娄楠[1]2010年在《人成骨肉瘤细胞系中高侵袭及类肿瘤干细胞亚系的建立》文中提出本研究以体外培养的人成骨肉瘤细胞系—MG63细胞为对象,应用有限稀释法进行单细胞分离和单克隆细胞株的培养,成功建立MG63骨肉瘤单克隆细胞株20余个。根据细胞形成的克隆形态,选取其中的完全克隆进行ALP、OCN、OPN等一系列成骨分化标志物基因表达的检测,同时检测各组细胞生物学行为指标,包括肿瘤细胞成瘤、侵袭、迁移、铺展粘附等,发现具有高低不同转移能力和成瘤能力的单克隆细胞株之间在部分成骨细胞标志物、肿瘤转移及促血管形成因子等基因表达具有显着差异。说明检测骨肉瘤细胞成骨分化标志物的基因表达差异可以判断肿瘤的分化程度。进一步通过RT-PCR、RealTime-PCR及Western blot等方法对它们的侵袭能力进行检测,发现高低不同转移能力的细胞株的Cofilin、Limk1基因及蛋白表达存在显着差异,说明Cofilin介导的信号通路在人成骨肉瘤细胞的侵袭、转移等行为中发挥极为重要的作用。最后本实验选取集落形成能力最强的Holoclone细胞株,利用无血清悬浮成球的方式分离出类肿瘤干细胞亚系---MG63-M,并在无血清培养环境中加入低浓度长春新碱,进一步富集、纯化。经RT-PCR、免疫荧光及流式细胞术等检测发现其表达CD133、Oct4、nestin等干细胞表面标志物,同时高表达Mdr1、ABCG2等多药耐药基因。另外,体外实验和动物实验都表明MG63-M不但具有与正常干细胞相似的自我更新和多项分化能力,同时具有极强的致瘤能力和极为显着的多药耐药性。本实验进一步验证了骨肉瘤异质性学说和肿瘤干细胞学说,为早期判断骨肉瘤侵袭及转移能力,克服骨肉瘤的多药耐药提供了新的理论基础和实验依据。
殷剑宁, 范清宇, 郝新宝, 杨宁[2]2002年在《拮抗凋亡转录因子基因在高转移人成骨肉瘤细胞系中的高表达》文中认为背景与目的:成骨肉瘤是青少年中最常见的恶性骨肿瘤,具有易发生肺转移的特点。尽管目前已能够成功地控制原发瘤,但是仍有30%以上的患者在5年内死于肺转移。更好地理解调节转移过程的分子机制,为设计有效的治疗方案提供生物学基础,我们用原位移植的方法建立了人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607裸鼠转移模型,用这一模型筛选出了高转移细胞系SOSP-M。本研究旨在通过比较两个细胞系的基因表达水平来克隆与骨肉瘤转移相关的基因,探讨成骨肉瘤转移的分子机制。方法:采用抑制性消减杂交技术建立人成骨肉瘤高转移细胞株SOSP-M的消减文库;用差异筛选技术筛选出阳性克隆;对部分克隆进行测序和同源性分析,用Northern杂交及反转录多聚酶链式反应技术对SOSP-M中表达上调的有意义的克隆在低转移细胞系SOSP-9607、OS-9901、高转移细胞系SOSP-M和裸鼠肺转移结节中的表达情况进行了分析。结果:在高转移细胞株SOSP-M中有2个阳性克隆均与人凋亡对抗转录因子(apoptosisantagonizingtransciptionfactor)同源(99%同源)。Northern杂交及反转录PCR证实这个基因在高转移细胞和裸鼠肺转移结节中高表达,而在低转移人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和OS-9901中表达微弱。结论:对抗凋亡转录因子在促进肿瘤细胞转移中可能起重要作用。
杨宁[3]2001年在《高转移人成骨肉瘤细胞株的筛选及其生物学特性的观察》文中提出成骨肉瘤是儿童和青少年最为常见的恶性骨肿瘤。虽然外科技术及化学药物治疗的不断改进使患者的术后生存率有了明显提高，但仍有约40％-50％的患者近期内死于复发或转移。转移仍然是影响生存的主要因素。因此，只有明确成骨肉瘤的转移机制和特性，才能寻找到有效的治疗方法。而新的治疗措施的发现有待于足够的证实局部肿瘤的生长和转移及与临床情况贴近的肿瘤模型的建立和对高转移细胞株的分子生物学特性的研究。 我们利用本室建立的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607，采用完整瘤组织块原位移植法获得裸鼠自发性肺转移模型，并以此为基础从人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中筛选出高转移细胞株第四军医大学硕士学位论文SOSPM。应用细胞计数法、染色体显示法、组织学检查、流式细胞术、免疫组织化学法、PCR同源性分析及裸鼠体内试验法研究细胞的生物学特性。 建立了裸鼠体内人成骨肉瘤转移模型，经裸鼠体内4次筛选人成骨肉瘤细胞系SOSP习607获得其高转移细胞株SOSP－M，其染色体为亚叁倍体，保持人类染色体核型，所致肿瘤符合人成骨肉瘤组织学特征。细胞周期中S期细胞所占比例为21．8％．细胞粘附分子CD44阳性表达率SOSP习607为2级、SOsP－M为4级PCR同源性分析证实裸鼠肺部转移灶为人成骨肉瘤细胞。裸鼠体内试验性转移率孤SPWh为10O，％SPAI为100％。 结果表明，裸鼠体内人成骨肉瘤自发性转移模型模拟了临床发病过程，SOSP－M为从SOSP习607细胞系中筛选出来的人成骨肉瘤高转移细胞株。
