广西玉林市陆川县人民医院 广西陆川 537700
摘要：目的：以广西不同产地的多叶越南槐为研究对象，建立多叶越南槐的HPLC指纹图谱，通过指纹图谱比较多叶越南槐与山豆根的一致性，为科学评价和有效控制多叶越南槐药材的质量提供参考依据，为多叶越南槐与山豆根同源性研究提供数据参考。方法：采用高效液相色谱技术，色谱柱Agilent Eclipse-C18（150 mm×4.6 mm，5 um），流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（用三乙胺调PH6.45）梯度洗脱，检测波长215 nm，柱温30℃，流速1.0 ml/min，进样量为10 μl。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》计算机软件计算10批药材的相似度。结果：指纹图谱的方法考察包括精密度、稳定性和重复性实验，均符合有关规定，建立的多叶越南槐指纹图谱有14个共有峰，并利用对照品的保留时间及DAD的紫外图谱双指标定性，指认了7个共有峰；每批药材指纹图谱比较相似度均在0.9以上；多叶越南槐与山豆根指纹图相比较，相似度均在0.9以上。结论：该方法精密度、稳定性及重现性较好，特征性及专属性强，可以有效地用于多叶越南槐药材的质量控制，为开发和利用多叶越南槐药材资源提供科学依据，通过多叶越南槐与山豆根指纹图谱的比较，可推测出多叶越南槐与山豆根成分相似，亲缘性关系相近。
关键词：多叶越南槐；山豆根；HPLC；指纹图谱
多叶越南槐为豆科槐属植物，是越南槐的一个变种，分布于广西、广东、云南、贵州和江西等省[1]。其性寒，味苦，具有清热解毒、消肿利咽之功效，常用于火毒蕴结，咽喉肿痛，齿龈肿痛，肺热咳嗽，肝炎等疾患的治疗。张颖、钟正贤[2]等对多叶越南槐的药理作用进行研究，得出多叶越南槐具有一定的抗炎、镇痛、抗肝损伤、抗肺栓塞，免疫增强和抗疲劳作用。多叶越南槐与山豆根同属豆科植物越南槐的不同种，主要成分为生物碱，包括苦参碱，氧化苦参碱，槐果碱，槐醇等。王守柏[3]等研究发现，同一植株越南槐中的生物碱在地下根茎中含量为最高，达到1.86%。广西中医药研究院卢文杰研究员等对多叶越南槐化学成分进行了研究，从多叶越南槐中分离出苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、高丽槐素、芒柄花素、红车轴草苷等成分。
植物药具有复杂的化学成分，而其活性成分常常不只一种成分，本文首次采用HPLC法对广西不同产地的多叶越南槐进行指纹图谱的研究并将多叶越南槐图谱与山豆根图谱进行比较，为系统、科学地评价和有效控制多叶越南槐药材的质量提供了科学依据，为研究多叶越南槐与山豆根同源性提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷仑公司）；超纯水器（MILLIPORE公司）；TP-214电子分析天平（南京庚辰科学仪器有限公司）；CXP-100型多功能粉碎机（上海市晟喜制药机械有限公司）；津腾溶剂过滤器；HH-S6数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版（国家药典委员会）
1.2 试药
槐果碱、氧化槐果碱、高丽槐素、芒柄花素、红车轴草苷对照品；苦参碱对照品、氧化苦参碱对照品；甲醇（分析纯），甲醇（色谱纯）；无水乙醇（分析纯），氨水（分析纯），三氯甲烷（分析纯），乙腈（色谱纯）。
2 色谱及检测条件的选择
为了使多叶越南槐中的主要成分能够在HPLC指纹图谱中得到充分反映，因此必须确定一个有效的色谱分离方法及检测条件。由于影响样品分离的因素很多，我们从主要的二方面进行了考察：流动相的选择，检测波长的选择。
2.1 流动相的选择
本文分别采用乙腈-水（0.2%磷酸+0.32%三乙胺）系统[4]，乙腈-0.1%磷酸系统，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（三乙胺调PH6.45）系统[5]，对多叶越南槐的HPLC图谱进行考察。由实验所得图谱可看出乙腈-0.1%磷酸系统的色谱虽然基线平稳，但峰数少；乙腈-水（0.2%磷酸+0.32%三乙胺）系统出峰过快，峰数较少；结果以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（三乙胺调PH6.45）系统的分离效果最好，基线较平稳，峰数多，出峰时间适中。故选乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动。
