李跃华[1]2004年在《TLRs介导的NF-κB信号通路在心肌肥大发生发展中作用的研究》文中认为背景：肥大心脏最终将发展为心力衰竭，而后者又是多种心血管疾病死亡的重要原因。然而，目前仍不清楚心肌肥大发生发展的确切机制。尽管已有多种细胞内信号传递途径涉及到心肌肥大的发生发展，但仍不清楚哪一条信号通路和何种转录因子起着主要作用。 我们以往的研究发现，缺血再灌注大鼠的心肌组织中，NF-κB活性显着增高。由于缺血再灌注所致的心肌损伤和压力负荷的增加是导致心肌肥大的重要因素，我们推测，NF-κB信号途径直接参与到心肌肥大发生发展过程中。为证实我们的推测，我们设计了以下几个方面的实验研究。 目的： 1．阐明在整体条件下，NF-κB信号通路是否在心肌肥大的发病机制中起着关键作用。 2．探讨NF-κB活性变化在PI3K／Akt信号通路激活所诱导的心肌肥大发生发展中的作用。 3．研究同时抑制NF-κB结合活性和PI3K／Akt信号途径对心肌肥大发生发展的影响，了解二者是否存在协同作用，以期为临床用药提供理想靶点。 4．确定TLRs介导的MyD88依赖性NF-κB信号途径在心肌肥大发生发展方面的作用。 方法： Ⅰ．动物模型 1．为阐明在整体条件下，NF-κB信号通路是否在心肌肥大的发病机制中起着关键作用，我们以缩窄SD大鼠升主动脉诱导的心肌肥大为模型，分析了NF-κB的DNA结合活性。此外，我们将腺病毒携带的IκBα突变体(NF-κB 南京医科大学博士学位论文活性的特异，国中制物)转染到心刀醚且织中，或使用抗幸以七剂-H刀℃或NAC，观察了抑制入下~KB活了铆寸，心月朋巴大发生发展的影响。 1为探讨卜下~KB活性变化在PBK/Akt信号通路激活所诱导的心月朋巴大发生发展中的作用，我们以，‘脏特异性持续性激活PI3K俏kt信号的转基因小鼠仲田BK和伪A虹)为模型，检测了这些转基因小翩巴大心肌组织中的卜下~KB活性。同时，我们以咫K/Aki无功能转基因小鼠帅IP13K和k少血)为动物模型，观察了缩窄主动脉后，。助切巴大的发展情况，及心肌组织中的卜下~KB活性。 1为研究同时抑制NF~KB结合活性和PI3刃Akt信号途径对，心月侧巴大发生发展的影响，我们以伪A狱转基因小鼠所诱导的心刀切巴大和缩窄野生型小鼠主动脉诱导的心川胡巴大为模型，研究了同时抑制卜J~KB活性和咫K/Aki信号途径对心月朋巴大发生发展的影响。同时我们亦观察了抑制卜下~KB活性对缩窄无功能PI3K和k少血转基因小鼠主动月永诱导的，心刀胡巴大发生发展的影响。 屯为确定TLF污介导的哑归88依赖性N下~KB信号途径在心川巴大发生发展方面的作用，勿门以缩窄SD大鼠升主动脉诱导的，。刀切巴大为模型，将腺病一翻隽带的无功能M夕眺8(DN‘NlyD88)转染到心月少峪沮织中，以观察阻断M州哟下游信号通路对，心月朋巴大发生发展的影响。为探讨卫J始介导的信号途径在心月朋巴大发生发展中的作用，我们以卫“R斗-/-缺陷小鼠为模型，观察了卫卫4功能缺失对心月朋巴大发生发展的影响。 几观察指标 撰洱绷包浆和月色该蛋白，采用日功SA的方法分析NF一KB结合活性;采用酶活J幽幽则的方法检钡d IRAKI、邓K和水X口激酶的活性;采用贾叮℃R法撼钡弓AN[P和BN[P mRNA的表达;采用认峡九m blot分析Akt、水Xa/口、IKBa、只心女政和GSK3日的磷酸化水平;采用共免疫沥‘定方法检测卫只4与砂口88的交互作用;采用HE染色的方法，了解，心肌细胞形态结构。 结果: 南京医科大学博士学位论文 L缩窄大鼠升主动脉，明显增加心那以织中NF.书B活性 1.缩窄升主动脉后，大鼠，心脏重量/体重比值明显增加，缩窄l周和4周后，与周龄配对的假手术组相比，分别升高了35.8%和53.6%(少刃.01);心刀切巴大的重要标志-A卜IP和BNP mRNA表达水平也明显增高，缩窄1周和3周后，与周龄配对的假手术组相比，AN pl五RNA分别升高了122.0o/d卜2772%，B卜沪mRNA分别升高了 370%和547%。 1升主动脉缩窄1天后，与周龄配对的假手术组相比心肌组织中的入下破B活性增加了167%(少习.01)。在，“月朋巴大的发生发展过程中，卜正火日活性待续增加，在升主动月和缩窄3周达高峰，4周后开始回降，但与对照组相比仍然明显增高;同时服K日活性的增高刀侈宿窄升主动脉的第1天一直持续到缩窄主动脉后的第六周。 1转染Ads一‘B oM能明显地喇氏缩窄升主动脉所增加的，。脏重量琳重比值，与未治疗组相比，下降了n .9%(厂习.01)，同时阳氏卜下~KB结合活性(九乃，水卫aM治疗组与未治疗组相比下降了48名%，少刃.05)和卜水刀。蛋白表达水平。 屯抗氧化剂.班刀℃和NAC处理组与未治疗组相比，其，讼脏重量阵重比值分别喇氏了143%《少刃.01)和11 .5%(p(。.05)，心月少峪且织中NF一KB结合活性也分别喇氏了40.5%和267%。 几N卜‘B参与F6KIA址信号途径诱导的心刃切性大 1.在压力负荷增加诱导的大鼠心月朋巴大模型中，咫K/Aki被激活，心月少醚沮织中邓K活性增加l科%，卜Akt蛋白表叁彭曾力口42.5%，Aki蛋白?