李新志[4]2006年在《稳定表达EGFP的不同转移特性骨肉瘤细胞亚株的筛选及基因差异性分析》文中研究表明目的：建立经绿色荧光蛋白基因转染的骨肉瘤细胞亚株并研究其生物特性，探讨骨肉瘤转移过程中基因的参与，以筛选骨肉瘤新的肿瘤相关及转移相关候选基因。通过比较MTA1基因在人骨肉瘤细胞高低转移株的表达水平，探讨MTA1表达与骨肉瘤细胞浸润和转移潜能的相关性。方法：利用脂质体转染pEGFP基因入人骨肉瘤MG63细胞系，通过细胞电泳，获得高低转移株细胞克隆M6和M8，经体外细胞增殖、软琼脂形成、生长曲线、检测细胞周期、裸鼠成瘤试验综合分析其生物学行为改变。采用含有8064个基因探针的cDNA基因芯片，以M6和M8作为研究对象，M6为实验组，M8为对照组，用半定量RT—PCR验证cDNA表达微阵列检测的结果，研究两细胞株基因表达的差异。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MG-63细胞高低转移株MTA1的表达情况，同时，用Boyden小室体外侵袭实验检测高低转移株的体外侵袭力的变化。结果：发现M6和M8两株均保持人类染色体核型，所形成肿瘤显示人成骨肉瘤上皮样组织形态，其中M6的群体倍增时间为38.4h，软琼脂形成率为18.7％，M8群体倍增时间为23.0h，软琼脂形成率为29.3％。裸小鼠背部皮下接种M6和M8，发现M8成瘤时间短，细胞增殖快，但在4周内两者均不发生转移。2个骨肉瘤细胞株差异表达的基因共有发生显着性表达变化的基因330个，其中与对照组(M8)相比，在实验组(M6)中上调表达的基因有152个，下调表达的基因有178个。在按照不同基因功能分类对实验结果进行分析时发现，具有比较明显的功能类别特征的表达变化基因主要包括与细胞增殖生长相关的基因，其表达变化的模式提示M6亚株中细胞增殖生长受到抑制；其次是大量与表达调控及信号传递相关的基因的表达变化，提示在两亚株间存在明显的基因表达模式的差异。这些基因大多是膜蛋白、细胞骨架蛋白，或和细胞信号转导有关，基因功能复习提示和肿瘤转移有可能的关联性。RT-PCR结果显示MTA1在MG-63低转移细胞株中表达水平低(1.32)，在高转移细胞株中表达水平高(6.27)(p＜0.05)；Boyden小室体外侵袭实验显示MG-63高转移株细胞体外侵袭力强，其穿膜细胞相对百分率为46.3±2.4％，低转移株细胞体外侵袭力较弱，其穿膜细胞相对百分率(12.6±1.1)％，两者差异有显着性意义(P＜0.05)；转染MTA1基因后，低转移细胞株转移潜能较未转染细胞明显增高。结论：骨肉瘤细胞亚系有不同的转移特性，GFP的整合及表达未对MG63细胞的生长状态造成明显影响，可作为报告基因进一步了解骨肉瘤细胞转移的差异性分析。基因芯片方法对于筛选骨肉瘤转移相关基因有独特的优势，获得的差异表达基因具有较强的代表性，对MG63细胞株的基因表达谱的进一步分析，为寻找骨肉瘤相关基因提供了重要线索。MTA1与人骨肉瘤细胞转移潜能有密切关系，MTA1对肿瘤转移的作用机制以及作为干预肿瘤转移靶基因的可能性值得进一步探讨。
殷剑宁[5]2001年在《人成骨肉瘤裸鼠转移模型中差异表达基因的克隆》文中进行了进一步梳理骨肉瘤是青少年中最常见的恶性骨肿瘤，其特点是产生骨样组织和不成熟骨基质的肿瘤细胞大量增殖。尽管手术治疗及局部和系统的辅助治疗都有了较大的进展，但是仍然有30％-40％的患者发生肺转移而死亡。 由于大多数癌症患者死于传统治疗难以对付的转移，所以急需研究出治疗转移癌的有效方案。深入的理解调节转移过程的分子机制不仅能够为肿瘤治疗的改进提供理论基础，而且能够为控制肿瘤转移提供新的思路。 要研究转移的分子机制和生物学机制，目前有效的方法是比较具有不同转移能力的细胞系。首先，我们用原位移植的方法建立了人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607的裸鼠转移模型。其次，用这个模型从母系SOSP-9607中筛选出了高转移细胞系SOSP-M。最 贡口旱出U聊士学位任文 一 后，由于SOSP9607和SOSP－M为同一亲本，二者的差异集中在 转移表型上，筛选出的差异表达基因与转移相关的可能性较大。