段朝辉[1]2002年在《中国葡萄野生种白藜芦醇含量分析的研究》文中研究表明本研究采用高效液相色谱法(HPLC)首次系统研究了中国葡萄野生种11个种或变种36个株系成熟浆果中白藜芦醇的含量；以毛葡萄的3个株系和欧洲葡萄栽培品种为试验材料，分析了果穗不同组织中白藜芦醇的含量和葡萄浆果成熟过程中白藜芦醇的含量变化及炭疽病对葡萄浆果中白藜芦醇含量的影响。 取得的主要结果如下： (1)中国葡萄野生种浆果中白藜芦醇的含量在种间存在明显差异，种内不同株系间也存在差异。白藜芦醇含量最高的种为毛葡萄(0.358～7.518μg·g~(-1))；毛葡萄丹—2、83—4—67和商—24中都含有较多的白藜芦醇，其含量分别为7.518μg·g~(-1)、7.208μg·g~(-1)和7.173μg·g~(-1)。瘤枝葡萄、蘡薁葡萄、燕山葡萄、小复叶葡萄、麦黄复叶葡萄，刺葡萄济南-1、福建-4、略阳-4、雪峰，华东葡萄湖南-1、广西-1和复叶葡萄眉县-6中检测不到白藜芦醇。 (2)白藜芦醇在浆果不同发育期含量不同，其含量最高时期为生理成熟期，依次是转熟期和绿果期。 (3)白藜芦醇在果穗的不同组织中含量不同，其含量最高的组织是穗轴(10.667～37.288μg·g~(-1))，其次是果皮(4.671～8.543μg·g~(-1))，种籽(0.584～0.761μg·g~(-1))和果肉(0.208～0.574μg·g~(-1))中含量很少。 (4)轻度感染炭疽病后，浆果中白藜芦醇的含量高于健康浆果，轻度感染炭疽病有利于葡萄浆果产生白藜芦醇。 (5)气候环境影响浆果中白藜芦醇的含量，但其含量首先取决于种或品种的基因型。 (6)建立了葡萄和葡萄酒中白藜芦醇含量的高效液相色谱(HPLC)分析法，实现了对葡萄和葡萄酒中白藜芦醇含量快速、准确和有效的分析。
杨进孝[2]2004年在《中国葡萄属野生种抗白粉病相关基因克隆及生物信息学分析》文中研究表明本研究通过两年的田间和试验室工作，围绕葡萄优质抗病育种的中心目标，以中国葡萄属野生种白藜芦醇高产株系商南－24、抗白粉病株系白河-35-1 和欧洲葡萄感炭疽病品种凤凰－51 为主要材料，利用 RT-PCR 技术就白藜芦醇次生代谢过程调控和抗病基因克隆新策略研究方面作了一些尝试性的探索，主要取得以下几个方面的研究结果： 1.通过抗病基因克隆新策略和定量－简并 PCR 技术，得到与中国葡萄属野生种抗白粉病株系白河-35-1 抗病可能有密切关系的基因片段叁条：9－2、7＃、15＃,它们的大小分别为 200bp、565bp、211bp。这几个基因片段的序列在 GeneBank 的登录号为分别为：AY656730、 AY656725、 AY656731。9－2 基因片段与从欧洲葡萄逆境胁迫的 cDNA文库中的多条 EST 序列同源；进一步分析表明该基因片段可能是葡萄抗病和次生代谢过程中涉及基因调控的某一反式作用因子的编码基因的一部分，在反式作用因子与葡萄抗病过程中信号的识别、传递、放大或防卫基因的转录都可能有关。7＃基因片段与欧洲葡萄受逆境胁迫的 cDNA 文库和多种植物微丝形成期的 cDNA 文库中的多条 EST 序列存在着同源关系，但具体功能未知；定量 PCR 结果表明，该基因片段在白河－35－1 受白粉病侵染时转录量有较大的变化，因此该基因片段可能与植物的纤维性物质合成及相应的葡萄结构性抗病诱导有关。15＃基因片段在生物信息学数据库中未找到任何同源序列，说明该基因片段可能是一条新基因，该基因片段在定量－简并 PCR 中的欧亚种葡萄感白粉病品种佳利酿的 cDNA 扩增结果中表现为低水平的本底表达，但在白河－35-1 中随病原菌入侵增幅明显，这暗示着该基因片段可能是一条首次发现的在葡萄抗病中有特殊意义的新基因。2.在葡萄PAL 途径抗病相关基因克隆研究方面。通过增加提取缓冲液中PVP的含量、减小样品量与总缓冲液比值，在提高总 RNA 提取纯度的同时提高了相对产率。