刘春样[2]2010年在《Pellino1对心肌肥大调控作用的研究》文中认为病理性心肌肥大是导致心力衰竭和突然死亡的主要危险因素。引起心肌肥大的常见因素包括高血压﹑心肌梗死﹑瓣膜病和心肌病等。各种致心肌肥大因素通过心脏细胞内信号转导途径改变相关核转录因子的活性,导致心脏组织中大量基因/蛋白质的表达出现异常,使得心脏的形态结构和功能发生变化。在我们前期的研究中,已证实Toll样受体/白介素-1受体(Toll-like receptor/ Interleukin-1 receptor, TLR/IL-1R)介导的核因子-kB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路在心肌肥大的发生发展中发挥重要的调控作用,但对其具体的细胞内信号转导机制还知之甚少。最近,有研究发现,Pellino蛋白家族对TLR/IL-1R介导的细胞内信号转导起着重要的调控作用。Pellino蛋白家族在哺乳类动物已鉴定出3种亚型,分别称为Pellino1、Pellino2和Pellino3。Pellino蛋白的羧基末端含有一个C3HC4指环样结构基序,该结构主要介导蛋白质-蛋白质以及蛋白质-DNA间直接的作用,其最主要的是具有E3泛素化连接酶的作用。在Pellino蛋白氨基末端包括一个隐藏的FHA (forkhead-associated)结构域,FHA结构域是具有特征性的磷酸苏氨酸结合基序,介导Pellino与TLR/IL-1R信号通路下游重要的信号分子磷酸化白介素-1受体相关激酶-1(IL-1R-associated kinase1, IRAK1)的结合。体外研究发现,Pellino1由IRAK1磷酸化激活,与多种E2复合物如Ubc13–Uev1a、UbcH3、UbcH4、UbcH5a和UbcH5b等结合形成聚泛素化链,发挥E3泛素化连接酶的活性,并且能够被IRAK4磷酸化而增强其E3泛素化连接酶的活性。目前认为Pellino蛋白作为一种E3泛素化连接酶,对TLR/IL-1R信号通路中关键的细胞内信号分子IRAK1、肿瘤坏死因子α受体相关因子6(TNF-αreceptor association factor 6, TRAF6)、TGF-β活化激酶1(TGF-βactivated kinase 1,TAK1)等的激活有重要的调控作用。体外研究已提示,Pellino1可以通过与IRAK1、IRAK4和TRAF6等信号分子相互作用发挥其对IL-1R介导的NF-κB信号转导的调控作用。但Pellino蛋白家族在心肌肥大中的表达变化及其可能的调控作用至今尚不清楚。为此,本研究拟着重探讨Pellino蛋白家族在心肌肥大中的调控作用。本研究包括动物整体实验和和体外细胞实验两部分。在体实验以C57BL/6小鼠主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction, TAC) 4周的方式复制心肌肥厚模型,观察心肌肥大程度,同时,采用RT-PCR和western blot检测Pellino的表达水平,免疫共沉淀实验观察肥大心肌组织中Pellino1与IRAK1的结合情况,EMSA检测NF-κB的DNA结合活性。体外实验以原代培养的乳大鼠心肌细胞为研究对象,以IL-1β为刺激物诱导心肌细胞肥大,采用shRNA干扰Pellino1的表达,探讨Pellino1在心肌细胞肥大形成中的作用,同时通过免疫共沉淀方法观察其对TRAF6泛素化水平的影响,并观察NF-κB结合活性的改变。在体实验结果显示小鼠TAC 4周可导致明显的心肌肥大,TAC组小鼠心重/体重比值(heart weight-to-body weight ratio, HW/BW)和左心室/胫骨长度比值(left ventricular weight to tibial length ratio, LVW/TL)与假手术组相比分别上升了20.89% (4.700±0.05514 Vs 5.682±0.1336,P<0.001, n=6)和16.11% (4.898±0.05935 Vs 5.687±0.1319, P<0.001, n=6)。左心室心肌组织HE染色及Masson染色显示,TAC组心肌细胞横切面积明显增加,细胞间隙中纤维结缔组织增多。RT-PCR结果显示在肥大的心肌组织中Pellino1的mRNA表达水平与假手术组相比增高了194.96% (0.1825±0.0213 Vs 0.5383±0.09187, P<0.01, n=6),Pellino3的mRNA表达水平与假手术组相比降低了46.55%(0.3562±0.05083 Vs 0.1904±0.02016, P<0.05, n=6)。TAC组与假手术组左心室肌组织中Pellino2的mRNA表达水平没有明显变化。我们选取Pellino1作为进一步的研究目标。Western blot结果显示,在肥大的心肌组织中Pellino1蛋白表达水平比假手术组增高了74.85% (0.4092±0.03334 Vs 0.7155±0.03945, P<0.01, n=5)。免疫共沉淀结果显示肥大心肌组织中IRAK1与Pellino1的结合水平比假手术组增高了48.93% (0.2624±0.03442 Vs 0.3908±0.040205, P<0.05, n=5)。EMSA结果显示肥大心肌组织中NF-κB的DNA结合水平与假手术组相比增高了128.76% (5508±343.8 Vs 12600±629.8, P<0.001, n=5)。上述研究结果表明,在TAC诱导的心肌肥大发展过程中Pellino1表达水平明显增加、Pellino1与IRAK1的交互作用增强、该信号通路下游的核转录因子NF-κB活性增加,提示在压力超负荷诱导的心肌肥厚模型中,Pellino1与IRAK1/NF-κB信号通路的激活,以及心肌肥大的发生发展具有相关性。为了明确Pellino1是否通过调控IL-1R介导的NF-κB信号通路在心肌细胞肥大过程中发挥重要作用,我们进一步采用IL-1β作为刺激物,探讨Pellino1在体外培养的原代乳大鼠心肌细胞肥大形成中的作用。