“我们用抑制性消减杂交技术对这一对同源细胞进行了差异表达基 因片段的分离。用N。them hi。t验证了克隆片段的特异性表达，’用反转录 PCR的方法研究了它们在原位移植瘤和裸鼠肺转移结节 中的表达。 结果显示，在高转移细胞筛选研究中，经过叁轮筛选，SOSP－M 的裸鼠肺转移率达到 100％。我们用抑制性消减杂交技术在两个 细胞系中分别分离了两个可能与转移相关的基因，端粒结合因子 2（ThRFZ）和凋亡对抗转录因子＊ED人 NOrtheth blot结果表 明ThRFZ在SOSP－9607中特异表达，DED在SOSP－M中高表达。 反转录PCR的结果显示TERFZ在SOSP－9607细胞系和原位移植 瘤中高表达，在SOSP－M细胞系和裸鼠肺转移结节中不表达。而 DED在SOSP9607细胞系和原位移植瘤中低表达，在SOSP－M 细胞系和裸鼠肺转移结节中高表达。实验结果和关于这两个基因 产物的研究资料推测ThRFZ起到稳定基因组的作用，可能在转移 中起负调节的作用；而DED抑制与控制转移相关的促进细胞凋 亡的分子DAPK的作用，因此可能是转移的正调节物。
陈翔[6]2005年在《不同转移潜能的人成骨肉瘤细胞株的筛选与生物学性质观察》文中进行了进一步梳理成骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤,约占骨肿瘤的20%且多发于儿童及青少年,随着外科技术和影像学技术的发展,联合化疗及免疫治疗的进步,成骨肉瘤的治疗取得较大进展。但目前的治疗手段还无法从根本上解决成骨肉瘤的转移问题,仍有40%-50%的病人死于成骨肉瘤复发或转移,转移仍然是影响生存的主要因素。因此,只有明确成骨肉瘤的转移机制和特性,才能寻找到有效的诊断与治疗方法。目前的研究认为,肿瘤转移是一系列步骤组成的,包括侵袭周围组织,延血管或淋巴管运行、在靶器官上增殖等。虽然一些转移相关分子相继被鉴定出来,但是对操纵转移的的复杂机理仍知之甚少。为了在基因的水平对骨肉瘤进行研究,获得具有相同的遗传背景不同转移潜能的肿瘤细胞株十分重要。 我们从已经建立的人成骨肉瘤细胞系SOSP—9607中通过有限稀释法获得
张岩[7]2006年在《低分化骨肉瘤细胞株恶性逆转机制的研究》文中研究指明目的建立低分化特性人成骨肉瘤MG-63克隆细胞株,为研究骨肉瘤细胞分化研究提供良好的实验模型;用全反式维甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA)对人低分化骨肉瘤细胞株(MG-63)进行干预,检测低分化骨肉瘤细胞良性分化的特性,并探讨其恶性逆转的分子机制。方法通过体外的克隆技术,细胞计数法筛选并建立了6个单克隆细胞株,利用软琼脂克隆形成实验、染色体分析、细胞周期时相分析、及DNA含量和碱性磷酸酶的活性测定,比较、分析和鉴定各单克隆细胞株的分化特性,筛选出1 8号低分化骨肉瘤细胞株;用MTT法、透射电镜、流式细胞仪、RT-PCR、体外侵袭实验、DNA琼脂糖凝胶电泳实验、Western blot等检测1μmol/L的ATRA处理后18号骨肉瘤细胞株良性分化的特性并探讨了其恶性逆转的分子机制。结果共得到23个单克隆细胞株,其中的5、18号细胞株具有明显差异。18号为大核长梭形细胞,无接触抑制,克隆形成率高,DNA超二倍体,染色体众数集中在70～78之间,碱性磷酸酶活性低;代表低分化的骨肉瘤细胞株。ATRA处理后低分化骨肉瘤MG-63细胞的增殖受抑制,细胞出现了形态和功能的良性分化,细胞周期堆积于G1期,癌基因增殖细胞核抗原PCNAmRNA、黏附分子CD44v6mRNA、DNA甲基转移酶DnmtmRNA的表达水平降低,抑癌基因P16mRNA的表达水平增高,蛋白激酶C(PKC)和细胞周期素D(Cyclin D1)的蛋白表达下调,骨肉瘤细胞的侵袭能力下降,抗失巢凋亡的特性丧失。结论通过体外克隆技术、细胞生长曲线测定,DNA含量和染色体分析及琼脂克隆形成实验相结合的方法,可建立不同分化特性的MG-63克隆细胞株;ATRA对人骨肉瘤细胞株有诱导分化作用,处理后的低分化骨肉瘤细胞出现成熟分化特性,分别在基因水平,细胞周期调控及细胞信号传导上阐明了Dnmt在骨肉瘤细胞株诱导分化过程中活性调节的重要性及分子机制,认为抑制Dnmt的活性是ATRA诱导骨肉瘤细胞分化的重要机制之一。