从中国葡萄属野生种白藜芦醇高产株系商南-24 mRNA 中经 RT-PCR 克隆到与葡萄白藜芦醇合成和葡萄抗病有密切关系的 STS 基因家族的叁个成员的 14＃、40－1、41－1 基因片段，它<WP=7>们的大小分别为：772bp、720bp、283bp。这几个基因片段的序列目前已等录 GeneBank，登录号为：AY656724、 AY656725、 AY656726。定量 PCR 同时获得有类似作用的 CHS基因（果实与叶片中各得到一条）、PPO 基因（叶片中特异表达）的叁个基因片断。从商南-24 DNA 中经 PCR 扩增得到具有相同作用的苯丙氨酸裂解酶基因片断一个，它们的大小分别为 460bp、340bp、267bp．这几个基因片段的序列目前也已等录 GeneBank，登录号为：AY656727、 AY656728、 AY656729、AY656733。 3.在葡萄重要植保素物质白藜芦醇高产机制研究方面，从商-24 DNA 中经 PCR 扩增得到两个准 STS 启动子，其中一个上面可能有病原诱导应答元件。将白藜芦醇产生机制的差异细化到不同葡萄株系的不同基因家族成员的转录活性的不同及其单核苷酸位点多态性上。 4. 在抗病基因克隆中，通过定量 PCR 技术研究了受白粉病病原菌侵染不同时间的中国葡萄属野生种抗白粉病株系白河-35-1 中部分本实验中得到的防卫基因的转录活性变化情况，研究了欧亚种葡萄感炭疽病品系凤凰－51 果皮中防卫基因 CHS 转录量与炭疽病侵染面积的关系。在一定程度上验证并丰富了防卫基因与葡萄抗病性的关系的理论，为研究葡萄抗病基因克隆提供了方便新颖的采样思路。，通过对生物信息学分析方法—Motif 分析的反向思维，运用 PCR 原理建立了定量-简并 PCR 技术体系，并经过了初步验证。 5.建立了确定在本地气候和本试验条件下葡萄抗病基因表达时间的方法，并根据本试验方法确定了中国葡萄属野生种抗白粉病株系白河-35-1 抗白粉病基因的大致表达时间为 5～8ｄ。为有的放矢地克隆葡萄抗病基因提供了可能。
殷向静[3]2016年在《山葡萄果实转录组分析及白藜芦醇调控机理研究》文中研究表明葡萄是世界上重要的果树之一,具有很高的经济价值。白藜芦醇是一种二乙烯苯类化合物,在植物抗病过程中发挥重要作用。葡萄属植物富含白藜芦醇,在近些年得到了广泛的研究。葡萄中白藜芦醇的合成能够受到许多生物和非生物胁迫因素的诱导,如葡萄白粉菌的侵染、紫外胁迫和激素处理等,其中紫外照射已成为人工诱导葡萄快速合成白藜芦醇的有效手段之一。目前对于白藜芦醇在葡萄中积累的调控机理等研究尚未深入。中国野生葡萄中的一些株系具有高含白藜芦醇的特质,因此探究其调控机理能够为利用中国野生葡萄优质基因资源进行葡萄品种遗传改良奠定基础。本研究首先测定了中国野生葡萄不同种及株系间白藜芦醇含量,挑选不同发育时期中国野生葡萄通化3号和塘尾果实为研究材料,运用转录组测序技术进行葡萄白藜芦醇含量差异的分子机理研究;其次以中国野生山葡萄通化3号果实为研究材料进行紫外处理并测定白藜芦醇含量,选取紫外处理后不同时间果实进行转录组测序分析,从转录水平分析了葡萄果实受紫外辐射后基因的表达变化,初步探讨了紫外线与果实中白藜芦醇生成和积累的可能原因;后期本研究在分析芪合成酶基因表达模式的基础上筛选出可能与果实中白藜芦醇含量相关的芪合成酶基因,获得转基因番茄植株并对相关启动子活性进行了研究,可为后期葡萄品种改良提供基因资源。取得的主要结果如下:1.通过测定不同葡萄株系/品种中白藜芦醇的含量,发现山葡萄通化3号从绿果期到成熟期白藜芦醇变化较大,绿果期未检测到而成熟期白藜芦醇含量为2.19μg/g,刺葡萄塘尾在叁个发育时期都未检测到白藜芦醇。根据白藜芦醇含量高低挑选通化3号和塘尾果实绿果期和成熟期进行转录组分析,两个材料不同时期对比分别得到差异基因1861和2234个,其中下调表达差异基因较多,得到了136个差异表达的转录因子;富集途径差异分析表明塘尾的富集代谢途径数量高于通化3号;激素途径分析表明在葡萄果实通化3号发育时期JA途径及其相关的调控基因上调表达较多,而SA途径基因多下调表达;苯丙氨酸途径中通化3号上调基因数量高于塘尾,而塘尾中白藜芦醇氧葡萄糖基转移酶表达高于通化3号。