结果发现,用10ng/ml的IL-1β刺激36小时能明显诱导心肌细胞肥大,其细胞面积比空白对照组升高41.69% (4749±276.3 Vs 6729±327.5, P<0.001, n=3), IL-1β组Pellino1 mRNA的表达水平与对照组相比升高了182.6% (0.1121±0.01471 Vs 0.3168±0.03206, P<0.01, n=3)。转染shPellino1抑制Pellino1的表达之后,能明显减少IL-1β诱导的心肌细胞肥大,其细胞面积比IL-1β刺激组减少了47.41% (6729±327.5 Vs 3539±189.8, P<0.001, n=3)。我们还观察到转染shPellino1组与空白对照组相比,其细胞面积也减少了25.48% (4749±276.3 Vs 3539±189.8, P<0.05, n=3)。IL-1β能明显诱导心肌细胞蛋白合成的增加,其3H-亮氨酸掺入量比空白对照组升高23.64% (7714±275.0 Vs 9538±386.8, P<0.01, n=3)。转染shPellino1能明显抑制IL-1β诱导的心肌细胞蛋白合成的增加,其3H-亮氨酸掺入量比IL-1β组降低68.89% (9538±386.8 Vs 2967±148.2, P<0.001, n=3)。我们还观察到转染shPellino1组与空白对照组相比,其3H-亮氨酸掺入量减少了61.54% (7714±275.0 Vs 2967±148.2, P<0.001, n=3)。IL-1β刺激使心肌肥大特异性指标心房利钠肽(atrial natriuretic peptide, ANP) mRNA水平明显升高,比空白对照组升高238.10% (0.2614±0.03181 Vs 0.8838±0.04803,P<0.001, n=3);转染shPellino1后再给予IL-1β刺激,ANP mRNA水平比IL-1β刺激组减少80.76% (0.8838±0.04803 Vs 0.1700±0.06283, P<0.001, n=3)。IL-1β刺激使心肌肥大特异性指标脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP) mRNA水平明显升高,比空白对照组升高232.4% (0.4179±0.01199 Vs 0.6363±0.02676, P<0.001, n=3);转染shPellino1之后再给予IL-1β刺激, BNP的mRNA水平比IL-1β刺激组减少42.57% (0.6363±0.02676 Vs 0.2297±0.2297, P<0.001, n=3)。给予IL-1β刺激36小时后,心肌细胞NF-κB结合活性增加了59.26% (8330±404.7 Vs 13266±434.5, P<0.05, n=3),转染shPellino1后再给予IL-1β刺激,可使IL-1β引起的NF-κB结合活性降低49.13% (13266±434.5 Vs 6749±1012, P<0.01, n=3)。转染shPellino1也使IL-1β诱导的TRAF6的泛素化水平降低(尚需进一步重复)。体外实验结果显示,Pellino1在IL-1β刺激的心肌细胞中表达是上调的,抑制Pellino1的表达可明显减轻IL-1β诱导的心肌肥大反应,同时抑制NF-κB的结合活性,表明Pellino1在IL-1β诱导的心肌细胞肥大反应中起着至关重要的作用,其机制可能与其调控IL-1R介导的NF-κB激活相关。综合在体及体外两部分实验结果提示,Pellino1是心肌肥大过程中一个重要的调节蛋白,Pellino1可能通过与IRAK-1相互结合参与NF-κB信号通路的调控,从而在压力负荷诱导的心肌肥大以及IL-1β诱导的心肌肥大反应中发挥重要的调控作用。
王永梅[3]2007年在《纤维蛋白原通过MyD88依赖性NF-κB信号途径参与心肌肥大的发病机制研究》文中研究指明纤维蛋白原(fibrinogen，FG)是血浆中一种主要由肝细胞合成及分泌的含量丰富的凝血因子，对凝血、血流变具有重要影响。其血浆含量的高低与多种心血管疾病有着密切联系，目前已将其作为预测包括心肌肥大、心肌梗死在内的多种心血管疾病的危险因子。纤维蛋白原在介导白细胞、血小板粘附聚集，内皮细胞、平滑肌细胞增殖，组织损伤后纤维化形成等过程中具有重要的促进作用。然而对于纤维蛋白原与心肌肥大发病机制之间的研究未见报道。本项研究旨在探讨纤维蛋白原与压力负荷增加诱导的病理性心肌肥大的发病过程及信号调控机制方面的重要联系。本课题采用体内外实验相结合的方法，通过缩窄SD大鼠主动脉弓诱导心肌肥大模型，对纤维蛋白原在心肌组织中的聚集部位及含量进行相关检测。并将纤维蛋白原作为刺激物观察其对新生乳大鼠心肌细胞的刺激作用及相关信号通路改变的影响。本研究发现SD大鼠术后心脏明显增大，尤以左心室增加为主，心肌组织Masson染色显示单个心肌细胞明显肥大，微血管壁周围出现纤维化改变，肥大心肌组织中纤维蛋白原的聚集量较周龄适配的假手术组相比明显增加(P＜0.05)，纤维蛋白原心肌免疫组化染色发现其聚集部位多以细胞外基质为主。并且肥大心肌组织中TLR4与MyD88结合增加20％(P＜0.05)，NF-κB结合活性增加了18％(P＜0.05)。此外MyD88下游的P38-MAPK信号通路在SD大鼠主动脉缩窄后活性增加约220％(P＜0.05)。体外研究发现纤维蛋白原可以诱导新生大鼠心肌细胞发生肥大反应，纤维蛋白原刺激后24小时其细胞表面积较空白对照组增加约30％(P＜0.05)，心肌细胞肥大特异性指标ANP mRNA水平较空白对照组增加了115％(P＜0.05)。同时心肌细胞骨架蛋白α-actinin的合成增加，NF-κB结合活性显着增强69％(P＜0.05)。而以上肥大反应效果在转染MyD88显性失活突变(dominant-negative MyD88，dnMyD88)质粒后均受到不同程度的抑制。以上研究结果提示纤维蛋白原参与了压力负荷增加诱导的心肌肥大的发病过程。并且纤维蛋白原可以通过MyD88依赖性的NF-κB信号通路参与诱导新生大鼠心肌细胞的肥大反应过程。
