邱海江1 袁穗蓉2 张柳2
（1 广州市南沙中心医院 511455; 2 广州市第一人民医院 510180）
【摘要】目的:探讨中药苦参提取物氧化苦参碱（Oxymatrine）对视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma RB)端粒酶(Telomerase)活性表达的影响，研究氧化苦参碱对RB的作用机制,为氧化苦参碱在抗视网膜母细胞瘤临床用药提供更完整的理论依据。方法:体外培养视网膜母细胞瘤HXO-Rb细胞,实验组细胞加入氧化苦参碱提取物，对照组细胞中加入等量的培养液，倒置显微镜下观察细胞形态学的变化。同时分别采用不同浓度及不同时段的氧化苦参碱研究其对HXO-Rb的抑制作用。结果：氧化苦参碱可抑制HXO-Rb细胞的生长，当浓度为100ug/ml时细胞形态学可明显观察到改变，端粒酶的活性下降，细胞凋亡率比值最大，并且随着时间延长，细胞凋亡增加。
【关键词】 氧化苦参碱 视网膜母细胞瘤 端粒酶活性
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）36-0277-02
视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma，RB) 是常染色体显性遗传病，是以视网膜内颗粒层、细胞层和外颗粒层为起源的胚胎性恶性肿瘤，发病率约为1/20000,为婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，具有家族遗传性，占儿童致盲原因的5％。因容易发生颅内及远处转移，不仅危害患儿视功能而且严重威胁患儿生命。RB是一个基因变异性疾病，而端粒酶(Telomerase)是一种核蛋白逆转录酶，端粒酶是各种恶性肿瘤细胞的一个分子标志物，当细胞衰老调控机制失控的条件下，端粒的极限缩短将导致细胞死亡或癌变，它的激活是有关恶性肿瘤发生的一个共同途径。氧化苦参碱（Oxymatrine）为中药苦参的主要有效成分,中医临床上常用的药物，具有抗肿瘤作用[1]。
本实验从抑制肿瘤细胞活性，促进细胞凋亡的角度，通过观察氧化苦参碱影响HXO-Rb细胞株端粒酶的活性变化，研究氧化苦参碱诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡诱导的有关作用机制。
1 试剂与仪器
人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-Rb(上海拜力生物科技有限公司)；10%的类胎牛血清（Hyclone SV30087）；培养基（RPMI-164）；酶标仪（Synergy? Mx）；端粒酶ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司 LA135474）；碳酸盐缓冲液PBS(北京鼎国生物技术有限公司)；胰蛋白酶（Sigma）；青霉素（浙江仙居制药20120315）；链霉素（浙江仙居制药20111005）。
2 实验方法
2.1 显微镜下观察 人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-Rb细胞在含有10%胎牛血清,青、链霉素各100ug/ml的RPMI-164培养液中，37℃,5%CO2饱和湿度培养，悬浮状态下每24 h换液、传代，使用前胰酶消化。分别采用25ug/ml, 50ug/ml,100ug/ml不同浓度的氧化苦参碱溶液与加入相同剂量培养液对照组对孵育24h,比倒置显微镜下观察。
2.2ELISA试剂盒检测端粒酶活性 实验组设有高剂量100ug/ml,中剂量50ug/ml,低剂量25ug/ml三组，对照组则加入相同剂量的培养液，各组移液于96孔孔板中，分别作用24h，48h，72h，实验重复操作25次。
