1.三峡大学仁和医院药剂科；2.三峡食品药品检验检测中心药品所
摘要： 目的 建立测定清感口服液中绿原酸含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法：以DiamonsilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）为色谱柱, 乙腈-0.4%磷酸溶液（10：90）为流动相，流速1.0mL·min-1,检测波长为327nm，采用外标法定量。结果 绿原酸进样量在0.0393～0.982μg范围内与峰面积线性关系良好(r=0.9999)；平均回收率为98.2%，RSD为0.4%（n=9）。结论 本法操作简便、结果稳定、可靠，可用于该制剂的质量控制。
关键词：高效液相色普法；绿原酸；清感口服液
HPLC Determination of Chlorogenic acid in Qinggan Oral Solution
Bai Rong1；Qiu Haiyun2
1，The Ren He Hospital of Three Gorges University ；2，Three Gorges Center for Food and Drug Control；
(Three Gorges Center for Food and Drug Control,Hubei Yichang，443000)
Abstract: Objective To establish a HPLC method for determination of Chlorogenic acid in Hongjindan Lotion.Methods The Diamonsil C18 column(250mm×4.6mm,5μm)was used with Acetonitrile -Water (10:90) as the mobile phase.The flowrate was 1.0mL·min-1 and detecting wavelength was 327nm. Results The linear range was0.0393～0.982μg (r=0.9999).The average recovery rate was 98.2%， RSD=0.4%(n=9).Conclusion This method is simple, rapid and reliable, which could be used in quality control of this preparation.
Key words：HPLC；Chlorogenic acid；Qinggan Oral Solution
清感口服液是由石膏、麻黄、金银花、白花蛇舌草、炒牛蒡子、紫菀、款冬花、苦杏仁、山药、白茅根、紫苏叶、柴胡、重楼、大枣、甘草15味药组成的中药复方制剂。具有宣清退热，和卫解表。用于感冒发热，恶寒咳嗽，头痛鼻塞，流清涕。[1]该品种的质量标准仅有金银花的薄层色谱鉴别，为更好地控制药品质量，确保制剂疗效，笔者采用高效液相色谱法对清感口服液主要成分金银花中绿原酸的含量进行了测定，报道如下。
1 仪器和试药
Watres e2695 高效液相色谱仪；METTER—AE240电子分析天平。绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号为110753-200413）；乙腈为色谱纯；水为去离子双蒸馏水；其它试剂均为分析纯。清感口服液（湖北某学院附属医院，批号：140109、140308、140809）
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：DiamonsilC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10：90）；流速：1.0mL·min-1；检测波长：327nm；柱温：25℃。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取绿原酸对照品19.65mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理（功率300w，频率50kHz）15分钟，再用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液5ml，置100ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液，浓度为39.30μg/ml。
2.2.2供试品溶液 精密量取样品2ml，置25ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理（功率300w，频率50kHz）15分钟，再用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，放置，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性对照溶液 取除金银花外按处方量配制的阴性样品适量，精密称定，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
2.3 方法学考察
系统适用性试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液10μl进样，按上述色谱条件测定，色谱图见图1。绿原酸保留时间约为12.7分钟。供试品溶液色谱绿原酸峰与相邻干扰峰完全分离，分离度大于1.5。阴性对照溶液色谱中，在与对照品溶液色谱绿原酸峰相应保留时间附近无干扰峰检出。理论塔板数以绿原酸计算为14000。
线性关系考察
精密吸取上述对照品溶液1，5，10，15,20，25μl进样，按上述色谱条件测定。以测得的峰面积为纵坐标，绿原酸进样量（μg）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：Y=5231312X-61675 ，r=0.9999。结果表明绿原酸进样量在0.0393～0.982μg 范围内与峰面积线性关系良好。
精密度实验
精密量取上述对照品溶液10μl，重复进样6次，按上述色谱条件测定峰面积。峰面积平均值为3264858，RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
重复性实验
取同一批号的样品（批号140109）6份，按“2.2.2”项下方法制备，各精密吸取10μl进样，按上述色谱条件测定。结果，绿原酸含量分别为0.460、0.453、0.457、0.461、0.458、0.454（mg/ml），RSD为0.7%，表明本法重现性较好。
稳定性实验
取同一批号的样品（批号140109）的供试品溶液，在0，1，4，12，24，48，72h分别精密量取10μl进样，按上述色谱条件测定。结果，绿原酸峰面积的RSD为1.0%（n=7），表明供试品溶液在3天内基本稳定。
检测限与定量限
精密量取对照品溶液，用甲醇逐级稀释，按上述色谱条件测定，记录图谱。信噪比为3时，测得检测限为1.85ng；信噪比为10时，测得定量限为9.82ng。
回收率实验
精密量取2ml已知含量的样品9份（批号140109），分别精密加入对照品溶液液1.0ml、1.5ml、2.0ml各三份，再按样品测定项下方法配制成供试溶液50ml，分别进样10μl按上述色谱条件测定。计算回收率，结果见表1
2.4样品含量测定
精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以外标法计算即得。结果见表2
讨论
关于以高效液相色谱法测定中药复方制剂中绿原酸的含量，文献报道的方法较多[2，3,4]。为使样品中绿原酸峰与相邻色谱峰分离完全，选用甲醇-水系统为流动相，并加入少量的磷酸作为稳定剂。经多次试验，选择甲醇-0.4%磷酸溶液（10:90）为流动相时，峰形较好，保留时间适中，能使样品中绿原酸峰与相邻色谱峰达到基线分离。利用二极管阵列检测器，对绿原酸峰及供试品溶液色谱中与绿原酸相同保留时间峰进行扫描，结果均在327nm波长处有最大吸收，且经峰纯度检测为单一纯色谱峰，故确定检测波长为327nm。
试验还对样品提取方法和提取溶剂进行了比较，结果以50%甲醇为提取溶剂时，绿原酸的含量较高；超声处理与加热回流相比，结果非常相近，考虑到前者更简便、快捷，故选择超声提取15min。
参考文献：
[1]湖北省医疗机构制剂规范[S].
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010:205
[3] 刘 冰,王蓉华,徐永波.HPLC法同时测定银黄胶囊中绿原酸、黄芩苷含量[J].中国药事,2006,20(5)：303.
[4] 孟品佳,孙毓庆.高效液相色谱法分离金银花成份及测定绿原酸含量[J].药物分析杂志,1990,10(1)：58.
论文作者:白荣1，邱海蕴2
论文发表刊物:《中华急诊医学杂志》2016年6月
论文发表时间:2016/12/9
标签：溶液论文; 色谱论文; 精密论文; 甲醇论文; 样品论文; 含量论文; 批号论文; 《中华急诊医学杂志》2016年6月论文;