孙光忠
（崇州市疾病预防控制中心；四川崇州611230）
【摘要】目的：探讨核酸检验与酶联免疫检测血液病毒的应用及检验准确率。方法：选取26581例无偿献血者，采集样本分别采用核酸检验与酶联免疫检测，观察两组检测方法的准确性。结果：核酸检验法的阳性准确率明显高于酶联免疫法，组间对比具有明显统计学意义（P<0.05）。结论：核酸检验与酶联免疫检测血液病毒均具有较高应用价值，因核酸检验结果更具有优势而得到应用推广，但其价格高等因素导致其推广应用存在一定局限性。
【关键词】核酸检验；酶联免疫检测；血液病毒；准确率
Analysis of the application of nucleic acid test and enzyme-linked immunoassay for the detection of blood virus and the accuracy of test
[Abstract] Objective: To investigate the application of nucleic acid test and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of blood virus. Method：26581 cases of free blood donation were selected, and the samples were tested by nucleic acid test and enzyme linked immunosorbent assay to observe the accuracy of the two groups. Result：The positive rate of nucleic acid test was significantly higher than that of ELISA, and the comparison between the groups had significant statistical significance (P<0.05). Conclusion: Nucleic acid test and enzyme-linked immunosorbent assay (RNA) for detecting blood viruses are of high application value. Because nucleic acid test results have more advantages, they have been applied and promoted, but their high price factors lead to their limitations.
[Key words] Nucleic acid test; enzyme-linked immunosorbent assay; blood virus; accuracy
输血极有可能会导Nucleic acid test; enzyme-linked immunosorbent assay; blood virus; accuracy致艾滋病病毒、肝炎病毒等的传播，因此应在输血前加强血液抗体检测或抗原检测，便于有效控制疾病传染[1]。目前，酶联免疫法（ELISA）是检测血液病毒比较常用的一种方法，但此方法具有较为显著的局限性，会因检测仪器、环境等而受到较大影响[2]。近些年来，我中心和采供血机构开始使用核酸检验法（NAT）对血液病毒予以检测，具有较高的检出率。本文选取26581份血液样本，探讨核酸检验与酶联免疫检测血液病毒的应用及检验准确率，现报道如下。
1资料与方法
.1一般资料
本文选取26581例无偿献血者，年龄18-63岁，平均年龄为（26.39±3.58）岁。均经健康咨询，依据卫生部《献血者健康检查标准》均体检合格，均经乙肝表面抗原金标试纸条对其进行快速筛查，HBsAg显示为阴性，经ALT试纸条筛查显示ALT<40U／L，采用硫酸铜比重法对血红蛋白进行检测，显示筛查血液样本均符合要求，将其送至血液中心，经初检、复检HBsAg，抗-HCV、抗-HIV、梅毒均检测合格，然后对此样本予以核酸检验与酶联免疫检测。
1.2方法
对同一个献血者的血液样本需应用5ml、7ml真空抗凝试管分别采集，且置于2℃-8℃环境内保存待测。7ml血液样本通过酶联免疫法予以检测，5ml血液样本通过核酸检验法予以检测。检测均在血液样本采集后72h内完成。
酶联免疫法：室温23℃~29℃，整个检测步骤均应按照说明书严格操作。将血液样本予以血浆分离，通过加样机予以自动加样，血液样本通过自动酶免分析仪完成分析，且将结果进行仔细记录，为了确保检测结果准确，应将血液样本予以二次检测确诊。诊断标准：当分析仪出现波长A值≥1时可记为阴性，当A值＜1可记为阳性。
核酸检验法：室温23℃~29℃，将5ml血液样予以离心处理20min，对血液样本进行血常规检查，如无异常则将其置于加样仪样品的条架上，选取一级分配试剂方法，放置100μlA、B洗液、100μl洗脱液至B号96孔深孔培养板内，将50μl磁珠、600μl结合液置于A号96孔深孔培养板内。将血液样品予以裂解，在成功裂解后通过三级核酸提取法将核酸有效提取，核酸提取仪通过B号96孔深孔板、A号96孔深孔板完成核酸的有效提取，且并配置扩增核酸的反应液。根据标本量通过四级核酸扩增程序将提取后核酸结合液置于八联管内，且将八联管置于PCR仪内进行扩增，仔细记录结果，将阳性汇集孔标本予以拆分实验，明确阳性标本。
1.3观察指标
研究将病毒分离检测结果作为金标准，对核酸检验与酶联免疫检测血液病毒的准确性予以评估。
1.4统计学方法
数据均采用SPSS20.0系统软件予以处理分析，计数资料采用x2实施结果检验，计量资料采用t实施结果检验，P<0.05说明差异具有明显统计学意义。
2结果