包拥政[8]2016年在《miR-664调控靶基因SOX7促进MG-63骨肉瘤细胞体外侵袭和迁移机理研究》文中研究表明研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是主要发病于儿童和青少年且发病率最高的原发性恶性骨肿瘤。目前应用手术、化疗以及放疗等传统治疗仍有很多病例会出现远处转移,以肺转移最常见,转移患者存活率仍然较低,骨肉瘤的转移与复发是影响患者存活率的主要影响因素。因此有必要深入探究骨肉瘤发生侵袭和转移的机制,通过发现新的治疗手段抑制肿瘤的侵袭和转移以提高骨肉瘤患者的存活率。但骨肉瘤转移是涉及肿瘤细胞迁移和侵袭为主的多因素、多阶段的复杂环节,受到多个促肿瘤转移癌基因的调控,目前其转移相关的分子机制仍未阐明。miRNA是一类主要存在真核生物中长约18-25个碱基的的非编码的RNA分子,通过与靶基因的3'UTR碱基互补配对直接抑制mRNA的转录或蛋白质翻译,在基因转录后的调控中发挥着重要的作用。目前研究发现miRNA与肿瘤的发生发展密切相关,通过调控不同的靶基因促进或抑制肿瘤发生、增殖、转移、分化、凋亡以及血管生成的过程。越来越多的研究表明,一些miRNA在骨肉瘤患者中表达异常,调控着骨肉瘤细胞的发生、增殖、转移、凋亡等生物学行为。基因芯片筛查发现miR-664在骨肉瘤中过表达并与骨肉瘤患者的存活率相关,但在骨肉瘤的转移和侵袭中miR-664是否发挥着某种作用以及相应的靶基目前尚不清楚。研究目的：一、选取不同株的人骨肉瘤细胞株以及骨肉瘤组织标本,探究：1、骨肉瘤细胞株相对于正常人成骨细胞株miR-664的表达水平；2、骨肉瘤组织相对于癌旁组织miR-664的表达水平。二、构建miR-664 mimic、miR-664 inhibitor、miR-664 negative control质粒,转染进入MG-63骨肉瘤细胞株,建立稳定过表达或低表达miR-664的细胞株,利用Transwell趋化、侵袭实验和细胞划痕实验探究：1、转染miR-664 mimic质粒相对于miR-664 negative control质粒转染的MG-63骨肉瘤细胞株中骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力；2、转染miR-664 inhibitor质粒相对于miR-664 negative control质粒转染的MG-63骨肉瘤细胞株中骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。叁、利用生物信息学方法预测：1、miR-664作用的靶基因；2、检测所筛选的miR-664靶基因的生物学功能及可能的作用信号通道。研究方法：1、骨肉瘤细胞培养人骨肉瘤细胞株SOSP-9607、U2-OS、SAOS-2、HOS、MG-63采用含100U/ml青霉素和1 00U/ml链霉素的10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,人成骨细胞株hFOB1.19采用DMEM/F12培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养,细胞生长状态良好时用于实验,2-3天换液一次,根据细胞的密度传代。2、骨肉瘤组织标本收集8例骨肉瘤癌组织和对应癌旁组织(adjacent noncancerous tissues, TAT)均来源于湖南省郴州市第一人民医院及广东省韶关市粤北人民医院标本库,所有标本均为活体组织取下后即放于液氮中保存直至使用。所有患者均经病理学检查确诊为骨肉瘤,尚未接受放化疗治疗。本研究经医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。3、RNA抽提与荧光定量PCR分别利用mirVana miRNA抽提试剂盒从培养的细胞和新鲜切除的骨肉瘤组织中抽提RNA,利用Taqman miRNA逆转录试剂盒合成cDNA, miR-664的表达水平通过miRNA特异性的TaqMan MicroRNA试剂盒,使用ABI公司的7500 Real-time PCR仪进行荧光定量PCR反应,检测各模板的Ct值(C为cycle,T为threshold),每个样品重复3次,阴性对照采用DNase/RNase-free water为模板,通过相对定量以Folds=2-ΔΔCt值代表基因的相对表达强度,公式如下：-ΔΔCt=2-lCt(miR-664)-Ct(U6)]4、Western blot提取细胞内总蛋白,采用考马斯亮蓝法对蛋白进行浓度测定。采用SDS-PAGE对蛋白电泳、转膜后,用5%脱脂牛奶封闭,加入SOX7一抗、相应的二抗,显影和定影。使用a-tubulin作为内参。5、细胞的转染转染前24h,将MG-63细胞用0.25%胰酶消化离心计数后,将细胞密度调整至5×105/ml,将各组(miR-664 mimic、miR-664 inhibitor、miR-664 negative control)5μg重组质粒与lipofectamine 2000混合,轻轻混匀后室温孵育20min,加入到已经接种细胞的6孔板内,37℃、5%CO2饱和湿度下的培养箱中孵育6h,将培养基更换为含10%胎牛血清的完全培养基中培养。