以上研究揭示葡萄果实发育过程有较多生理途径参与,诱导葡萄产生白藜芦醇的机理也较复杂,其中不同激素之间的调控作用、转录因子调控以及芪合成酶基因及其上下游基因等均可能参与了相关的调控表达。2.采用HPLC对中国野生山葡萄通化3号成熟葡萄果实紫外处理后测定其白藜芦醇含量并选取4 h和24 h的葡萄果实采用I11umina HiSeq 2000技术进行测序,从转录组水平上比对分析了紫外处理后基因的表达差异,在4 h和24 h分别获得882和1058个差异基因,且上调表达基因较多;通过不同代谢途径的富集分析发现紫外处理后苯丙氨酸途径,JA,Eth和SA激素途径等变化显着;通过对关键途径差异基因分析发现紫外处理在强烈诱导苯丙氨酸途径相关基因的表达的同时,也会抑制花色素苷途径基因的表达。初步分析了紫外处理诱导生成和积累白藜芦醇的可能原因。3.采用RT-PCR技术克隆得到1570bp中国野生山葡萄通化3号芪合成酶基因启动子序列,命名为PVaSTS36,Genbank登录号为KU376402。通过中国野生山葡萄通化3号芪合成酶基因启动子序列元件预测分析发现该启动子上有多个光诱导响应元件;将该启动子与GUS基因融合后在烟草中进行瞬时表达,测定其对紫外照射的响应活性并用实时荧光定量技术检测GUS基因的表达模式,结果表明紫外照射对芪合成酶基因启动子的活性具有正调控的作用。4.利用半定量技术对葡萄芪合成酶基因家族在不同组织中的表达模式进行研究,发现STS基因在不同组织中表达存在差异;同时在通化3号和塘尾果实发育时期分析葡萄芪合成酶基因的表达模式,结果显示大多数芪合成酶基因在果实中随着果实发育呈现出渐强的表达趋势。综合前期结果筛选出可能与白藜芦醇含量高低相关的芪合成酶基因VaSTS19和VdSTS19,利用同源克隆法得到两个基因序列,ORF长度均为1179bp,编码392个氨基酸;随后利用农杆菌介导法将VaSTS19和VdSTS19转入番茄中后测定转基因植株白藜芦醇的含量,结果显示在两个基因的转基因番茄植株的果实转色期和成熟期都能检测到白藜芦醇且含量差异较小,说明芪合成酶基因的表达模式和白藜芦醇的产生规律可能与上游启动子类型和调控有关。5.通过同源克隆法得到1461bp的山葡萄通化3号和1457bp的刺葡萄塘尾芪合成酶基因启动子PVaSTS19和PVdSTS19,序列比对发现VaSTS19启动子序列与中国野生华东葡萄白河35-1芪合成酶基因启动子序列同源性为48%,与欧洲葡萄Optima的芪合成酶启动子PVst-2的序列在整体上同源性达到了60%;随后对这两个启动子进行了5’端缺失分析,将该启动子及其缺失体与GUS基因融合后在烟草中进行瞬时表达,测定其对不同激素处理的响应活性,结果表明PVaSTS19和PVdSTS19及其缺失体对水杨酸和茉莉酸甲酯诱导响应明显,但对乙烯诱导响应不明显;PVaSTS19受水杨酸诱导活性最高缺失体区域为-1197bp,而PVaSTS19受茉莉酸甲酯诱导活性最高的区域为-1384bp;PVdSTS19受水杨酸诱导活性最高缺失体区域为-868bp,而PVdSTS19受茉莉酸甲酯诱导活性最高的区域为-1194bp。表明不同芪合成酶基因启动子中含有的顺式作用元件的种类和分布不同,对不同激素处理的响应也有差别,最终导致芪合成酶基因产生有差异的表达模式。
申炎龙[4]2016年在《葡萄（Vitis.L）种质资源果皮和叶片白藜芦醇含量关联分析》文中研究指明葡萄(Vitis L.)为葡萄科葡萄属藤本植物,在世界果树生产中占据重要位置。在我国葡萄也是重要的果树树种,我国是葡萄栽培的大国,根据国际葡萄与葡萄酒组织(OIV)统计,2014年,中国葡萄种植面积79.9万公顷,自2000年以来,中国葡萄种植面积占全球种植总面积比已从3.9%升至10.6%。就世界而言,80%的葡萄用于加工,而我国则刚好相反,80%的葡萄用于鲜食。白藜芦醇(Resveratrol,简称Res),是植物体内产生的天然二苯乙烯类多酚物质。