2.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件，采方差分析（ANOVA）分析，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 形态学结果对比 在对照组中，倒置显微镜下可以观察到Rb细胞粘附紧密，细胞附壁性好，呈团状分布，细胞核大，位于细胞中心，边界清晰透亮；而在氧化苦参碱组中随药物浓度的提高，光镜下可观察到细胞逐渐变得稀疏，细胞个体的体积逐渐缩小，因结合力下降,使得呈团状分布的Rb细胞松散成漂浮的个体，原来的细胞边界清晰透亮,逐渐变得模糊，细胞附壁数量逐渐减少。部分细胞内的细胞器开始皱缩，胞浆减少，颜色加深,细胞核浓缩，胞浆内可见大小不等的空泡，视野内可见细胞崩解碎片增多，部分可见崩解。并随着实验时间的增长，氧化苦参碱端粒活性酶的抑制增强。
3.2 浓度与时间的对比 氧化苦参碱组对HXO-Rb细胞端粒酶活性的影响作用随着浓度和时间的增加,端粒酶活性的活性下降,尤其是在高剂量组时体现的更为明显，呈剂量一效应正相关，有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 氧化苦参碱对HXO-Rb细胞端粒酶活性的影响
4.讨论
视网膜母细胞瘤作为婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，多发于2岁以内的婴幼儿，早期难以发现，就诊患儿多处于中晚期，危害大，使RB治疗相当棘手，其发病率不断上升。随着科学技术日新月异地发展，医疗和生活水平的提高，许多疾病已经可以从基因分子等更深层面上了解其发病机理，研究发现端粒酶的表达同恶性肿瘤发生，发展具有明显相关性，端粒酶由RNA，蛋白质构成的核糖核酸蛋白复合物，具有反转录酶活性，其活性高低是肿瘤恶性肿瘤的重要指标，是各种恶性肿瘤细胞的一个分子标志物，恶性肿瘤的发生都需要激活端粒酶这一个共同的途径[2]。
近年来对RB的发生及发病机制的研究有长足的进步，研究表明RB患儿的平均生存率与端粒酶的活性表达的高低有着密切的关系.通过端粒酶的检测，可以提前发现RB，对于早期治疗、肿瘤分化程度的评估及判断预后效果具有很深远的意义，为监测RB的发展及指导临床用药明确了方向[3]。传统放射疗法，采用全身化疗的手段，副作用大，随着临床上对治疗RB的目标从保护患儿生命逐渐转变为提高患儿生存质量，即在保证生命的前提下，尽可能保留眼球，甚至保留一定的有用视力。这一目标对临床治疗提出更高的要求，即更具特异性、副作用更小的化疗药物。而目前临床常用的化疗药物副作用相对大,机体容易产生耐药性[4]。
大量的临床实践表明我国传统的中医中药对于抑制肿瘤的分化及降低化疗的副作用方面具有天然的优势，其中氧化苦参碱是从常用中药苦参中提取的一种生物碱，具有抗肿瘤的作用，其对于多种恶性肿瘤都具有抑制其活性，杀伤肿瘤细胞的作用，但对于正常的组织及细胞无损伤，因其具有这些特点，临床上患者更易于接受，具有广阔的应用前景[5]。
本实验中，氧化苦参碱能有效抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖,增加其凋亡，当浓度为100ug/ml时细胞形态学可明显观察到改变，端粒酶的活性下降，细胞凋亡率比值最大，并且随着时间延长，细胞凋亡增加。但氧化苦参碱作用于细胞凋亡的哪个位点，激活了那些通路，其在诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡的过程中扮演什么角色都还有待进一步研究。
参考文献
[1] 张璐烨.苦参碱对视网膜母细胞瘤细胞survivin和端粒酶活性表达的影响[J]. 医学研究杂志,2013,(8).
[2] 王建伟.视网膜母细胞瘤的研究进展[J].中国实用眼科杂志,201 3,31(2):105-107.
[3] 陈长征.重视开展视网膜母细胞瘤的基因诊断工作[J].中华实验眼科杂志,2013,31(7):617-620.
[4] 李光辉.RNA干扰技术在视网膜疾病治疗中的研究进展[J].国际眼科杂志,2013,13(5):901-904.
[5] 唐松,陆晓和,张国明.视网膜母细胞瘤综合治疗的临床分析[J].实用肿瘤杂志,2013,28(2):167-170.
论文作者:邱海江1,袁穗蓉2,张柳2
论文发表刊物:《医药前沿》2013年第36期供稿
论文发表时间:2014-3-12
标签：细胞论文; 视网膜论文; 活性论文; 端粒论文; 苦参碱论文; 恶性肿瘤论文; 浓度论文; 《医药前沿》2013年第36期供稿论文;