武汉市黄陂区中医医院 430300
【摘要】目的 建立人工合成柴胡皂苷a的方法，为其进一步的研究奠定基础。方法 通过高碘酸钠法合成SSa-BSA和SSa-PLL，利用薄层色谱法鉴定抗原是否合成成功，ELISA法鉴别抗原是否有免疫原性。结果 经薄层色谱鉴定，SSa抗原合成成功，ELISA法测得合成的人工SSa抗原效价达1:80000。结论 高碘酸钠法合成SSa人工抗原，操作简单，利用合成的抗原可用于进一步建立免疫分析方法。
【关键词】柴胡皂苷 抗原合成 免疫原性
【Abstract】 Objective Synthetic Saikosaponin establish a method for the further research foundation. The method of synthesis by sodium periodate SSa-BSA and SSa-PLL, the use of thin-layer chromatography to identify whether the synthetic antigen success, ELISA Antigen Identification of whether the immunogenicity.Results identified by TLC, SSa antigen synthesis success, measured by ELISA was synthesized artificial SSa antigen titer of 1: 80,000. Conclusion Synthesis of sodium periodate SSa artificial antigen, simple operation, the use of synthetic antigens can be used for further development of immunoassay methods.
【Key words 】Saikosaponin immunogenic antigen synthesis
中药柴胡活性最强的成分为柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，药理活性研究表明，柴胡皂苷a（SSa）具有解热、抗病毒、抗内毒素、抗炎、保肝、免疫调节及抗肿瘤等作用[1]。目前对柴胡皂苷a的定量方法主要有紫外分光光度法、薄层色谱法及高效液相法[2]。近年来，随着生物技术的发展，免疫分析的方法逐渐应用于中药活性成分的研究，本实验建立了SSa的免疫分析方法，合成了柴胡皂苷a人工抗原并对其进行了免疫原性的鉴定。
1实验材料
1.1试剂与仪器
柴胡皂苷a，南京泽郎公司提供；牛血清蛋白、多聚赖氨酸由美国Roche公司提供；甲醇、乙酸乙酯为分析纯，由北京化工厂提供；试验用96孔酶标板由美国康宁公司提供；硅胶G板由青岛海洋分工厂分厂提供；DU800紫外可见分光光度计厂家为德国Beckman公司。
1.2动物
SPF级Balb/c小鼠12只由维通利华实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK-(京)2007-004，动物合格证号为NO.0029729
2实验方法
2.1柴胡皂苷a人工抗原的合成
本实验采用高碘酸钠法[3]合成柴胡皂苷a人工抗原，精密称量10.0mg柴胡皂苷a于烧杯中，加入1ml甲醇使其充分溶解；5.0mg高碘酸钠充分溶解于1ml的蒸馏水中，倒入装有柴胡皂苷的烧杯中，放入磁力搅拌器的转子后密封烧杯，在包裹锡纸避光，在室温下搅拌反应1h后，得到SSa的氧化产物，为A液。准确称量牛血清白蛋白（BSA）、多聚赖氨酸（PLL）各10.0mg，分别充分溶解于1ml的0.05mol/L pH为9.6的碳酸盐缓冲液（CBS），称为B液。用1mol/L的Na2CO3溶液将A液pH调至9.6后缓缓加至B液中，在密封避光条件下室温搅拌反应6h。得到的反应液转移至用蒸馏水预处理的透析袋中，透析3天，期间多次换液。得到的透析产物分装后，置于-20℃保存。
2.2柴胡皂苷a人工抗原及免疫原性的鉴定
2.2.1薄层色谱法
用甲醇配制适宜浓度的SSa标准溶液，用蒸馏水配制适宜浓度的BSA、PLL标准溶液，将待测样品SSa-BSA及SSa-PLL用蒸馏水稀释到适宜浓度，将标准溶液与待测样品分别点同一硅胶G薄层板上，用乙酸乙酯-甲醇-水（8:2:1）为展开剂[4]进行展开，展开后晾干，用10%硫酸-乙醇溶液显色。
2.2.2动物免疫