2.2 检测波长的选择
文献中的检测波长一般是为了测定某一确定成分的，不一定完全适合指纹图谱的需要，为了获取多层次的信息，需要选择多个不同的检测波长进行考察。本实验考察了205 nm、210 nm、215 nm、220 nm、254 nm、280 nm不同波长下的指纹图谱，实验表明，在210 nm、215 nm、220 nm处各峰均有较好的紫外吸收，色谱信息丰富，共有峰面积占总峰面积比例大。我们选215nm作为检测波长。
2.3 确定色谱检测条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18
检测波长：215 nm
流速：1.0 ml/min
进样量：10 ｕl
柱温：30 ℃
3 方法与方法学考察研究
3.1样品制备方法
取多叶越南槐粉末约1g，精密称定，置具塞锥型瓶中，加入无水乙醇-氨水（3：2）2ml，放置0.5 h后加入三氯甲烷25ml，约70℃回流2h，冷却，滤过，挥干溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45ｕm微孔滤膜滤过，取续液即得。
3．2 供试品制备方法
山豆根供试品制备方法同多叶越南槐制备方法一致。
3.3 对照品溶液的配置
取苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、高丽槐素、芒柄花素、红车轴草苷对照品适量，精密称定，分别置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
3.4 方法学考察
3.4.1 精密度试验
取1号多叶越南槐药材粉末约1g，精密称定，按“3.1”项下的方法制备供试品溶液，记录色谱图，考察仪器的精密度。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD在0.0%-0.3%之间；各色谱峰相对峰面积的RSD在0.4%-5.7%；表明仪器的精密度良好。
3.4.2 重复性试验
取1号多叶越南槐粉末6份，每份约1g，精密称定，按“3.1”项下的方法制备供试品溶液，记录色谱图，考察仪器的重复性。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆结果表明，6份样品的各色谱峰相对保留时间的RSD在0.0%-0.2%；各色谱峰相对峰面积的RSD在2.1%-8.7%。
3.4.3 稳定性试验
取重复性试验项下一供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进行测定，记录色谱图，考察供试品溶液的稳定性。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD在0.0%-0.3%；各色谱峰相对峰面积的RSD在0.5%-4.4%；表明供试品溶液的稳定性良好。
4 指纹图谱的建立
4.1 空白基线
为考察溶剂中是否有杂质及溶剂峰干扰样品成分的分析，故用溶剂进行空白梯度检测。实验结果表明溶剂在同样的色谱条件下会出现一些杂质或溶剂峰的干扰，影响样品成分的分析。
4.2 各产地多叶越南槐药材指纹图谱的采集
取10批不同产地的多叶越南槐药材粉末约1g，精密称定，按“3.1”项下的方法制备供试品溶液，记录10批次多叶越南槐药材的HPLC色谱图，用国家药典委员会颁布的计算机软件建立多叶越南槐指纹图谱。
4.3 参照色谱峰的确定
指纹图谱的参照峰主要用于考察指纹图谱的稳定性和重现性，并有助于色谱的辨认，起着辨认与评价色谱指纹图谱特征的作用。本实验选用高丽槐素作为参照峰。高丽槐素是多叶越南槐的主要成分，而且高丽槐素在指纹图谱中的8号峰保留时间适中，峰面积占总峰面积最大，在各个不同来源的多叶越南槐药材色谱图中均有此峰，故选用高丽槐素作为参照峰。
4.4 共有峰的确定
运用计算机软件对指纹图谱数据分析评价，10批次图谱都匹配的色谱峰标定为共有指纹图谱峰。本文共标定14个共有指纹峰，利用对照品的保留时间和DAD检测器的紫外图谱进行双指标定性，确定了1号峰为氧化苦参碱、2号峰为氧化槐果碱、3号峰为苦参碱，4号峰为槐果碱，5号峰为红车轴草苷、7号峰为芒柄花素、8号峰为高丽槐素，这些特征峰可作为控制多叶越南槐药材质量的标准之一。本文以指纹图谱峰面积大，保留时间适中的8号色谱峰为参照峰。以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算10批多叶越南槐药材共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，不同批次的多叶越南槐药材共有峰相对保留时间RSD在0.0%-0.6%之间，而相对峰面积RSD较大。由此可知，本实验建立的色谱方法可以使不同批次的多叶越南槐药材具有基本一致的色谱行为，但药材之间各种化学成分的含量受多种因素的影响，因此具有较大的差异。