对植物Res的研究可追溯到上个世纪中叶,目前已经发现Res至少存在12科31属72种植物中,其中许多可作为人类的食物,如葡萄、虎杖、可可、豆类等。Res最早被认为是植物对真菌侵染、机械伤害、紫外线照射后产生的植物抗毒素的一种。后发现白藜芦醇在植物和动物体上具有明显的生理功能而越来越受到人们的重视。葡萄是人类获取Res的主要潜在来源,研究表明,高Res含量的葡萄通常为野生种,食用品质欠佳,而目前生产上大量栽培的欧亚种和欧美杂交种在自然条件下Res含量较低,其果皮和种籽内的Res含量通常低于2μg/g FW,远远满足不了人们对Res的需求。本试验利用HPLC法连续两年测定了96个葡萄种质资源(51个野生葡萄株系、41个鲜食葡萄品种和4个酿酒葡萄品种)的果皮和叶片中的白藜芦醇含量,并在此基础上结合SSR技术进行高Res含量相关基因的全基因组关联分析,找到与Res相关基因的SSR标记,以此发掘、保护我国野生葡萄的优异基因源,奠定葡萄Res生物合成的理论基础,促进功能性葡萄产业稳定、持续发展。主要试验结果如下:(1)发现一些果皮Res含量较高的葡萄种质资源,野生葡萄株系:‘双溪腺枝葡萄03’(2013年达67.82μg·g-1 FW,2014年达68.44μg·g-1 FW)、‘芷江水腺枝葡萄’(2013、2014年分别达44.68μg·g-1 FW和45.87μg·g-1 FW)、‘塘尾葡萄实生’、‘双溪腺枝葡萄01’等。栽培种葡萄品种:‘紫鸡心’(2013年达11.29μg·g-1 FW,2014年达12.63μg·g-1 FW)、‘亚历山大’(2013年资源圃无果未检测,2014年11.46μg·g-1 FW)、‘普列文玫瑰’、‘早甜玫瑰香’、‘凤凰51’、‘香妃’等。(2)发现一些叶片Res含量较高的葡萄种质资源,野生葡萄株系:‘高山二号’(2013、2014年分别为10.27μg·g-1 FW和11.69μg·g-1 FW),‘冯举沟桑叶葡萄03’(2013、2014年分别为9.28μg·g-1 FW和10.37μg·g-1 FW),‘武汉刺葡萄’、‘嵩县桦叶葡萄’、‘华东葡萄1057’等。栽培种葡萄品种:‘紫丰’(7.60μg·g-1 FW)、‘香槟’(5.81μg·g-1 FW)、‘奥利文’、‘郑果6号’、‘87-1’、‘郑州早玉’等。(3)所测定的野生葡萄种质资源中约60%的株系的果皮中Res含量高于叶片,栽培种葡萄中约38%的葡萄品系(种)叶片Res含量高于果皮。(4)对于野生葡萄,两年间气象条件有明显差异的情况下,不同年份同一株系葡萄果皮Res含量在两年间的变化幅度较小,年度间含量表现稳定;不同年份同一株系叶片中Res含量出现差异。(5)栽培种葡萄果皮中白藜芦醇的含量对天气的变化更加敏感,其中鲜食葡萄两次集中的结果显示出明显的区别,2013年7月下旬采摘的葡萄果皮Res含量普遍高于2014年同期,而2013年8月上旬采摘葡萄果皮Res含量普遍低于2014年同期。栽培种葡萄叶片中白藜芦醇的含量也表现出对天气变化的敏感性,成熟叶片的采集均在7月15日,整个栽培种葡萄叶片2013年Res含量明显高于2014年,产生这一现象的原因可能是2013年7月上旬郑州地区持续半月的阴雨天气。(6)结合葡萄Res含量数据与SSR标记技术我们对葡萄Res含量性状进行了关联分析得出,与葡萄果皮Res含量关联的标记有Sh74、Sh53、Sh71,其中Sh74在2013年和2014年两年的分析中与果皮Res相关的表型解释率均高于5%;与葡萄叶片Res含量关联的标记有Sh74、Sh28、Sh58、Sh68、Sh74,其中Sh28在2013年和2014年两年的分析中与叶片Res相关的表型解释率均高于5%。结合两年的Res含量,引物Sh74L(Forward primer:5′-ACTCTACTTCCTATGGACGAA-3′,Reverse primer:5′-GTTGTTGTTGTTGTTTGCAG-3′)是一个显着的控制果皮和叶片中白藜芦醇含量的SSR标记,以及在年度间稳定存在的控制叶片Res含量的SSR标记引物Sh28(Forward primer::5′-TCTCAATAAACCAACTCT-3′,Reverse primer:5′-ACGTGGCTCTTATAATAC-3′)。