培养48h后抽提细胞总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR检测瞬时转染后各组miR-664的表达,6、细胞划痕实验划痕实验前48h,将细胞密度调整至5×105/ml,接种单细胞悬液于六孔板中培养24h,使细胞的密度达到约90-95%后将细胞培养上清吸出,再更换无血清的培养基继续培养细胞24h,使用20μl无菌的加样枪头在每孔中长满细胞的单细胞层中轻轻并迅速地划1-2道痕,用新鲜的无菌PBS冲洗板1次除去上清中漂浮的细胞并更换新鲜的完全培养基。分别在0h与24h时间点在显微镜下拍照。测量划痕两侧细胞之间的距离,每组设平行3个孔,计算0h的最大划痕与24h测划痕距离,计算不同组细胞划痕修复的速度,计算叁个孔的平均值。7、ELISA试剂盒说明书的说明,将标准品用蒸馏水稀释到指定的浓度,将待检测的上清样品用sample diluent稀释。计算好总的样本数(包括标准品孔、空白孔、以及样品孔,其中样品孔每个样品做相应的复孔),取出已经包被好MMP9的96孔板,分别每孔加入100μl标准品或样品,空白孔加入相应量的样品稀释液,而后加入50μl稀释好的一抗,37℃孵育2h,用washing buffer洗5次,每次1-2min；分别每孔加入100μl稀释好的二抗,室温孵育30min后用washing buffer洗叁次,每次3min。加入底物TMB,每孔100μl,显色15min后,每孔加入100μl终止液；450nm吸收波长测吸光值,计算细胞因子的相对浓度。8、骨肉瘤3D培养模型将细胞浓度调整至2×105/ml。将Matrigel胶完全覆盖24孔板底时,将24孔培养板置于37℃培养箱中约1h,待Matrigel胶重新凝固；将细胞悬液加入其中,置于37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中培养10天,10天内每隔2天在倒置显微镜下观察细胞的形态,并拍摄相应的照片。9、Transwell小室趋化和侵袭实验接种1.0×104个细胞于Transwell小室中,将50μl稀释好的Matrigel基质胶均匀铺于Transwell小室底部,37℃培养箱中放置3h。将各组MG-63骨肉瘤细胞接种前12h用无血清DMEM培养以去除血清对实验结果的影响。小室内加入200μl的无血清的DMEM培养基,于transwell小室下腔加入500gl含10%FBS的DMEM培养基,继续培养24h。然后从24孔板中取出Transwell、室,1×PBS轻轻冲洗3次,用棉签擦尽小室内的细胞,然后将小室置于1%多聚甲醛中固定10min,取出小室放入苏木精中浸泡,染色5min。沿小室底部边缘剪下滤膜,显微镜下观察穿透滤膜或Matrigel胶的细胞,于200倍光学显微镜下计数5个视野的细胞,取平均值,重复计数3次。10、生物信息学预测利用TargetScan (http://www.targetscan.org) miRNA靶基因预测的生物信息学网站中对miR-664的靶基因进行分析预测,分析显示SOX7可能是miR-664潜在作用的靶基因。11、荧光素报告酶系统检测由广州复能基因有限公司合成重组质粒pGL3-SOX73'UTR,将miR-664mimic、inhibitor、negative control、mut与pGL3-SOX73'UTR共同转染进入MG-63骨肉瘤细胞。转染48h后吸去上清中的培养基,用PBS清洗2次,每孔加入100μl Passive Lysis Buffer,室温轻轻振荡,裂解15min,先用GloMax生物发光检测仪读取细胞裂解后的背景值,每孔加入100μl luciferase底物,涡旋振荡混匀,读取相应的值,每孔加入100μlStop Reagent,振荡混匀后,测定各组荧光值。12、siNRA转染为进一步明确miR-664是否通过SOX7进行调控骨肉瘤MG-63细胞侵袭迁移能力,我们利用SOX7 siRNA干扰SOX7的表达并进一步利用Transwell趋化、侵袭实验观察低表达SOX7对MG-63骨肉瘤侵袭迁移能力的影响。SOX7siRNA#1及SOX7 siRNA#2由广州锐博生物科技有限公司合成并纯化,序列如下：SOX7 siRNA#1:TCTTGCTACAAAGCCTAAGTG SOX7 siRNA#2:TTGTCCATCCGACAGCTCGGC选MG-63 inhibitor组进行转染,方法如步骤5所述,分为MG-63 miR-664 inhibitor+NC、MG-63-miR-664 inhibitor+SOX7 siRNA#1、MG-63-miR-664 inhibitor+SOX7 siRNA#2叁组。