摘要：目的：为了解决灵敏度实验、促生长实验、无菌检查、培养基适用性检查及控制菌检查等实验过程中利用肉眼观察加入的菌液浓度所造成的误差。方法：采用麦氏比浊法和平板计数的方法进行菌液浓度的比对。结果：将菌悬液的麦氏浊度控制在0.17~0.34McF时，能够通过菌液稀释，控制菌液浓度在100cfu/ml左右。结论：该法使得在洁净区实验中能够简单快捷的判断细菌菌液浓度。
关键词：麦氏比浊法；细菌；菌悬液浓度
Study on Improving the Accuracy of Bacterial Suspension Counting by McFarland’s Turbidimeter
WU Min, MO Jingyan, SONG Renjie
Quality Inspection, Jiangsu Zilong Pharmaceutical Co., Ltd of Yangtze River Pharmaceutical Group, Changzhou, 213000
ABSTRACT Objective: To resolve the deviation caused by visual inspection of the bacterial suspension concentration in the process of sensitivity test, growth promotion test, aseptic test, suitability test of culture medium and bacteria control test. Methods: The bacterial suspension concentration was compared by means of McFarland’s turbidimetry and plate counting. Results：When the turbidity of microbial suspension is controlled at 0.17-0.34McF, the concentration of microbial suspension can be controlled at about 100cfu/ml by diluting the microbial suspension. Conclusion: This method makes it easy and fast to judge the concentration of bacterial suspension in the experiment of cleaning area.
KEY WORDS McFarland’s turbidimetry; bacterial; bacterial suspension concentration
在2015年版《中国药典》中“1100生物检查法”中的灵敏度实验、促生长实验、无菌检查、培养基适用性检查及控制菌检查等均有“加菌量不大于100cfu/ml”的要求。经调查行业了解，在实验过程中实验人员仅凭实验经验确定菌液稀释级别，不能很好的掌控加菌量，为使得实验人员在实验过程中对菌液浓度有个初步定量，故做此研究。
微生物生长中细胞数量的测定主要有直接计数法（测定时需用细菌计数器或血球计数板，本法仅适于单细胞的微生物类群）、比浊法、稀释平板计数法、液体稀释培养计数法、浓缩法[1]。
麦氏比浊法（McFarland）是一种简单而经典的细菌浓度计算方法，其核心原理是细菌溶于水中会造成与浓度相关的混浊度。麦氏比浊仪以McF（McFarland）麦氏浊度为单位，采用麦氏比浊法，测量微生物悬浮液中微生物菌体的光密度，并定量表征微生物菌体含量，直接显示麦氏单位浊度值，根据国际通用麦氏单位浊度值与细菌数的关系换算出细菌浓度[2]。
据文献报道，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌悬液的麦氏浊度与其吸光度存在良好的相关性；菌液吸光度与菌液浓度也存在良好的线性关系，利用这两个相关性，可以得到不同菌液浓度下的麦氏浊度值，也可以推测出具有不同麦氏浊度的菌液的菌液浓度[3]。
1材料
1.1仪器
1384-A2型生物安全柜（Thermo Scientific）；LRH-150型生化培养箱（上海索谱仪器有限公司）；XG1.G型脉动真空灭菌柜（山东新华医疗器械股份有限公司）；Densi CHEK Plus麦氏比浊仪（梅特勒托利多）；ZH-2型涡旋振荡器（天津天大天发有限公司）；移液器（BRAND）。
1.2菌种
金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC(B)26003]、大肠埃希菌
[Escherichia coli，CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[Bacillussubtilis，
CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[Pseudomonasaeruginosa，CMCC(B)10104]均购自中国食品药品检定研究院。
1.3药品与试剂
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（扬子江药业集团有限公司，批号：17090141）
1.4培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：1805082）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：180718）均购自北京三药科技开发公司；沙氏葡萄糖液体对照培养基（批号：135008-201503）购自中国食品药品检定研究院。
2方法
2.1菌种复苏