姜华[4]2006年在《高血压左室重构中Toll样受体4/NF-κB信号途径的作用》文中指出目的：高血压左室重构是心脑血管疾病的独立危险因子，是心衰发生发展的基本机制，因此寻找各种原因导致心脏重构发生中的共同信号通路以及探求高血压靶器官的直接保护措施一直是心血管疾病防治的重要策略。最近研究认为炎症机制在高血压心脏重构中起着重要作用，但目前缺乏足够的证据和深入的研究。NF-κB是一组广泛存在的多向性核转录调节因子，参与炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤发生等多种生物进程，在体及离体实验中均表明NF-κB是心肌肥大所必需的核转录调节因子。Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)是近年克隆出来连接先天免疫和特异性免疫的跨膜信号转导受体，主要介导细菌脂多糖(LPS)的跨膜信号传导，在心脏中也有较高水平的表达。TLR4与配体结合后最终导致核因子-κB(NF-κB)的活化，调控炎症和免疫相关基因的表达。许多参与癌细胞和免疫细胞调节的跨膜信号通路参与了心肌细胞肥大性生长的调节，那么在无明显感染证据的高血压左室重构过程中是否也存在TLR4／NF-κB信号的识别介导作用，仍需深入探索。 肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)的主要效应因子血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，本身是一种促炎症介质，AngⅡ的大部分生理功能如血管收缩、心肌细胞肥大等是通过AT_1受体起作用的。心肌局部RAS参与了高血压心室重构的发生。研究表明心肌细胞通过TLR4对低纳克水平的LPS仍然敏感，诱导心肌细胞凋亡，在体及离体情况下，AT_1受体拮抗剂均能完全抑制LPS促发的心肌细胞凋亡。提示TLR4介导的信号通路可能与心肌局部肾素-血管紧张素系统相关，但具体作用过程、激活机制、及其相互的调控关系有待更多的研究工作明确。 本研究中我们从在体和离体两个方面，通过观察Goldblatt大鼠左室重构过程中TLR4表达与NF-κB的变化情况及其与压力负荷、左室心肌血管紧张素Ⅱ含量、心肌纤维化程度的相互关系，初步探讨TLR4在高血压左室肥厚发生发展中的作
徐世军[5]2006年在《桂枝挥发油对TLR2、TLR4基因表达及其信号转导通路的影响》文中研究说明炎症是临床诸多急慢性疾病共有的主要病理过程之一，或引起机体的防御反应而被消除，或引发炎症失控而造成机体功能紊乱或器官损害。桂枝是樟科植物肉桂的嫩枝，自古以来主要应用于“表证”等诸多疾病的防治。现代研究表明炎症是表证的重要病理改变之一，桂枝挥发油(the Volatile oil of Ramulus Cinnamomi，VORC)是桂枝抗炎的主要有效部位群。课题组前期研究表明VORC对急性、慢性、免疫损伤性炎症均具有良好的拮抗效果，其抗炎作用与拮抗炎症因子生成和释放、抗氧化损伤等有关。近年来认为炎症就是炎症免疫信号转导紊乱所致，Toll信号转导尤其引人瞩目。本研究主要进行了VORC抗炎作用、对急性肺炎模型肺组织Toll信号通路关键靶分子的影响以及多个炎症信号通信“分子对话”靶点PTK活性影响的研究。 目的：探讨VORC抗炎作用与Toll炎症信号转导通路主要靶点的关系，揭示VORC抗炎作用的分子信号机理，为中药“辛味”理论提供现代科学依据。 方法：以LPS致大鼠急性肺炎等模型为研究载体，采用实时荧光定量PCR技术、基因克隆技术、免疫酶联吸附技术及病理组织形态学技术等研究手段，观察了VORC抗炎作用、VORC对肺炎模型肺组织匀浆TLR2、TLR4、MYD88基因表达，P-IκB-α、NF-κB P65、TNF-α、IL-1β含量以及PTK活性的影响，从炎性信号识别内化、胞内转导、易位入核、炎症相关基因转录、前炎症因子的产生和不同炎症信号的分子对话等角度揭示VORC抗炎作用的分子转导信号机制。 结果： 1．VORC抗炎作用研究 研究表明，VORC对二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进、角叉菜胶致大鼠足肿胀和LPS致大鼠急性肺损伤等急性炎症均有显着的拮抗作用。 2．VORC对TLR2、TLR4、MYD88mRNA表达的影响 研究表明，正常SD大鼠肺组织中有少量的TLR2、TLR4、MYD88mRNA表达，LPS尾静脉注射后6h肺组织匀浆中TLR2、TLR4、MYD88mRNA表达显着高于空白组(P＜0.05)，VORC高、中、低叁个剂量均可以显着抑制急性肺炎模型肺组织匀浆中的TLR2、
肖响[6]2014年在《丹参酮ⅡA磺酸钠对UA血瘀证患者外周血单核细胞TLRs/MyD88/NF-κB信号通路的影响》文中提出背景：冠心病不稳定性心绞痛(unstable angina, UA)在临床上易发展为心肌梗死,严重影响患者的生活质量,甚至危及患者生命。有研究报道,toll样受体激活的细胞信号转导途径可以介导UA过程中的免疫炎症反应,在心肌细胞、内皮细胞等处表达程度升高,参与冠状动脉粥样硬化斑块和血栓的形成,促进疾病的发生和发展。目的：通过研究丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对冠心病UA血瘀证患者TLR2、TLR4、MyD88、 NF-κB的影响,评价丹参酮ⅡA磺酸钠注射液治疗冠心病UA血瘀证患者的临床疗效,证明活血化瘀药物治疗冠心病UA血瘀证患者有效,并从TLRs细胞信号通路水平揭示活血化瘀中药通过抑制炎症反应,达到治疗心绞痛的目的。方法：1、筛选广安门医院心内科2013年8月至2014年3月收治的冠心病UA住院患者80例作为UA组,选取我院南区健康体检人员20人作为健康对照组,应用流式细胞术检测并比较UA患者与健康人外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB表达水平。2、选取冠心病UA血瘀证患者60例,冠心病UA非血瘀证患者20例,应用流式细胞术检测并比较血瘀证与非血瘀证患者外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4、MyD88、 NF-κB表达水平。