郑先波, 申炎龙, 史江莉, 谭彬, 叶霞[5]2016年在《中国野生葡萄果皮和叶片白藜芦醇含量测定》文中指出【目的】探讨中国野生葡萄果皮和叶片中白藜芦醇(Resveratrol,Res)含量的特点,为进一步开发利用中国野生葡萄资源提供理论依据。【方法】以51个野生葡萄株系为材料,利用高效液相色谱法(HPLC)连续2 a测定成熟果皮和叶片中白藜芦醇的含量,并结合气候条件进行对比分析。【结果】在51个野生葡萄株系中,约60%的葡萄果皮中白藜芦醇含量高于叶片,株系间果皮、叶片Res含量(ω)存在很大差异,其中果皮中含量最高的‘双溪腺枝葡萄03’(2013年与2014年分别为67.82μg·g~(-1)和68.44μg·g~(-1))比含量最低的‘洪江刺葡萄04’(2013年0.08μg·g~(-1),2014年0.09μg·g~(-1))高855.5倍,叶片中含量最高的‘高山二号’(2013与2014年分别为10.27μg·g~(-1)和11.69μg·g~(-1))比含量最低的‘冯举沟桑叶葡萄02’高256.8倍。结合采样地2 a的气候条件分析,果皮中的Res含量几乎未受气候条件影响,而叶片中Res含量在采样的2 a间变化幅度较大。【结论】腺枝葡萄中的‘双溪腺枝葡萄03’‘芷江水腺枝葡萄’‘双溪腺枝葡萄01’及山葡萄中的‘山葡萄N43-3’‘长白9号’‘双优’等果皮富含白藜芦醇。研究为有效利用和开发野生葡萄资源中的白藜芦醇及促进功能性食品开发提供理论依据。
张劲, 黄小云, 谢太理, 杨莹, 管敬喜[6]2017年在《毛葡萄及酿酒皮渣中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量分析》文中认为探索广西野生毛葡萄中功能成分白藜芦醇含量分布,采用高效液相色谱法(HPLC)对毛葡萄果皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及酿酒葡萄皮渣、酿酒葡萄籽中的白藜芦醇和白藜芦醇苷含量进行测定。结果表明,除葡萄汁外,毛葡萄、葡萄酒及酿酒皮渣中均存在不同含量的白藜芦醇和白藜芦醇苷,且相同部位白藜芦醇苷含量均高于白藜芦醇。酿酒皮渣中白藜芦醇及白藜芦醇苷的含量最高,具备工业化提取的经济价值,为毛葡萄酿酒废弃物的综合利用提供了理论依据。
杜杨建, 李瑞民, 程思妍, 张剑侠, 王跃进[7]2016年在《中国野生毛葡萄‘丹凤-2’3个芪合酶基因表达与功能分析》文中指出为了研究中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd.)‘丹凤-2’3个芪合酶基因的表达与功能,该研究采用同源克隆技术分离了毛葡萄‘丹凤-2’3个芪合酶基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32(GenBank登录号分别为JQ868677、JQ868668和JQ868666),3个基因的cDNA全长均为1 179bp,编码392个氨基酸。以抗葡萄白粉病(Uncinula necator)的毛葡萄‘丹凤-2’和不抗病的欧洲葡萄‘赤霞珠’为材料分别进行接种白粉菌和ABA、SA、MeJA、高温、低温和高盐胁迫处理,利用实时定量PCR检测这3个基因在胁迫处理下的表达情况;同时利用农杆菌介导法将这3个基因分别转入模式植物烟草中,检测这3个基因在烟草中的表达产物,分析比较这3个基因的表达功能。结果显示:在2个供试材料中,葡萄白粉菌胁迫下芪合成酶VqSTS32诱导表达量高于VqSTS21和VqSTS30;在非生物胁迫处理下,芪合酶基因VqSTS32对高温处理反应最敏感。采用高效液相色谱分析检测转3个基因烟草的结果显示,转VqSTS32基因烟草比转VqSTS30基因烟草植株中白藜芦醇的累积量高。研究表明,3个基因中VqSTS32具有较高的抗葡萄白粉菌特性并能在转基因烟草中表达出较高的反式云杉新苷产物,这为进一步利用VqSTS32转目的植物葡萄基因研究提供了依据。
