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摘要:目的：两种国产甲型肝炎病毒抗体（抗HAV-IgM）诊断试剂检测隐性甲肝患者血清结果的比较。方法：收获的HAV感染细胞悬液经冻融、超声、氯仿抽提, PEG浓缩离心后,将沉淀物用适量的NT缓冲液悬浮,蔗糖/甘油不连续密度梯度37000r/min 18℃ 6h离心,收取管底病毒样品进行病毒性状检测、蛋白含量检测、纯化病毒的蛋白带分析、抗原滴度检测。结果：快速法用于测定HAV- Ag滴度时,不论是用TMB作为显色底物,还是用OPD作为底物,滴度都明显低于常规过夜检测法,差别具有高度显著性(P<0.005)。结论：快速法用于检测甲肝减毒活疫苗感染性滴度时,因其与常规过夜法结果相似,且快捷方便,故可以作为常规检测甲肝减毒活疫苗感染性滴度的方法,以缩短检测时间；如果是甲肝灭活疫苗作抗原滴度定量检测或对HAV进行研究时,则建议用常规过夜法。
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关键词:甲型肝炎病毒；ELISA抗体诊断试剂盒；甲肝抗原标准品
Abstract: Objective: To compare the serum results of two domestic hepatitis A virus (anti-HAV-IgM) diagnostic reagents in patients with latent hepatitis A. Methods: The harvested HAV-infected cell suspension was centrifuged after freeze-thaw, ultrasonic and chloroform extraction. After centrifugation with PEG, the precipitate was suspended in an appropriate amount of NT buffer, sucrose / glycerol discontinuous density gradient of 37000r / min at 18 ℃ for 6h, The virus samples were collected for virus trait detection, protein content detection, protein analysis of purified virus, and antigen titer detection. RESULTS: When the rapid method was used to determine the HAV-Ag titer, the titers were significantly lower than those of the conventional overnight detection method, both with TMB as the chromogenic substrate and OPD as the substrate, and the difference was highly significant (P < 0.005). Conclusion: Rapid method can be used as a method to detect the infective titer of live attenuated hepatitis A vaccine in order to shorten the infection titer of live attenuated hepatitis A vaccine, which is similar to conventional overnight method and is quick and convenient. Detection time; if it is hepatitis A inactivated vaccine for antigen titer or HAV research, it is recommended to use conventional overnight method.
Key words: hepatitis A virus; ELISA antibody diagnostic kit; hepatitis A antigen standard
前言：本文经过探索,将HAV IgM-Ab诊断试剂盒改良后用于HAV- Ag检测。其原理为,在已包被抗人μ链的酶标板中,加入已知的HAV IgM-Ab阳性血清,由其吸附待检HAV-Ag,待检HAV-Ag再与酶标记甲肝抗体结合,经底物显色后,根据颜色判断是否含有HAV-Ag。由于HAV IgM-Ab诊断试剂盒主要应用在临床甲肝早期诊断,因本文专门制备了一批HAV-Ag标准品对试剂盒灵敏度作一定的调整,使试剂盒可以一盒两用。
1.资料和方法
1.1资料
由本所甲肝室提供。为H2株HAV在KMB17细胞中增殖培养4周后收获的感染细胞悬液。
1.2方法
收获的HAV感染细胞悬液经冻融、超声、氯仿抽提, PEG浓缩离心后,将沉淀物用适量的NT缓冲液悬浮,蔗糖/甘油不连续密度梯度37000r/min 18℃ 6h离心,
收取管底病毒样品进行病毒性状检测、蛋白含量检测、纯化病毒的蛋白带分析、抗原滴度检测。测得一个EU约相当于0.5ng的病毒蛋白。常规过夜检测法:按说明书操作,加HAV IgM- Ab阳性血清100μL/孔,40℃ 1小时，洗板，加待检抗原,室温过夜；洗板,加酶标记抗体100μL/孔,40℃ 2小时；洗板后分别用TMB和OPD显色。BIORAD- 450型酶标仪记录结果。快速检测法:加HAV- IgM阳性血清100μL/孔,40℃ 30min;洗板,同时加待检抗原50μL/孔,酶结合物50μL/孔, 40℃ 30min；洗板后分别用TMB和OPD显色。BIORAD- 450型酶标仪记录结果。甲肝减毒活疫苗样品10批,经10倍系列稀释后,分别选取3个合适的稀释度,接种已长成单层的人胚肺二倍体细胞(KMB17)。35℃培养24-26天,收取感染细胞,超声后用HAV-IgM-Ab诊断试剂进行抗原检测。
2.结果
把10份不同滴度的HAV样品,分别用抗原标准品校正过的酶标板与未经校正的酶标板同时进行抗原检测比较。配对t检验表明,两种酶标板检测结果有明显差异(0.05> P> 0.02),经过校正的酶标板要比未经过校正的酶标板检测灵敏度高。另取10份不同滴度的HAV样品,分别使用两种程序检测HAV- Ag滴度,结果表明:快速法用于测定HAV-Ag滴度时,不论是用TMB作为显色底物,还是用OPD作为底物,滴度都明显低于常规过夜检测法,差别具有高度显著性(P<0.005)。在相同的检测程序中, TMB显色系统比OPD显色系统灵敏度高(P<0.02)。快速法用于检测甲肝减毒活疫苗感染性滴度时,快速稳定,结果与常规过夜检测法相一致,可以作为一种快速检测感染性滴度的选择(P<0.2)。
3.讨论
当试剂盒用于检测抗体时,用甲肝抗体标准品对试剂盒进行质控。如果试剂盒用于检测HAV-Ag,则用HAV-Ag标准品对试剂盒进行校正,经过校正的HAV IgM-Ab诊断试剂盒酶标板,可以用来检测HAV-Ag,灵敏度明显高于未经抗原标准品校正的酶标板。此法的关键在于抗原标准品的建立,抗原样品须经病毒性状检测、蛋白含量检测、纯度检测,均需符合标准,并经多人多次反复检测抗原滴度稳定,方可作为标准品使用,对酶标板进行校正。速法用于检测甲肝减毒活疫苗感染性滴度时,因其与常规过夜法结果相似,且快捷方便,故可以作为常规检测甲肝减毒活疫苗感染性滴度的方法,以缩短检测时间；如果是甲肝灭活疫苗作抗原滴度定量检测或对HAV进行研究时,则建议用常规过夜法。
参考文献:
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论文作者:冯贞玉
论文发表刊物:《世界复合医学》2017年第5期
论文发表时间:2017/9/4
标签：甲肝论文; 抗原论文; 显色论文; 疫苗论文; 感染性论文; 常规论文; 病毒论文; 《世界复合医学》2017年第5期论文;