3、将60例冠心病UA血瘀证患者随机分成治疗组和对照组各30人。对照组依据冠心病心绞痛治疗指南进行西医常规治疗,治疗组在对照组治疗用药的基础上,加用丹参酮ⅡA磺酸钠注射液16ml+0.9%氯化钠注射液250ml,日一次静脉注射,治疗10±2天。治疗前后采用流式细胞术检测外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4和NF-κB的阳性表达率和MyD88的平均荧光强度。采集入组患者相关检查和实验室检验结果数据。4、所有数据应用SPSS19.0统计学软件分析处理,计量资料采用均数士标准差((?)±s)表示,计数资料采用频数表示。组内治疗前后比较采用配对t检验,组间计量资料比较采用独立样本t检验,采用偏相关和回归分析进行相关性检验,计数资料组间比较采用X2检验。以P<0.05表示统计学差异有显着性。结果：1、UA患者外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4和NF-κB的阳性表达率均较健康人的阳性表达率高；UA患者外周血CD14+单核细胞MyD88平均荧光强度较健康人表达升高,差异有极显着性意义。2、UA患者血清hs-CRP水平与外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表达水平之间呈正相关。3、UA血瘀证患者外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4、NF-κB阳性表达率和血清hs-CRP水平明显高于UA非血瘀证组患者,差异有统计学意义。4、UA血瘀证组患者外周血CD14+单核细胞MyD88荧光强度高于UA非血瘀证组患者,但差异无统计学意义。5、丹参酮ⅡA磺酸钠治疗后治疗组心绞痛症状疗效、心电图疗效、血瘀证中医证候疗效均优于对照组。6、治疗后治疗组TLR2、TLR4阳性表达率低于对照组,差异有统计学意义,且各组治疗前后组内比较,差异有统计学意义。7、治疗后治疗组NF-κB阳性表达率与对照组比较,差异无统计学意义；各组治疗前后组内比较,差异有显着性差异。8、治疗后治疗组MyD88平均荧光强度低于对照组,差异有统计学意义；治疗组治疗前后组内比较,差异有统计学意义,对照组治疗前后MyD88平均荧光强度差异无统计学意义。结论1、冠心病UA患者外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4、MyD88、和NF-κB表达升高。2、TLR2、TLR4通过MyD88依赖性通路参与了UA过程中的免疫炎症反应。3、冠心病UA血瘀证患者血清hs-CRP水平比非血瘀证患者血清hs-CRP水平高。4、冠心病UA患者外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4与血清hs-CRP呈正相关,可能在疾病发展中起协同作用。5、冠心病UA血瘀证患者外周血CD14+单核细胞TLR2、TLR4、NF-κB的表达高于冠心病UA非血瘀证患者。6、丹参酮ⅡA磺酸钠注射液治疗UA血瘀证可能通过抑制TLR2、 TLR4/MyD88/NF-KB信号通路,抑制UA患者的炎症因子的释放,稳定斑块,缓解心绞痛症状。
杨梅[7]2012年在《活化的Toll样受体对人内皮（祖）细胞生物学功能的影响及其机制研究》文中研究指明第一章聚肌胞(PolyⅠ:C)对人脐血内皮祖细胞增殖的影响及其机制研究第一节人脐血内皮祖细胞表达Toll样受体的研究目的：分离纯化人脐静脉血来源的单个核细胞并诱导培养为内皮祖细胞,观察Toll样受体在人脐血内皮祖细胞中的表达情况。方法：采用密度梯度离心法分离人脐静脉血中的单个核细胞,用含多种生长因子的内皮祖细胞专用EBM-2培养基诱导培养,诱导单个核细胞向内皮祖细胞分化,通过形态学、免疫荧光及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测并鉴定细胞的生物学特性；采用RT-PCR法检测静息状态下人内皮祖细胞(EPCs)表达的Toll样受体亚型；检测不同浓度的PolyⅠ:C对内皮祖细胞表达TLR3受体、炎性细胞因子的影响。结果：1.分离培养的内皮祖细胞早期以集落为中心呈放射状生长,晚期形成典型的“铺路石”样改变。荧光染色示DiL-acLDL和FITC-UEA-I双染色阳性；RT-PCR法检测示细胞表达干细胞表面标志物CD34、CD133、KDR,证明为内皮祖细胞。2.静息状态下,内皮祖细胞表达较高水平的TLR1、TLR3、TLR4、TLR6,表达较低水平的TLR2、TLR5、TLR7、TLR8、TLR10,不表达TLR9。而PolyⅠ:C能上调TLR3的mRNA及蛋白表达,并呈量效关系。3. PolyⅠ:C通过活化TLR3剂量依赖性上调炎性细胞因子IL-1p、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-p的基因表达。结论：EPCs表达功能性TLR3；PolyⅠ:C能呈剂量依赖性上调TLR3在EPCs的mRNA及蛋白表达,并通过活化TLR3剂量依赖性上调炎性细胞因子的mRNA表达。第二节PolyⅠ:C对人脐血内皮祖细胞增殖、凋亡的影响目的：观察TLR3的配体PolyⅠ:C对人脐血内皮祖细胞增殖、凋亡的影响。方法：采用不同浓度的PolyⅠ:C持续干预人脐血内皮祖细胞(EPCs),通过CCK-8细胞增殖试验检测其对EPCs增殖的影响及时间效应；通过流式细胞术检测不同浓度的PolyⅠ:C对EPCs细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响。结果：1.与对照组相比,较高浓度PolyⅠ:C(1,10μg/m1)持续作用于脐血内皮祖细胞3天后显着抑制内皮祖细胞增殖；终浓度10μg/ml的PolyⅠ:C呈时间依赖性抑制内皮祖细胞增殖。2.