刘勇[8]2006年在《葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及原核表达研究》文中指出本试验的目的是从中国葡萄属野生种华东葡萄白河中克隆白藜芦醇合酶基因,然后构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中表达白藜芦醇合酶,从而获得一种新型的功能性微生态制剂基因工程菌种。白藜芦醇合酶是催化合成白藜芦醇的关键酶。白藜芦醇(叁羟基反式芪)存在于少数几种植物中,药理学的研究表明,它具有抗氧化、抗菌、抗炎症等重要生理活性。对该酶及其基因的研究使我们可以有效的利用白藜芦醇。本试验采用反转录PCR(RT-PCR)的方法,首先从葡萄叶片中提取总RNA,利用其中mRNA反转录为cDNA,然后利用白藜芦醇合酶基因引物,以cDNA为模板扩增出目的基因。回收纯化后再用带有酶切位点的特异引物进行扩增,引入限制性酶切位点。回收纯化目的基因,将其克隆到克隆载体pGEM-T Easy上,构建重组质粒pGEM-T-RS,转化大肠杆菌DH5α,酶切鉴定后送检测序。结果表明,目的基因的长度为1179bp,编码392个氨基酸,与Genbank中己有的几个葡萄白藜芦醇合酶基因序列相似性为96%-98%,氨基酸序列相似性为97%-99%。从重组质粒中切下目的基因,回收纯化后亚克隆到原核表达载体pET-22b(+)上,构建重组质粒pET-RS,转化大肠杆菌BL21,进行抗性筛选及酶切鉴定,表明原核表达载体构建成功。培养重组菌株,利用比浊法研究其生长曲线,发现培养4h后菌株进入对数生长期。在对数生长期用IPTG诱导重组菌,超声波破碎菌体,收集上清液。最后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析,表明白藜芦醇合酶被成功诱导表达。本试验成功获得中国葡萄属野生种华东葡萄白河白藜芦醇合酶基因,并在大肠杆菌BL21中实现了大量表达,为下一步利用该菌株生产微生态制剂奠定了基础。
姜丰[9]2008年在《葡萄组织培养生产白藜芦醇的研究》文中研究表明白藜芦醇是植物在抵御真菌侵染、机械和紫外线等伤害时产生的植保素次生代谢产物,有防癌、保护心血管系统、抗菌和调节血脂等多种对人体有益的作用。本文以葡萄特别是其果皮为外植体诱导愈伤组织,对其白藜芦醇的生物合成、积累规律及影响因素进行系统地研究。取得的主要结果如下:1.利用高效液相色谱(HPLC)建立了葡萄中白藜芦醇的测定方法,实现了对葡萄中的白藜芦醇含量快速、准确和有效的分析。检测了不同品种和不同器官中及其不同生长阶段白藜芦醇的含量2.选取白藜芦醇含量较高的葡萄器官作为外植体进行愈伤组织诱导,筛选出了最佳诱导愈伤组织的培养基配方。结果表明外植体与其愈伤组织中白藜芦醇的含量相差不大。筛选出了以Y6为外植体诱导出了生长势强,含白藜芦醇较高的愈伤组织。3.利用组织培养技术结合现代分析测试手段,系统研究了碳源、生长调节剂、有机添加物和前体物,采用HPLC测定愈伤组织中白藜芦醇的含量的变化,根据葡萄愈伤组织的生物量及其白藜芦醇的含量,确定了葡萄愈伤组织生长和进行其有效成分生物合成的最佳条件:在光培养下,培养基B_5中附加40g/L蔗糖,6mg/L NAA,0.6mg/L6-BA和150mg/L蛋白胨,温度25℃。在上述条件下,转接新鲜愈伤组织,培养24d后,葡萄皮愈伤组织生物量干重为50.27g/L,白藜芦醇为438.143μg/g,白藜芦醇总含量为22.025mg/L。白藜芦醇的含量和产量分别是对照的2.4倍和2.6倍。4.研究了紫外线(uV)辐射对愈伤组织中白藜芦醇合成的诱导作用,结果表明,用15W 254nm波长的紫外灯距离灯管25cm照射葡萄愈伤组织30min,可使白藜芦醇含量提高5倍。研究了一定浓度的苯丙氨酸作为前体,能提高葡萄皮愈伤组织中白藜芦醇的含量,是对照组的2.1倍