4.5 多叶越南槐相似度评价
指纹图谱的评价指标是指供试品指纹图谱与该品种对照用指纹图谱及供试品之间指纹图谱的相似性。
本实验采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对多叶越南槐药材HPLC指纹图谱进行相似度计算，10批次多叶越南槐药材与对照指纹图谱的相似度计算结果均大于0.9，表明各批次多叶越南槐药材与对照指纹图谱有较好的一致性，本方法可用于综合评价药材的整体质量
5 多叶越南槐与山豆根一致性的比较
取3批不同产地的山豆根药材粉末约1g，精密称定，按“3.1”项下的方法制备供试品溶液，记录3批次多叶越南槐药材的HPLC色谱图，用国家药典委员会颁布的计算机软件选择编号为1的多叶越南槐药材图谱为参照图谱，以平均数法作为对照指纹图谱的生成方法，设定时间窗宽度为0.1min对山豆根药材和多叶越南槐药材色谱图进行叠加，进行相似度计算，由结果可得10批次多叶越南槐药材与山豆根药材指纹图谱的相似度计算结果除个别外均大于0.9，表明各批次多叶越南槐药材与山豆根药材指纹图谱有较好的一致性，多叶越南槐与山豆根的化学成分相似，亲缘关系较近。
6 讨论与分析
6.1 利用Agilent1200型高效液相色谱仪，本着指纹图谱的确认必须遵循信息量最大化的原则，对205nm、210nm、215nm、220nm、254nm、280 nm扫描的各波长下的色谱图进行分析比较，结果发现，在210nm、215nm、220nm处供试品的各色谱分离峰基线分离、基线平稳，信息量大，我们选择215nm作为检测波长。
6.2 本实验对不同提取溶剂（甲醇、氯仿、95%乙醇、75%乙醇）和不同的提取方法[超声提取（功率：2500W，频率：40kHz）和回流提取]进行比较，结果发现，氯仿回流120min提取的供试品溶液色谱峰数多，组分含量高，信息较丰富。
6.3 中药材成分复杂，选用单一流动相很难达到很好的分离效果，本实验采用梯度洗脱方法，通过调控洗脱程序和流动相比例，使样品在整个分析时间段达到充分的分离。我们选用乙腈-水[即乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（三乙胺调PH6.45）]系统做流动相，乙腈在UV短波长检测HPLC级吸收最少，产生的噪声少，梯度基线产生的鬼峰也少。加入磷酸并用三乙胺调PH的目的是为了改善色谱峰的分离程度及改善峰形.
6.4 采用国家药典委员会颁布的计算机软件对多叶越南槐药材与山豆根药材指纹图谱的相似度进行计算，结果除个别外均大于0.9，表明各批次多叶越南槐药材与山豆根药材指纹图谱有较好的一致性，多叶越南槐与山豆根的化学成分相似，亲缘关系较近。
6.5 本实验建立了多叶越南槐药材的HPLC指纹图谱分析方法，此方法稳定、可靠、重现性好，可为多叶越南槐药材的质量评价及控制提供科学依据。但本文仅从广西各地区收集了10批药材的样品，某种意义上未能代表多叶越南槐药材的广泛性与同一性，应收集更多地区的药材样品，获得更多的信息，保证多叶越南槐指纹图谱良好的特征性和代表性。目前多叶越南槐药材中具体的化学成分不详，未能对指纹特征共有色谱峰进行峰的归属，各色谱峰对应功效、药理不清，未能做到谱效关系对应。仍需进一步对多叶越南槐指纹共有特征峰的化学成分及其药理做深入研究。
参考文献：
[1]谢宗万．中药材品种论述：上册．第2版[M]上海：上海科学技术出版社，1990：142-144．
[2]张颖，钟正贤，卢文杰，等.多叶越南槐的药理作用研究[J]中国药导报，2011，17（11）：62-64
[3]王守柏，徐云翔.越南槐植物体内生物碱的分布[J]中国野生植物资源，2003，22（3）：479
[4]黄颖，王乃平，陈勇.广西产山豆根HPLC指纹图谱测定[J]中国实验方剂学杂志，2011，17（14）：66-68
[5]刘振龙，张丽，魏蕾初，等.HPLC同时测定苦豆子总碱中8种生物碱含量[J]中国实验方剂学杂志，2013，（8）
论文作者:黄素姣
论文发表刊物:《健康世界》2015年10期供稿
论文发表时间:2016/1/12
标签：图谱论文; 指纹论文; 色谱论文; 药材论文; 山豆根论文; 溶液论文; 波长论文; 《健康世界》2015年10期供稿论文;