较高浓度的PolyⅠ:C(1,10μg/m1)显着减少S期和G2/M期细胞比例,并通过下调细胞周期素A,B1,D1,E的表达阻滞细胞周期于G0/G1期而改变细胞周期的时相分布,从而抑制EPCs的增殖。3. PolyⅠ:C呈剂量依赖性诱导内皮祖细胞凋亡。结论：高浓度的PolyⅠ:C通过将细胞周期阻滞于G0/G1期并诱导细胞凋亡从而抑制EPCs增殖。第叁节PolyⅠ:C诱导人脐血内皮祖细胞凋亡的机制研究目的：阐明PolyⅠ:C诱导人脐血内皮祖细胞凋亡的具体机制。方法：利用Caspase8的抑制剂和Caspase9的抑制剂抑制相应的信号分子,分析其对PolyⅠ:C诱导细胞凋亡的作用。以不同浓度的TNF-α及IL-1β干预EPCs24h后,CCK-8细胞增殖试验分别检测TNF-α和IL-1β对细胞凋亡的影响。利用IL-1β受体的中和抗体Anti-IL-1R1预先封闭IL-1β的结合位点,分析其对PolyⅠ:C诱导细胞凋亡的作用。结果：1. Caspase8和9的抑制剂并不能抑制PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡。2.随着TNF-α作用浓度的增高,EPCs的细胞凋亡率并无明显增加。3.随着IL-1p作用浓度的增高,EPCs的细胞凋亡率逐步增加,并呈剂量依赖性。使用IL-1p受体的中和抗体Anti-IL-1R1预先封闭IL-1p的结合位点后,再加入PolyⅠ:C干预24h,结果显示高浓度的Anti-IL-1R1可以部分抑制PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡。结论：PolyⅠ:C活化TLR3后通过上调IL-1p的表达诱导EPCs凋亡,而内、外源性细胞凋亡途径及TNF-a不参与PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡第二章Pam3CSK4在人脐静脉内皮细胞中诱导非耐受性的细胞因子表达第一节Pam3CSK4对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制目的：阐明TLR1/2激动剂Pam3CSK4对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制。方法：以不同浓度的Pam3CSK4干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs), RT-PCR法检测Pam3CSK4对TLR1、TLR2mRNA表达的影响。用RT-PCR法、Real-time RT-PCR法、ELISA法检测Pam3CSK4对HUVECs分泌TNF-α、IL-6的时间效应及剂量效应。分别用TLR1、TLR2及TLR1阻断剂阻断相应受体的表达,观察其对Pam3CSK4诱导HUVECs分泌TNF-α、IL-6的影响。用Western-blot法检测Pam3CSK4对MAPK家族及NF-κB信号转导通路的活化情况。结果：Pam3CSK4呈剂量依赖性上调TLR2的mRNA表达,而对TLR1mRNA表达的影响不明显。Pam3CSK4呈剂量依赖性上调TNF-α、IL-6的基因及蛋白表达量。加入TLR1、TLR2、TLR1/2受体阻断剂后均能明显抑制Pam3CSK4诱导的TNF-a、IL-6的基因表达上调,其中以TLR1/2受体阻断剂的阻断作用最明显。Pam3CSK4与TLR2结合后可以不同程度活化MAPK家族和NF-κB信号传导通路。结论：HUVECs表达功能性TLR2；Pam3CSK4与TLR2结合后活化MAPK家族和NF-κB信号传导通路,从而诱导炎症因子TNF-α、IL-6的分泌,且TNF-α、IL-6的分泌依赖于TLR1及TLR2的表达。第二节Pam3CSK4在人脐静脉内皮细胞中诱导非耐受性的IL-6表达目的：阐明预处理的TLR1/2激动剂Pam3CSK4重复刺激对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制。方法：以不同浓度的Pam3CSK4预处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,再用Pam3CSK4重复刺激HUVECs,用RT-PCR法、Real-time RT-PCR法、ELISA法检测Pam3CSK4对HUVECs分泌TNF-α、IL-6的影响。用不同TLR受体的配体预处理HUVECs后,再用Pam3CSK4重复刺激HUVECs,以观察不同TLR受体之间的耐受情况。Western-blot法检测Pam3CSK4重复刺激对MAPK家族及NF-κB信号传导通路的活化情况。RT-PCR法检测Pam3CSK4对负性调节蛋白锌指蛋白A20基因表达的影响,然后用质粒转染试验检测A20的过度表达对Pam3CSK4及LPS诱导的IL-6分泌的影响。用Notch信号通路抑制剂抑制相关分子,观察其对Pam3CSK4诱导HUVECs分泌IL-6的影响。结果：给予HUVECsPam3CSK4预处理后,再给予Pam3CSK4重复刺激可以下调TNF-a的基因及蛋白表达,而对IL-6表达无影响。LPS预处理可以使Pam3CSK4诱导的TNF-α表达下降,而对IL-6表达无影响。Pam3CSK4重复刺激HUVECs能抑制JNK通路的活化,而对p38、ERK、NF-κB信号通路的活化无影响。Pam3CSK4呈剂量依赖性上调负性调节蛋白锌指蛋白A20的基因表达,A20的过度表达对Pam3CSK4及LPS诱导的IL-6分泌无明显影。Notch信号通路抑制剂能部分抑制Pam3CSK4诱导的IL-6分泌。结论：1.Pam3CSK4重复刺激可诱导耐受性的TNF-α表达,而诱导非耐受性的IL-6表达。2.TLR2与TLR4之间存在交叉耐受性。3.Pam3CSK4可能通过Notch信号通路诱导非耐受性的IL-6表达。