徐伟荣[10]2010年在《中国华东葡萄抗白粉病芪合成酶基因及启动子克隆与功能分析》文中研究指明葡萄白粉病[Uncinula necator (Schw.) Burr.]是严重为害世界葡萄生产的一种真菌病害。在世界范围内广泛栽培的欧洲葡萄品种,虽然品质优良,但对白粉病抗性普遍较差。中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)作为高抗白粉病的野生葡萄资源被多次报道。葡萄白藜芦醇是苯丙氨酸合成途径中芪合成酶基因的表达产物,它不仅能增强植物的抗病性,而且具有抗癌、抗肿瘤、预防心血管疾病与神经保护剂等保健功能。本研究选用抗白粉病葡萄种质中国野生华东葡萄白河-35~(-1)、感白粉病葡萄品种佳利酿与无核白为材料,研究了芪合成酶基因在葡萄与白粉菌互作过程的表达变化模式;比较了葡萄不同基因型中芪合成酶基因组结构;克隆了芪合成酶基因上游调控序列;应用农杆菌介导的模式植物烟草瞬时表达系统分析了获得的启动子活性;并检测了芪合成酶基因在病原菌诱导下的烟草中白藜芦醇的含量,主要结果如下:1.研究了在葡萄白粉菌接种后抗性种质中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)与感病欧洲葡萄品种佳利酿、无核白芪合成酶基因的表达模式。在与白粉菌互作过程中,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶基因的表达模式不同于感病欧洲葡萄品种,在与白粉菌互作的早期表现为抑制表达,而在后期呈现增强表达的模式;进一步的分析表明,在这种特异的表达模式中涉及两类芪合成酶基因的协调表达,而在感病欧洲葡萄品种佳利酿、无核白中仅发现1类芪合成酶基因的表达。2.从中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)、欧洲葡萄佳利酿、无核白基因组中,分别克隆了2个具有开放阅读框的芪合成酶基因,GenBank登录号分别为FJ830329,FJ830330,FJ851182,FJ851183,FJ851184与FJ851185。比较分析发现抗病种质与感病品种芪合成酶基因序列同源性为94-99%;对获得的芪合成酶基因组序列结构分析表明,所克隆的基因均包含2个外显子与1个内含子。2个外显子区在抗感基因型中主要为单核苷酸多态性的差异,而内含子区域的插入、缺失变异较大。酶切分析表明,所克隆的6个芪合成酶基因组可分为两种类型。推导的氨基酸序列与已报道的葡萄属植物芪合成酶同源性为94.5-99.5%,而且具有不同于查尔酮合成酶的“IPNSAGAIAGN”与“GVLFGFGPGLT”特征序列,进一步证明所克隆的序列为芪合成酶基因。3.应用染色步移法克隆了抗白粉病和感白粉病葡萄基因型中芪合成酶基因的上游调控序列3个,GenBank登录号分别是FJ605484,GU269272与GU269273;通过预测分析发现,这3个上游序列中具有与病原菌及非生物胁迫相关的顺式作用元件。核苷酸比对表明,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶基因上游调控序列与欧洲葡萄佳利酿、无核白芪合成酶上游调控序列同源性分别为53%与51.7%,而欧洲葡萄品种佳利酿与无核白STS上游调控序列同源性为93.4%;中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶基因上游调控序列不仅与欧洲葡萄品种芪合成酶上游调控序列同源性差异较大,而且顺式作用元件的种类、数目与分布也差异较大。4.构建了3个芪合成酶上游调控序列与GUS报告基因融合载体,应用Real-time PCR技术分析了不同融合构建渗透后的烟草叶片在接种烟草赤星病后GUS基因的表达模式。