将储存在-20℃的冻干菌种管（大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）取出放冷至室温，用一无菌吸管吸取适量0.5~0.8ml的胰酪大豆胨液体培养基滴加到安瓿中，轻轻旋转安瓿并吹打，使冻干菌种和液体培养基充分混和并完全溶解，再将安瓿内的菌悬液全部吸出，转移至无菌试管中，最终体积为10ml，置于30~35℃条件下培养18~24小时即得。
2.2.菌种活化
取出复苏后的菌液培养物，混匀，用接种环挑取1环（大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）接种至胰酪大豆胨琼脂培养基斜面上，置于30~35℃条件下培养18~24小时即得。
2.3待测菌液的制备[4]
用接种环挑取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物1环接种至装有10ml胰酪大豆胨液体培养基试管中，置于30~35℃条件下培养18~24小时即得。
2.4制备适宜麦氏浊度的菌悬液
依据限度“加菌量不大于100cfu/ml”的要求及国际通用麦氏单位浊度值与细菌数的换算关系，最终选取0.17~0.34McF的浊度进行实验（相当于0.51×108~1.02×108cfu/ml的菌液浓度）以满足限度要求。
用移液器吸取1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的浓菌液至装有9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，并于涡旋振荡器上混匀，作为100管。吸取1ml 100管菌液于一次性悬浮液管中，置于麦氏比浊仪上慢慢转动试管。确保在显示读数之前进行了一次全程旋转。将此管稀释菌液制备成麦氏浊度在0.17~0.34McF之间，若浓度超出要求，则用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释，若浓度不足要求，则添加浓菌液，同时记录其最终麦氏浊度值。
2.5平板计数[5]
将上述制备好的菌液，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作10倍梯度稀释，在每一步的菌液稀释过程中，要求充分混匀菌悬液，以确保菌液的均一性。各吸取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌10-7浓度的菌液1ml至无菌空皿中，各平行制备3个平皿。吸取枯草芽孢杆菌10-5浓度的菌液1ml至无菌空皿中，平行制备3个平皿，同时分别吸取1ml空白稀释液加入3个无菌空皿内做空白对照。及时用15~20ml冷却至45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基倾注平皿，混匀凝固，置于30-35℃培养不超过3天。计数各平板的菌落数。
3结果
计数结果应结合方法适用性要求中加菌回收的范围要求（0.5~2.0）[6]，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌经过3次验证，结果比对如下：
而在枯草芽孢杆菌的验证过程中，可以发现，10-7的稀释浓度下计数结果均不能满足要求，但10-5的计数结果能够满足，结果如下表显示：
4讨论
4.1四次验证结果表明，将菌悬液的麦氏浊度控制在0.17~0.34McF时，能够通过菌液稀释，控制细菌菌液浓度在100cfu/ml左右。此法的缺点与吸光度法相同，即难以区分活细胞与死细胞以及与微生物类似的杂质[1]。另外，形状不规则的细菌，如验证的枯草芽孢杆菌，因其菌悬液浓度并不能代表细胞数量，故依据理论稀释至10-7的浓度进行计数，结果均不符合要求。但经过验证表明，10-5的浓度进行计数，均能满足50%~200%的要求。
4.2据文献报道[7]，平板计数法的优点在于菌液浓度准确，但其操作过程复杂，所需时间较长。麦氏比浊法的优点在于简便，用时短，但标准比浊管在使用中主观因素强，结果不够准确。验证结果表明，麦氏比浊法计数对比平板计数法计数结果偏低。相比于吸光度法检测细菌菌液浓度，此法虽没有前者相关性好，但不需制备标准曲线，更加实用于洁净区中的微生物实验。在微生物日常检测中，可以在实验加菌前利用麦氏比浊法对菌液浓度进行初步定量，并结合平板计数的方法来确证加入的含菌量。
4.3因此，采用麦氏比浊法进行细菌菌液的快速计数，对制药企业的药品微生物检验更加便捷、实用。
参考文献：
[1]马秀玲,陈蕊君,王飞,徐腾月.吸光度法快速确定菌悬液浓度及其适用范围[J].微生物学杂志,2014,(04):90-92.
[2]万滔.基于麦氏比浊原理的细菌浊度分析仪校准方法探讨[J].计量与测试技术,2018,(07):125-127.
[3]董自艳,戴翚,马仕洪等.紫外-可见分光光度法快速确定细菌菌液的浓度[J].中国药品标准,2014,15(2):120-121.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:1105、1106.
[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:1105.
[6]国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[S].北京:中国医药科技出版社,2015:1100.
[7]邹国发,邓祖军,陈秋如.基于固体培养基的金黄色葡萄球菌计数方法的相关性研究[J].广东药科大学学报,2017,(4):527-530.
论文作者:武敏，莫静燕，宋人杰
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第17期
论文发表时间:2019/11/4
标签：浓度论文; 浊度论文; 培养基论文; 细菌论文; 铜绿论文; 芽孢论文; 葡萄球菌论文; 《医师在线（学术版）》2019年第17期论文;