陈婷玉[8]2017年在《从TLR4/NF-κB通路探讨芪药鸡金粥对化疗后大鼠胃肠道紧密连接蛋白的影响》文中提出目的从TLR4/NF-KB信号通路角度进一步研究芪药鸡金粥在化疗大鼠模型的消化道紧密连接蛋白中的调控作用;观察该药膳对化疗大鼠胃肠道损伤、脾气虚症状和体重状况的影响;初步明确芪药鸡金粥的剂量差异与相关实验结果间变化的关系。方法将40只SPF级Wistar大鼠随机分为模型组、高剂量药膳组、常规剂量药膳组、低剂量药膳组和空白组,每组各8只。实验共16天。实验第1天对模型组及各剂量药膳组大鼠行5-FU 150mg/kg 一次性腹腔注射,复制化疗所致胃肠黏膜损伤大鼠模型及脾气虚证候大鼠模型,空白组给予等量生理盐水腹腔注射。实验2-15天,模型组及空白组给予10ml/kg白粥灌胃;高剂量药膳组、常规剂量药膳组、低剂量药膳组分别给予20ml/kg、10ml/kg、5ml/kg芪药鸡金粥灌胃。实验期间观察每组大鼠体重及脾气虚症状并记录;实验结束后采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测各组大鼠肠道 TLR4/NF-κB信号通路蛋白(TLR4、NF-κBp50、NF-κBp65和IκBα)表达水平,以及大鼠肠道紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin、JAM-1和Z0-1)的表达水平。采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinstaining,HE)制作大鼠胃肠黏膜病理切片,观察大鼠胃肠黏膜状况。使用XFuor4系统对ELISA实验结果进行处理,并用SPSS20.0软件进行实验数据的统计分析。结果1大鼠肠道紧密连接蛋白的变化各组大鼠Claudin-1蛋白表达情况的差异有统计学意义(P<0.05);组间两两比较结果显示,各剂量药膳组和空白组Claudin-1蛋白的表达水平均高于模型组,其中以空白组蛋白表达水平最高;各剂量药膳组间Claudin-1蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠Occludin蛋白表达情况差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠JAM-1蛋白表达水平的差异有统计学意义(P<0.05);组间两两比较结果显示,高剂量药膳组、低剂量药膳组及空白组JAM-1蛋白表达水平高于模型组,其中以空白组蛋白表达水平最高;但各剂量药膳组间JAM-1蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠ZO-1蛋白表达水平的差异有统计学意义(P<0.05);组间两两比较结果显示,各剂量药膳组与模型组、空白组的比较差异无统计学意义(P>0.05)。2大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白的变化各组大鼠IκBα蛋白变化水平的差异有统计学意义(P<0.05);组间两两比较结果显示,模型组IκBα蛋白的表达水平高于常规剂量药膳组和低剂量药膳组,其中以常规剂量药膳组蛋白表达水平最低;各剂量药膳组间IκBα蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠NF-κBp50及NF-KBp65蛋白表达情况变化差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠TLR4蛋白变化表达情况的差异有统计学意义(P<0.05);组间两两比较结果显示,空白组TLR4蛋白表达水平低于模型组及各剂量药膳组,以模型组的表达最高,但各剂量药膳组之间结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。3大鼠胃肠黏膜病理损伤的变化各组大鼠胃黏膜绒毛结构均较完整、边缘整齐;但充血程度存在差别,以模型组最为严重,表现在胃绒毛间红细胞分布较密集,固有层毛细血管充血现象较为明显;各剂量药膳组间充血状况未见明显差异。各组大鼠回肠黏膜病理损伤评分差异无统计学意义(P>0.05);但仍可以看出各组之间回肠黏膜结构的形态差异,以模型组肠黏膜损伤最为严重,可见绒毛变性、萎缩,部分绒毛脱落,完整性破坏;低剂量药膳组次之;常规剂量药膳组绒毛形态不规则,低矮、稀疏、肿胀;高剂量药膳组肠黏膜绒毛结构较完整,绒毛整齐密集,在形态上与空白组差别较小。4大鼠脾虚症状评分的变化造模后除空白组外,各组大鼠均出现了肢体倦怠、皮毛脱失、萎黄及腹泻等脾气虚症状,说明脾气虚大鼠造模成功。实验期间,各组大鼠评分于第二天明显升高,整个实验期间模型组及各剂量药膳组评分高于空白组水平,纵观,以模型组的评分最高,空白组脾气虚症状评分变化幅度较平稳。5大鼠体重的变化实验2-7天,除空白组外,其余各组大鼠体重显着下降,并于实验5-6天降至最低,之后各组大鼠体重呈波动上升趋势;与模型组相比,高剂量药膳组大鼠体重水平高于模型组;空白组大鼠体重呈进行性增长趋势,且高于同期各个药膳组及模型组水平。结论1芪药鸡金粥可上调化疗后大鼠胃肠道Claudin-1及JAM-1紧密连接蛋白水平,但对Occludin及ZO-1紧密连接蛋白表达的调控作用尚不明确;其对TLR4/NF-κB信号通路中的IκBα蛋白具有一定的抑制作用,但对该通路TLR4、NF-κBp50及NF-κBp65蛋白的调控作用尚不明确。因此,尚不能明确芪药鸡金粥是否借由TLR4/NF-κB通路调控胃肠黏膜紧密连接蛋白表达,而促进大鼠化疗后胃肠黏膜损伤的恢复。2芪药鸡金粥能在一定范围内修复大鼠化疗后胃肠道损伤症状,对改善化疗后大鼠脾气虚症状及体重状况具有积极意义。3不同剂量芪药鸡金粥与相关指标的量效关系尚不明确,仍需进一步研究探讨。