经病毒分离可知，26581份样本中，含有病毒的血液样本为132例。经核酸检验，呈现阳性的样本为132例，与病毒分离进行对比，准确率为100.00%。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆酶联免疫法检测呈现阳性的样本为119例，漏检13例，准确率为90.15%，漏检率为9.85%。两组血液病毒阳性检测的准确率对比具有明显统计学意义（x2=16.281，P<0.05）
3讨论
目前，对病毒标记物进行检测时，通常是对病毒抗原、抗体进行检测，自病毒进入机体到可以检测到病毒抗原或是抗体，期间所持续的时间段称作病毒感染的“窗口期”。目前，在对血液检测时采用的血清学检测技术需要较长“窗口期”，处于“窗口期”的血液病毒在进行检测时，结果均显示为阴性，但在此时血液内已含有病毒，且具备一定复制力，因此，如何减少病毒检测“窗口期”，如何对血液病毒进行更为快速有效的检测，是一个重要的研究方向[3]。
确定献血者血液内是否存在病毒，可确保血液使用的安全性，避免血液病毒因血液使用进行大范围传播，且利于及时确诊血液病毒患者，使之能够得到及早治疗。多年以来，我国通常以酶联免疫法进行血液的检测，但此检测方法存在一定的局限性，并无较高的筛检阳性率，往往会发生漏检情况，导致血液病检查出现不安全隐患。虽然酶联免疫法检测技术在灵敏度、特异性方面得到显著提高，且逐渐改进，但依然有一些病人因输血而出现肝炎等疾病。ELLSA检测法在使用时，主要检测血液病毒抗原，若患者体内出现血液病毒，通过酶联分析仪检测时会有波长改变的情况，可依据波长改变情况来确定患者是否出现血液病毒。但并非血液病毒一进入人体后就能够将病毒抗体检测出来，在病毒侵入机体后，通常需要较长时间后方可检测出血液病毒抗体，而此时间则称作“窗口期”，采用ELLSA检测法时，在窗口期，对于病毒检测并无较高的敏感性[4]。特别是艾滋病毒，由于其在人体具有较长潜伏期，采用ELLSA检测法一般难以将其检出。而且ELLSA法在检测变异血液病毒时也具有较低的敏感性。标本采集、反应温度、孵育时间、洗板次数、显色剂等均有可能导致检测结果出现偏差。导致输血残余危险性发生的主要因素包括：病毒感染者在“窗口期”献血、病毒变异、免疫静默感染、人工操作错误等。由于EILSA检测需要较长“窗口期”，所以“窗口期”漏检对于血液安全性具有较为不利的影响。可见，单纯采用ELISA检测难以完全保证血液的安全性[5]。
NAT检测是直接对病原体核酸进行检测，原理为：经化学、生物学等方法，使得目的核酸片段得到直接扩增或是扩增其相关信号，使得极微量核酸片段形成可视光电信号，由此可判断标本内是否具有相应病原体。此技术在病毒感染后数天就能够检测到病原体，可明显减少病原体检测“窗口期”。在血液筛查时，使用的NAT检测技术一般为：聚合酶链反应（PCR)、转录介导的扩增技术(TMA) [6]。聚合酶链反应技术基本原理与于DNA天然复制过程较为相似，特异性主要依赖和靶序列两端进行互补的寡核苷酸引物，采用变性、退火、延伸的基本反应步骤使得微量DNA得到显著提高。此反应可达到较高特异性、灵敏度，而且纯度要求较低，操作较为简便快捷，此方法的优势较为显著。临床检测时，通常会选荧光定量聚合酶链反应，通常对各类型传染病予以诊断，且可监测病毒滴度，对临床效果进行有效评估，由于是通过荧光标记的探针杂交或是直接使用可与双链DNA进行结合的荧光素对PCR扩增产物进行有效检测，可使检测的敏感性、特异性明显增加。将已知浓度的内标或是外标加入，则可对其予以定量检测。由于该方法实现了反应体系的全封闭和操作的全自动，与其他PCR方法相比有污染小、效率高等特点，故在血液筛查中也较为常用[7]。采用TMA技术进行检测时，需经应用特异性目标捕获法使得病毒核酸(RNA或DNA)自样本中进行分离，之后采用转录介导的核酸扩增法使得目标核酸片断得到有效扩增，再通过杂交保护检测技术对扩增子进行检测。而且NAT实验室检测系统对于要素、过程控制均具有严格要求，对比ELISA血液筛查系统其要求更加严格。在人员方面，核酸实验室工作的技术人员均需得到严格技术培训，需对自身的工作内容、工作范畴有充分的了解，且熟练掌握相关技术；开展核酸检验的工作人员应持有核酸检测技术的培训合格证；需建立操作人员能力评估机制，应至少每年进行一次评估，且应与技术人员的培训计划均进行有效结合。应注意对检测系统进行有效维护、故障处理、校准等，确保检测系统可顺利运行。NAT检测涉及到的试剂、耗材等均需进行严格质量管理，确定其能够满足NAT检测要求。NAT实验室内应确保操作人员的身体健康，且保证实验结果具有较高的可靠性，应建立合格的生物安全防护设施，有效预防病毒蔓延[8]。
经研究可知，核酸检验阳性准确率为100.00%，显著高于酶联免疫法阳性准确率90.15%，组间对比具有明显统计学意义（P<0.05）。由此可知，核酸检验方法在对血液病毒检测时，与酶联免疫法相比较具有更高的准确率。主要是因为核酸检验主要是对病原体核酸予以检测，而且“窗口期”短，在一定程度上增加了检测结果的准确性。
总之，核酸检验与酶联免疫检测血液病毒均具有较高的应用价值，但是核酸检验技术具有更高的准确性，因此更具有应用价值。但是，因此方法仪器、试剂均需较高费用，且对于操作人员技术水平具有较高要求，导致其推广应用受到一定限制。而且核酸检验的病毒检出率具有一定差异性，通常认为与献血人群差异具有一定关系，且与NAT检测法、试剂具有一定相关性，尤其传统PCR扩增电泳技术是开放式的，极易发生交叉污染，导致假阳性，因此还需进一步研究。
参考文献
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论文作者:孙光忠
论文发表刊物:《医师在线》2018年6月下第12期
论文发表时间:2018/9/27
标签：核酸论文; 血液论文; 病毒论文; 样本论文; 免疫论文; 阳性论文; 较高论文; 《医师在线》2018年6月下第12期论文;