饲养9周的BALB/c小鼠12只，随机选取3只不免疫，其余9只随机分为3组，用SSa-BSA免疫，具体方法如下：初次免疫，免疫剂量100μg/只，将乳化好的抗原进行背部皮下多点注射（0.1ml/只）；两周后进行加强免疫，背部皮下多点注射，0.1ml/只；此后每两周按上述方法加强免疫一次，第9周断尾取血，血液在37℃下放置30min，4℃3000rpm，离心10min，取上清-20℃保存待用。
2.2.3 ELISA法测定血清中的抗体效价
以柴胡皂苷a-PLL为包被原，用CBS稀释至1:8000在96孔酶标板中加入100μl/孔，37℃孵育2h，PBS洗板4次，每次5min，拍干；用10mg/ml明胶封闭，200μl/孔，37℃孵育2h，洗板；将2.2.2步骤中获得的血清及阴性血清用PBS分别稀释至1000、2000、4000、8000、10000、20000、40000、80000倍，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板；将HRP-羊抗鼠二抗稀释10000倍，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板拍干后加入LTMB显色液100μl/孔，在37℃下孵化15min；最后加入2mmol/L硫酸 50μl/孔，置于450nm测定吸光度，
3结果
3.1 SSa、BSA、SSa-BSA TLC结果
BSA和PLL为大分子物质，展开后Rf值为0，仍在原点位置，且无显色反应，而SSa展开后在Rf值为0.45的地方出现淡紫色斑点，SSa-BSA和SSa-PLL在原点处显淡紫色斑点，说明SSa与BSA偶联成功。
3.2 ELISA法测定血清中的抗体效价
以450nm血清样品吸光度与阴性样品吸光度的比值大于2.1[5]，则为阳性，效价为最大稀释倍数的倒数，由表1可知3组免疫小鼠的血清中均产生了抗体，其效价为1:80000
3 讨论
中药历史悠久，活性成分复杂，药理活性多样，传统检测中药中活性成分的方法主要有薄层色谱法，高效液相法。但是中药活性成分复杂且受到化合物结构的局限性，如在紫外下吸收不明显，对显色剂不敏感，利用传统的方法对中药活性成分鉴别及定性时会造成分析不准确。利用小分子活性成分与大分子物质合成抗体，能特异性鉴别出中药中的活性成分，操作简便，提高了准确度与精确度。
合成人工抗体的方法有很多，主要有高碘酸钠法、碳二亚胺法、混合酸酐法、重氮化法、活泼酯法、戊二醛法等[6]，一般根据小分子活性物质的性质及结构选择合适的合成方法，本实验采用高碘酸钠法，实验过程条件温和，不需要有机试剂，反应体系对pH要求较低，操作简单。
目前抗原的免疫原性鉴定方法主要有：紫外分光光度法、薄层色谱法、电泳法、质谱法、同位素示踪法[7]。本实验采用薄层色谱法判断SSa与BSA偶联情况，成本低廉，操作简单，样品使用量较小，快速准确判断偶联情况；此外，利用ELISA法测定抗血清效价，结果准确，比较P/N值，得出SSa人工合成抗原效价达1:80000。
随着生物技术的发展，对小分子活性成分的免疫分析越来越受到关注，本次研究成功制备SSa人工抗原，为其他小分子活性成分的进一步研究奠定了基础。
参考文献
[1]张越. 甘草酸、柚皮苷单克隆抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立[D].北京中医药大学,2013.
[2]刘洋. 柴胡皂苷a人工抗原合成及其单克隆抗体的制备[D].北京中医药大学,2013.
[3]冯会宾,赵琰,赵灵灵,单文超,赵妍,张越,王庆国,屈会化. 柴胡皂苷a人工抗原的合成及免疫原性鉴定[J]. 北京中医药大学学报,2015,38(02):126-129+144.
[4]赛佳洋. 人参皂苷Re单克隆抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立[D].北京中医药大学,2014.
[5]王艳. 人参皂苷Rh1/Rg2单克隆抗体的制备及酶联免疫吸附分析方法的建立[D].北京中医药大学,2014.
[6]赛佳洋,屈会化,冯会宾,孔慧,王艳,王雪茜,赵琰,王庆国. 人参皂苷Re人工抗原的合成及单克隆细胞株的筛选[J]. 中国药学杂志,2014,49(13):1104-1108.
[7]张越,屈会化,吴婷婷,薛瑾,孙晔,孙慧,李翼飞,赵琰,王庆国. 甘草酸单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 药物分析杂志,2013,33(05):770-774.
论文作者:陈玉玲
论文发表刊物:《中华急诊医学杂志》2016年6月
论文发表时间:2016/12/9
标签：柴胡论文; 抗原论文; 免疫论文; 皂苷论文; 活性论文; 薄层论文; 方法论文; 《中华急诊医学杂志》2016年6月论文;