 吉林大学. 2013
[8]. 海南地方猪内源性反转录病毒的检测分析[J]. 晁哲, 吴望军, 刘海隆, 孙瑞萍, 王峰. 养猪. 2018
[9]. 中国特有小型猪内源性反转录病毒的检测与特性分析[D]. 马玉媛. 中国人民解放军军事医学科学院. 2009
[10]. 中国巴马小型猪内源性反转录病毒的检测[J]. 徐斯日古楞, 吕茂民, 吴健敏, 章金刚. 动物医学进展. 2003