杨娟[9]2014年在《TLR4/NF-κB信号通路在黄芪甲苷抑制异丙肾上腺素诱导心肌肥厚中的作用》文中研究指明目的观察异丙肾上腺素（Iso）诱导心肌肥厚中Toll样受体4(TLR4)／核因子-B(NF-B)信号通路及炎症因子的改变，并进一步探讨黄芪甲苷（As IV）对Iso致心肌肥厚的保护作用及其机制。方法体内试验：以Iso5mg﹒kg-1﹒d-1腹腔注射制备大鼠心肌肥厚模型。SD大鼠随机分为6组:对照组、Iso组、 Iso+As IV20,40,80mg﹒kg-1﹒d-1及Iso+Pro40mg﹒kg-1﹒d-1。体外实验：原代培养新生SD大鼠心肌细胞48h，分别加入As IV3,10,30μmol﹒L-1、IκBα磷酸化抑制剂BAY11-70825μmol﹒L-1以及β-受体阻滞剂普萘洛尔（Pro）2μmol﹒L-1作用30min，再加入Iso10μmol﹒L-1继续培养48h。检测各组动物全心质量指数（HMI）、左心质量指数（LVMI）；取左心室组织进行HE染色，测量左心室心肌细胞横径；消化分离法及计算机图像分析系统检测乳鼠心肌细胞体积；考马斯亮蓝法检测乳鼠心肌细胞蛋白含量；RT-PCR法检测心房钠尿肽(ANP)和TLR4的mRNA表达；Western blot检测TLR4、IκBα和p65的蛋白表达；ELISA法检测TNF-α、IL-6的含量。结果体内试验：同对照组相比，Iso组大鼠表现为HMI、LVMI及左心室细胞横径显着增加，ANP、TLR4mRNA、血清中TNF-α和IL-6明显增加，TLR4、p65的蛋白含量增加以及IκBα蛋白含量减少（P<0.01）。与Iso组相比，黄芪甲苷不同剂量组表现为HMI和LVMI降低，左心室细胞横径缩小，ANP、TLR4mRNA表达减少，TLR4、p65的蛋白含量减少以及IκBα蛋白含量增加，血清中TNF-α、IL-6减少（P<0.05），且呈一定的剂量相关性。体外实验：同对照组相比，Iso组心肌细胞体积明显增大，总蛋白含量增加，ANP mRNA、TLR4mRNA和蛋白、p65蛋白表达上调，IκBα蛋白表达下调，细胞外液中TNF-α、IL-6的量显着增加（P<0.01）。黄芪甲苷、BAY11-7082和普萘洛尔均能有效抑制Iso诱导的心肌细胞肥大，使心肌细胞体积减小，总蛋白的量降低，ANP mRNA、TLR4mRNA和蛋白、p65蛋白表达下调，IκBα蛋白表达上调（P<0.05），且上述作用呈一定的剂量依赖性。结论黄芪甲苷对Iso诱导的心肌肥厚有保护作用，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。
梁灵君[10]2013年在《黄芪多糖对肿瘤坏死因子-α诱导的乳大鼠心肌细胞肥大和TLR4的影响》文中认为目的观察肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导的乳大鼠心肌细胞肥大中Toll样受体4(TLR4)和核因子-B (NF-B)信号通路的表达情况，并进一步探讨黄芪多糖(APS)对TNF-α致乳大鼠心肌细胞肥大的改善作用及相关作用机制。方法原代培养乳大鼠心肌细胞，应用100μg·L-1肿瘤坏死因子-α诱导心肌细胞肥大。实验共分成7组:1)正常对照组(Normal组)，2) TNF-α模型组，3) NF-B阻断剂BAY11-7082组，4) TNF-α+BAY11-7082组，5) TNF-α+APS (25mg·L-1)组、6) TNF-α+APS (50mg·L-1)组和7) TNF-α+APS (100mg·L-1)组，加药48h后，根据实验设计检测指标。采用考马斯亮蓝法检测心肌细胞蛋白含量；采用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积；采用罗丹明-鬼笔环肽染色观察细胞肌动蛋白微丝的变化；采用RT-PCR法测定心房钠尿肽(ANP)和TLR4的mRNA表达;：采用Western blot法检测心肌细胞TLR4、p65和IκBα的蛋白表达；采用ELISA法检测心肌细胞外液IL-1β的蛋白表达。结果与Normal组相比, TNF-α模型组表现出明显的心肌细胞肥大，表现为心肌细胞蛋白含量明显增加(P<0.01)、细胞体积明显增大(P<0.01)、ANP mRNA表达明显增多(P<0.01)、细胞肌动蛋白微丝排列紊乱和数量明显增多，同时TLR4蛋白和mRNA表达明显增加(P<0.01)，p65蛋白表达明显增多(P<0.01), IκBα的蛋白表达明显减少(P<0.01)和炎症因子IL-1β的蛋白表达明显增多(P<0.01)。与TNF-α模型组相比，APS组能够有效抑制TNF-α诱导的心肌细胞肥大，表现为：心肌细胞蛋白含量明显减少(P<0.05或P<0.01)、心肌细胞体积明显减小(P<0.05或P<0.01)、ANP mRNA表达降低(P<0.05或P<0.01)、细胞肌动蛋白微丝排列整齐和微丝的量减少，TLR4的蛋白和mRNA表达都明显减少(P<0.05或P<0.01)，p65蛋白表达降低，IκBα的蛋白表达明显增加，炎症因子IL-1β的蛋白表达明显减少(P<0.05或P<0.01)。结论黄芪多糖能有效改善肿瘤坏死因子-α诱导的乳大鼠心肌细胞肥大和炎症反应，其机制可能与抑制TLR4/NF-B信号通路激活有关。
参考文献：
[1]. TLRs介导的NF-κB信号通路在心肌肥大发生发展中作用的研究[D]. 李跃华. 南京医科大学. 2004
[2]. Pellino1对心肌肥大调控作用的研究[D]. 刘春样. 南京医科大学. 2010
[3]. 纤维蛋白原通过MyD88依赖性NF-κB信号途径参与心肌肥大的发病机制研究[D]. 王永梅. 南京医科大学. 2007
[4]. 高血压左室重构中Toll样受体4/NF-κB信号途径的作用[D]. 姜华. 大连医科大学. 2006
[5]. 桂枝挥发油对TLR2、TLR4基因表达及其信号转导通路的影响[D]. 徐世军. 成都中医药大学. 2006
[6]. 丹参酮ⅡA磺酸钠对UA血瘀证患者外周血单核细胞TLRs/MyD88/NF-κB信号通路的影响[D]. 肖响. 北京中医药大学. 2014
[7]. 活化的Toll样受体对人内皮（祖）细胞生物学功能的影响及其机制研究[D]. 杨梅. 中南大学. 2012
[8]. 从TLR4/NF-κB通路探讨芪药鸡金粥对化疗后大鼠胃肠道紧密连接蛋白的影响[D]. 陈婷玉. 福建中医药大学. 2017
[9]. TLR4/NF-κB信号通路在黄芪甲苷抑制异丙肾上腺素诱导心肌肥厚中的作用[D]. 杨娟. 辽宁医学院. 2014
[10]. 黄芪多糖对肿瘤坏死因子-α诱导的乳大鼠心肌细胞肥大和TLR4的影响[D]. 梁灵君. 辽宁医学院. 2013