摘要：建立了硫代巴比妥酸-分光光度法测定植物中丙二醛（MDA）的分析方法，该方法检出限在0.0004μmol/g，测定下限为0.0016μmol/g，方法回收率在94%～104%之间，精密度（n=6）为2.7%～5.2%，准确度为3.8%。该方法简便快速，灵敏可靠，适用于植物中丙二醛（MDA）分析。
关键词：丙二醛；硫代巴比妥酸；分光光度法
引言
丙二醛(MDA)是植物在酸性或高温条件下膜脂过氧化的产物，可通过丙二醛含量变化了解膜脂过氧化程度，以间接掌握植物膜系统的受损程度。目前MDA,测定方法主要有分光光度法[1]、荧光法[2]、HPLC法[3]、GC-MS法[4]、试剂盒法。荧光法由于萃取溶剂不同或按照原文献方法无混匀器使萃取不完全而造成结果不准确[5]；因此，考虑到硫代巴比妥酸法实验方法简单，无特殊实验条件要求，显色反应迅速，干扰物质少，灵敏度高，可以测定微克级的丙二醛含量，因此，本文采用以硫代巴比妥酸分光光度法测定植物中丙二醛含量。
1 实验部分
1.1 方法原理
在酸性和高温（温度高于80℃）条件下，丙二醛与硫代巴比妥酸反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），根据朗伯-比尔定律和双组份分光光度法，丙二醛的含量由波长分别为450 nm、532 nm、600 nm处的吸光度A450、A532、A600进行计算，其结果为丙二醛含量。
1.2 试剂与仪器
1,1,3,3-四乙氧基丙烷（E.Mesck 97%），三氯乙酸（C2HCl3O2），硫代巴比妥酸（C4H4N2O2S），实验用水为二次蒸馏水。紫外分光光度计，台式离心机，分析天平，水浴锅，研钵，剪刀，石英砂等。
1.3 溶液配制
将1,1,3,3-四乙氧基丙烷（E.Mesck 97%）逐级稀释得到浓度分别为100.00、10.00、0.10μg/mL的丙二醛标准溶液，贮存于棕色瓶中，置于冰箱中4℃冷藏；配制10%三氯乙酸（C2HCl3O2）及0.5%硫代巴比妥酸（C4H4N2O2S）。
1.4 样品提取
将植物样品洗净晾干后，剪成小段，称取0.5000g，加入2 mL10%三氯乙酸溶液和石英砂在研钵中研磨成匀浆后，加入8 mL10%三氯乙酸溶液进一步研磨，研磨后所得匀浆以3000 r/min的转速离心10min，上清液为提取液。
1.5 样品测定
吸取3.00 mL样品提取液于10 mL比色管中，加入3mL0.5%硫代巴比妥酸溶液，混合后于沸水浴中10 min，冷却后，取混合液于10 mm比色皿中，于波长450 nm、532 nm、600 nm处测量吸光度。用水代替样品，按与样品测定相同的步骤进行测定，空白与样品同时测定。
1.6 实验条件
在酸性和高温（温度高于80℃）条件下，丙二醛与硫代巴比妥酸产生显色反应，成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。
2 结果
2.1 双组分方程
测定植物组织中丙二醛含量时受多种物质的干扰，其中主要的是可溶性糖和背景吸收。蔗糖与硫代巴比妥酸反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10-3；丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物最大吸收波长在532nm，蔗糖毫摩尔吸收系数为7.4×10-3，丙二醛毫摩尔吸收系数155×10-3；532nm存在非特异性背景吸光值可以用600nm波长处的吸光值代表。
根据朗伯--比尔定律，当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度k成正比，即A＝Kc，可得：
A450=85.410-3C1 (1)
A532-A600=15510-3C+7.410-3C1 (2)
式中：85.4×10-3—蔗糖在波长450nm下的毫摩尔吸收系数；
7.4×10-3—蔗糖在波长532nm下的毫摩尔吸收系数；
155×10-3—丙二醛在波长532nm下的毫摩尔吸收系数；
A450—在波长450nm下测得的吸光度值；
A532—在波长532nm下测得的吸光度值；
A600—在波长600nm下测得的吸光度值；
C1—反应混合液中蔗糖浓度，μmol/L；
C—反应混合液中丙二醛浓度，μmol/L。
按照双组分分光光度法原理，由公式（1）和（2）联立方程式求解后，可得C。
C=6.45(A532-A600)-0.56A450 (3)
式中：6.45—在波长532nm处吸光值校正系数；
0.56—在波长450nm处吸光值校正系数；
其他参数—见公式（2）
样品中丙二醛的含量(μmol/g)按公式(4)计算:
(4)
式中：A450—在波长450nm下测得的吸光度值；
A532—在波长532nm下测得的吸光度值；
A600—在波长600nm下测得的吸光度值；
V—提取液总体积，mL；
W—样品鲜重，g；
6.45—在波长532nm处吸光值校正系数；
0.56—在波长450nm处吸光值校正系数。
2.2 方法特性指标确定
2.2.1 检出限
用水代替样品，按照样品测定步骤，测定21次空白试验，得出方法检出限0.0004μmol/g，测定下限0.0016μmol/g。
2.2.2 精密度
测定南瓜、红薯、水稻三种植物样品的丙二醛含量，相对标准偏差（n=6）分别为4.2%、5.2%、2.7%。
2.2.3 准确度
测定0.10μg/ml丙二醛标准溶液，准确度（n=5）为3.8%；将0.3μg的丙二醛标准液加入到9个实际样品中，回收率在94%～104%。
3 讨论
本文将被测样品和硫代巴比妥酸呈色以后的红棕色络合物在2h内稳定，当光线直接照射可使颜色逐渐减退，因此，在实验过程中应尽量在避光条件下进行实验分析；另外硫代巴比妥酸的配制中难溶解，导致测定结果偏低，配制时可加热使其溶解。因此，利用双组分光度法消除蔗糖和背景值干扰，该方法适用于植物丙二醛测定，结果令人满意。
参考文献
[1]刘仲奇，胡永芳.脂质过氧化产物-丙二醛的简便测定[J].甘肃中医学院学报，2001;18(3):13-5.
[2]Wojciech W，Jean N，Anne P.Optimized steps in fluorometricdetermina- tion of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of ext raction pH and influence of sample preservation and storage[M].Clin Chem，1993;39(12):2522-6.
[3]蒋小华，谢运昌，李 娟，等.柱前衍生化反相高效液相色谱测定大鼠血浆中的丙二醛[J].光谱实验室，2013;30( 2):790-4.
[4]Fitzmaurice PS，Tong J，Yazdanpanah M,et al.Level of 4-hydroxynone-nal and malondialdehyde are increased in brain of human chronic users of methamphetamine[J].Pharmacol Exp Ther，2006;319(2):703-9.
[5]张建新.荧光法测定血清脂质过氧化物的最佳反应条件[J].中华预防医学杂志,1998,32(1):40- 42.
论文作者:高长生
论文发表刊物:《知识-力量》2019年10月44期
论文发表时间:2019/9/27
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