13、Western blot检测SOX7 siRNA干扰后SOX7表达转染48小时后收集各组细胞并应用Western blot检测SOX7蛋白水平,方法如步骤4所述。14、siRNA干扰后transwell趋化、侵袭实验取NC组、SOX7 siRNA#1组及SOX7 siRNA#2组MG-63骨肉瘤细胞进行Transwell趋化、侵袭实验,方法如步骤9所述。15、统计学方法各骨肉瘤细胞株与人成骨细胞株hFOB1.19 miR-664的表达,mimic组与NC组、inhibitor组与NC组SOX7、β-catenin及MMP7蛋白的表达,NC组与mimic组、NC组与inhibitor组,NC组与mut组荧光酶活性涉及的两组数据之间的比较采用两独立样本的t检验,P<0.05为差异有统计学意义；mimic组与NC组、inhibitor组与NC组、mut组与NC组的MMP9表达涉及的两组数据之间的比较采用两独立样本的t检验,P<0.05为差异有统计学意义；siRNA#1组与NC组、siRNA#2组与NC组的SOX7蛋白表达、Transwell趋化实验、Transwell侵袭实验中涉及的两组数据之间的比较采用两独立样本的t检验,P<0.05为差异有统计学意义。利用双变量分析组织中miR-664与SOX7表达的相关性。研究结果：1、miR-664在骨肉瘤细胞株和骨肉瘤组织中的表达水平显着上调相较于对照组人成骨细胞株hFOB1.19细胞株,miR-664在5种骨肉瘤细胞株中(HOS、SAOS-2、SOSP-9607、MG-63和U2-OS)均显着表达上调(P<0.05),8例骨肉瘤组织标本中的miR-664表达显着高于对应的癌旁组织(P<0.05)。2、miR-664过表达可提高MG-63骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭能力转染miR-664 mimic后MG-63骨肉瘤细胞miR-664的表达增高了17.998倍(P<0.05)。Transwell小室迁移和侵袭实验显示无论上下层培养液以聚碳酸酯膜或Matrigel胶相隔,mimic组穿透滤膜或Matrigel胶的染色细胞均较NC组显着增加(P<0.05)。利用Matrigel胶建立骨肉瘤细胞3D培养的结果显示mimic组MG-63骨肉瘤细胞在10天的培养过程中逐渐生成无极性球状细胞克隆,随着培养时间的延长细胞克隆表面开始伸出丝状伪足,而NC组的细胞3D培养下的形态生成较小的球状克隆及形成较少的丝状伪足。细胞划痕实验结果显示mimic组的MG-63骨肉瘤细胞划痕修复速度显着快于NC组(P<0.05)。3、下调miR-664可以降低MG-63骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭能力转染miR-664 inhibitor后MG-63骨肉瘤细胞miR-664的表达降低了78.7%(P<0.05)。Transwell小室迁移和侵袭的实验显示无论上下层培养液以聚碳酸酯膜或Matrigel胶相隔,inhibitor组穿透滤膜或Matrigel胶的染色细胞较NC组显着减少(P<0.05)。利用Matrigel胶建立骨肉瘤细胞3D培养的结果显示inhibitor组MG-63骨肉瘤细胞在10天的培养过程中生成无极性球状细胞克隆较NC组小且无明显丝状伪足。细胞划痕的实验结果显示inhibitor组MG-63骨肉瘤细胞划痕修复速度显着慢于NC组(P<0.05)。4、SOX7基因是miR-664直接作用的靶基因我们利用TargetScan (http://www.targetscan.org) miRNA靶基因预测的生物信息学网站对miR-664的靶基因进行分析预测,根据miRNA与靶基因3’UTR不完全配对的原则分析显示SOX7可能是miR-664潜在作用的靶基因。分别检测mimic组、inhibitor组及NC组MG-63骨肉瘤细胞中SOX7、β-catenin及MMP7蛋白的表达水平。Western blot结果显示,与NC组相比mimic组中的SOX7蛋白表达显着下降(P<0.05),而β-catenin、MMP7蛋白表达显着上升(P<0.05)；inhibitor组SOX7蛋白表达量显着上升(P<0.05),而β-catenin、MMP7蛋白表达显着下降(P<0.05)。