结果表明,在接种后不同时间段中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶上游调控序列驱动的GUS基因的表达模式与2个欧洲葡萄芪合成酶上游调控序列驱动的GUS基因的表达模式差异较大;而2个欧洲葡萄芪合成酶上游调控序列驱动的GUS基因的表达模式相似;与未接种对照叶片的比较,所克隆的3个芪合成酶上游调控序列均具有病原菌诱导活性。通过GUS组织化学与荧光定量分析了不同融合构建对病原菌的响应,结果发现,欧洲葡萄无核白芪合成酶基因启动子的活性最高,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子活性次之,佳利酿芪合成酶启动子活性最低;在非生物胁迫损伤处理及MeJA处理的烟草叶片中,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子对损伤诱导呈现负调控表达,而对MeJA处理响应变化无明显变化;欧洲葡萄佳利酿、无核白芪合成酶启动子对损伤及MeJA诱导均有正调控表达的特性。5.基于中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子不同于欧洲葡萄的表达特性,进一步对其启动子进行5’端缺失分析。以欧洲感病品种佳利酿无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导的真空渗透法对缺失构建进行GUS活性分析;同时也在异源体系烟草组织中进行了验证。结果表明,1772bp的中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶基因启动子在同源及异源体系中对病原真菌诱导均具有较高的诱导表达特性。不同缺失构建对SA诱导响应中,162bp的启动子区域的诱导活性较高;低温处理时,1129bp启动子区域的诱导表达活性最高。以上结果表明,在所克隆的1772bp的中国野生花葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子序列中,响应病原菌与非生物胁迫的正负调控顺式作用元件共存于该启动子区,包含162bp的启动子区域具有组成型表达特性。6.构建了3个芪合成酶启动子与芪合成酶基因融合的载体,通过农杆菌介导的烟草瞬时转化法并结合HPLC分析了不同构建转化烟草在接种与未接种赤星病烟草叶片中白藜芦醇的含量。结果表明,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子与中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶gDNA-2融合的构建转化烟草在接种赤星病后的白藜芦醇含量最高为2.81μg.g~(-1)FW,这一水平是未接种的3.37倍;欧洲葡萄佳利酿芪合成酶启动子与两个芪合成酶gDNA~(-1)、gDNA-2融合的构建转化烟草叶片接种赤星病后的白藜芦醇分别为2.29μg.g~(-1)FW与2.28μg.g~(-1)FW,均为未接种的叶片中白藜芦醇含量的1.82倍;欧洲葡萄无核白芪合成酶启动子与两个芪合成酶gDNA~(-1)、gDNA-2融合的构建转化烟草叶片接种赤星病后的白藜芦醇分别为1.78μg.g~(-1)FW与1.83μg.g~(-1)FW,分别为未接种的叶片中白藜芦醇含量的1.53与1.51倍;而中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子与其2个cDNA与gDNA~(-1)融合的构建转化烟草后白藜芦醇的含量分别为1.06μg.g~(-1)FW与0.84μg.g~(-1)FW与0.67μg.g~(-1)FW,分别为未接种赤星病烟草叶片中白藜芦醇含量的1.68,1.31与1.1倍,结果表明,芪合成酶基因的表达受基因自身及其启动子共同调节作用。
参考文献：
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