为进一步验证SOX7的3'UTR是否具有miR-664结合的位点,构建SOX7蛋白的3’UTR部分序列表达载体pGL3-SOX73'UTR,将其分别与miR-664 mimic、inhibitor negative control及mut共同转染到MG-63骨肉瘤细胞中,利用pGL3荧光素酶报告系统监测miR-664是否与SOX7蛋白相结合。与NC组相比,将pGL3-SOX73'UTR与miR-664 mimic共转染可显着降低荧光素酶的活性(P<0.05),将pGL3-SOX73'UTR与miR-664 inhibitor共转染可显着增强荧光素酶的活性(P<0.05),而将pGL3-SOX73'UTR与miR-664 mut或miR-664 negative control共转染均不能改变荧光素酶的活性(P>0.05),提示miR-664与SOX7'3UTR可特异性结合,即SOX7是miR-664的靶基因。ELISA结果显示与NC组相比mimic组中的MMP9表达显着上升(P<0.05),而inhibitor组MMP9表达显着下降(P<0.05)。5、抑制SOX7表达促进MG-63骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭为了进一步验证SOX7在骨肉瘤体外的迁移和侵袭中的功能,我们在inhibitor组MG-63骨肉瘤细胞株中利用siRNA干扰SOX7的表达,Transwell小室趋化、侵袭实验结果显示,相对于NC组,siRNA干扰后骨肉瘤细胞MG-63的迁移和侵袭能力显着增强(P<0.05),两种siRNA均对骨肉瘤细胞的迁移和侵袭具有显着的促进作用。6、miR-664与SOX7基因表达在骨肉瘤病人组织中的相关性分析荧光定量PCR的结果显示,6例骨肉瘤病人组织中miR-664相对于癌旁组织的表达显着上调。相对于癌旁组织中,SOX7在骨肉瘤病人组织中的含量显着下调。接下来我们对6例骨肉瘤组织和2例癌旁组织中miR-664表达水平与SOX7作相关性分析,统计学的结果显示miR-664的表达水平与SOX7呈负相关的线性关系(r=-0.91,P<0.05)。结论：1、miR-664在骨肉瘤细胞株和组织中表达水平显着上调；2、过表达miR-664显着促进骨肉瘤细胞株的迁移和侵袭；3、SOX7是miR-664作用的一个靶基因,抑制SOX7可显着促进骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭；4、miR-664和SOX7在骨肉瘤病人组织中的表达水平呈负相关性；5、SOX7可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭能力。
李伟[9]2007年在《靶向抗肿瘤偶联物苯丙胺酸氮芥—已二酸桥—偕二磷酸的靶向性及疗效实验研究》文中研究说明目的：靶向抗肿瘤药物在肿瘤局部靶向部位高浓度聚集，特异性识别、杀灭恶性骨肿瘤细胞，全身其它非靶向脏器药物浓度低，毒副作用小，达到高效低毒治疗骨肿瘤的目的。本研究的目的在于开发一种新型的靶向抗肿瘤药物，将亲骨性载体二膦酸盐与化疗药物苯丙胺酸氮芥偶联，并将放射性核素~(153)Sm与偶连物鳌合，合成一种双膦酸盐和亲骨核素为导向、化疗药物和β射线协同发挥作用的骨肿瘤靶向治疗系统，并通过体内体外实验验证合成偶联物的效应，为以后的临床试验用药提供理论依据。方法：(1)偶连物的合成及鉴定：将苯丙胺酸氮芥与二膦酸盐耦联，~(153)Sm与偶联物鳌合，合成新的偶联物，采用核磁共振仪、红外光谱仪、质谱分析进行偶合物的元素分析、红外光谱分析、~1H-NMR谱图分析，确定其组分、相对含量及结构鉴定；羟基磷灰石晶体吸附实验和荷瘤鼠体内分布显像实验，初步了解偶联物体内外的亲骨性能。(2)偶联物的细胞毒性实验：①体外培养观察不同浓度的偶连物对人成骨细胞的影响；②采用MTT、细胞活力分析、丫啶橙染色、流式细胞术、扫描电镜，观察不同浓度的偶连物对MG-63细胞增殖和凋亡的影响，研究偶联物对其生物学行为的影响。(3)裸鼠体内偶连物抗肿瘤实验研究：①用γ免疫计数仪、高效液相色谱仪分析测定靶组织(骨、肿瘤)和非靶组织(心、肝、肾)药物浓度，研究偶联物在小鼠体内的动力学分布规律和骨靶向性；②不同浓度偶连物对肿瘤的影响，计算抑瘤率；③RT-PCR和Western blot法，检测实验组和对照组caspase-3基因、C-myc基因表达差异。结果：(1)偶连物的合成及鉴定：对合成的偶联物结构进行核磁共振波谱分析，得出的光谱数据符合药物合成的要求；偶联物在体外对羟基磷灰石具有良好的吸附性能，在体内骨骼系统和血流丰富的脏器，尤其是肿瘤部位高度浓聚。(2)偶联物的细胞毒性实验：①不同浓度的偶联物对成骨细胞的贴壁率、体外克隆形成及细胞活力无明显影响，MTT实验显示偶联物各浓度组的成骨细胞OD值逐日增高，各组之间无统计学差异(P＞0.05)。②MG-63骨肉瘤细胞MTT实验显示：不同浓度的偶联物及苯丙胺酸氮芥作用下的骨肉瘤细胞，经过24到96小时培养后，OD值均减小，其中2000ug／ml浓度的偶联物组及阳性对照组在同一时间有显着性差异(P＜0.05)。细胞活力分析显示活细胞比例明显降低。各时间点各浓度组细胞活力无统计学差异(P＞0.05)；24小时，400ug／ml、2000ug／ml组与阳性对照组间有显着性差异(P＜0.05)；48小时，4ug／ml、400ug／ml、2000ug／ml组与阳性对照组间有显着性差异(P＜0.05)。丫啶橙染色结果：随着药物浓度提高和作用时间延长，可见凋亡小体形成。流式细胞仪检测发现：偶联物浓度为40ug／ml，苯丙胺酸氮芥浓度20ug／ml作用过的MG—63骨肉瘤细胞从24到96小时，凋亡率逐渐增高。电镜观察结果：对照组可见骨肉瘤细胞核完整规则，实验组随作用药物浓度及作用时间增加，出现典型的凋亡细胞。(3)裸鼠体内偶连物抗肿瘤实验研究：①小鼠体内放射性计数分布显示骨组织中的强度远远高于其它脏器，在3小时左右药物在骨组织中的浓度达到峰值。荷瘤裸鼠各个脏器中放射性计数在肿瘤组织中最高，其次为骨组织，再次为性腺、脾、肺等脏器。②经偶联物及苯丙胺酸氮芥作用后，裸鼠肿瘤生长明显受抑制，实验组高中剂量组与对照组间瘤重有统计学差异(P＜0．05)，两组对照组间肿瘤重量未见统计学差异(P＞0．05)。实验组与阳性对照组的抑瘤率分别是37．85％、32．02％、16．16％和17．11％。高、中剂量组肿瘤抑制率均大于30％。大体观察发现偶联物处理组的裸鼠饮食及精神等状况均优于苯丙胺酸氮芥处理组；组织病理学观察见偶联物及苯丙胺酸氮芥处理的瘤体标本肿瘤，部分出现变性坏死，而未经药物处理的瘤体肿瘤细胞生长活跃。③偶连物组肿瘤组织中Caspase-3的表达明显高于对照组(P＜0．05)：用药组C-myc癌基因的mRNA较对照组下降了3．26倍。结论：1．新合成的偶联物符合原药的功能结构特征；羟基磷灰石体外吸附试验、核素~(153)Sm标记偶联物荷瘤鼠体内分布显像实验确定该偶联物具有骨靶向性，并且偶连物对骨肿瘤区域有较好的靶向性。2．偶联物对人成骨细胞的毒性作用轻微；偶联物对骨肉瘤MG-63细胞有较强的诱导凋亡作用，随着偶联物浓度的升高及作用时间的延长MG-63细胞的凋亡率逐渐上升。3．体内分布说明偶联物有高度的骨靶向性。同苯丙胺酸氮芥比较，高、中剂量偶联物均可明显抑制裸鼠骨肉瘤的生长，病理学组织检查发现偶联物对肝肾无明显的损害。4．新合成的偶联物作为抗骨肿瘤药物的一种新尝试，为抗肿瘤药物的合成和临床治疗提供了一种新思路，为肿瘤的治疗和疗效评估开辟了新领域，具有潜在的临床应用价值。
陈翔, 杨彤涛, 马保安, 范清宇[10]2005年在《不同转移潜能骨肉瘤细胞株的筛选与建立》文中进行了进一步梳理目的获得不同转移潜能的骨肉瘤细胞株。方法从我室建立的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中通过有限稀释法获得不同的单细胞克隆,经过侵袭试验初筛后获得5株转移潜能不同的细胞株,再通过裸鼠体内连续传代法筛选出具有不同转移能力的细胞系。结果获得两株转移潜能不同的骨肉瘤细胞株。结论这两株细胞株它们来源于同一亲本,他们之间的差异集中在转移表型上,为今后利用分子生物学的方法筛选出转移相关基因,从而为成骨肉瘤的转移机制及临床研究奠定基础。
参考文献：
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[3]. 高转移人成骨肉瘤细胞株的筛选及其生物学特性的观察[D]. 杨宁. 第四军医大学. 2001
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[5]. 人成骨肉瘤裸鼠转移模型中差异表达基因的克隆[D]. 殷剑宁. 第四军医大学. 2001
[6]. 不同转移潜能的人成骨肉瘤细胞株的筛选与生物学性质观察[D]. 陈翔. 第四军医大学. 2005
[7]. 低分化骨肉瘤细胞株恶性逆转机制的研究[D]. 张岩. 华中科技大学. 2006
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[9]. 靶向抗肿瘤偶联物苯丙胺酸氮芥—已二酸桥—偕二磷酸的靶向性及疗效实验研究[D]. 李伟. 四川大学. 2007
[10]. 不同转移潜能骨肉瘤细胞株的筛选与建立[J]. 陈翔, 杨彤涛, 马保安, 范清宇. 华南国防医学杂志. 2005
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