陶醉[1]2014年在《大鼠视网膜色素变性对视网膜内层神经元和胶质细胞影响的研究》文中进行了进一步梳理在脊椎动物中,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞位于视网膜神经层和脉络膜之间,呈不规则多边形,单层紧密排列,其尖端微绒毛与感光细胞的光敏感外节广泛连接,使信息在RPE细胞和感光细胞之间有效传递。RPE细胞能与感光细胞交换视色素,吞噬感光细胞的代谢产物,并且为感光细胞运输营养物质。因此,RPE细胞在视网膜功能中起到重要作用,其细胞结构完整性的破坏是导致许多视网膜疾病的病理基础。如我国常见的致盲性疾病视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)和老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)其发病的起始原因就是RPE细胞功能缺陷。还有其他一些疾病也认为与RPE变性有关,如Stargardt病、视网膜营养性不良和色素性视网膜炎。这些疾病目前尚无有效的治疗方法。以往对此类RPE变性类疾病动物模型特别是急性损伤模型的研究大都集中在视网膜色素上皮细胞和感光细胞,对内层神经元细胞的观察却鲜有报道。我们必须意识到视网膜内层神经元的完整性对治疗RPE变性类疾病的重要性,如视网膜移植和视网膜假体治疗,只有足够健康的内层视网膜存在,视觉信号才能从修复的外核层传入视网膜内,若内层视网膜功能缺失,视功能是不能有效恢复的。因此,RPE变性类疾病中视网膜内层神经元的形态和功能究竟发生了什么改变,这些改变是由病变因素直接引起的还是继发于RPE细胞和感光细胞变性的表现,其分子机制是什么,都是需要阐明的问题。此外,M(?)ller细胞作为视网膜中主要的神经胶质细胞,具有重要的生理功能,如结构支持、调节渗透压平衡、参与神经元细胞营养运输和代谢,以及调节血--视网膜屏障等作用。近年来研究表明,M(?)ller细胞在形态和功能上都具有视网膜前体细胞特性,被认为是一种视网膜内源性干细胞。在某些低等脊椎动物中,在特定条件刺激下M(?)ller细胞能逆分化为视网膜前体细胞和重新进入细胞周期,并转分化为视网膜神经元,使损伤的视网膜完全修复。但在哺乳动物中,要在视网膜损伤后激活M(?)ller细胞逆分化增殖异常困难,获得逆分化M(?)ller细胞的数量也是很有限的,之后M(?)ller细胞很快在视网膜下腔形成胶质瘢痕,加快了病变发展。那么在RPE变性类疾病中,M(?)ller细胞是否也具有视网膜前体细胞特性,其分子机制是什么,怎样阻止M(?)ller细胞胶质化,启动M(?)ller细胞逆分化为视网膜前体细胞,并且转分化为神经元细胞以修复受损的视网膜,是我们想探索的问题。基于上述研究现状,本研究采用急性视网膜色素变性模型：碘酸钠(NaIO3)诱导视网膜损伤模型,和慢性视网膜色素变性模型：皇家外科学院大鼠(Royal college of surgeonrat, RCS),探讨大鼠急性视网膜色素变性过程中内层神经元的变化及其分子机制和慢性视网膜色素变性过程中M(?)ller细胞的变化及其逆分化分子机制。主要研究结果如下：一、大鼠急性视网膜色素变性对内层神经元细胞影响的研究。我们发现在模型建立早期阶段视网膜内层神经元就可以被NaIO3损伤并且其形态也会发生明显的改变,多巴能无长突细胞(dopaminergic amacrine cells, DA-ACs)、水平细胞、表达视黑素的视网膜神经节细胞(melanopsin-expressing retinal ganglion cells, mRGCs)的树突野均减小。与此同时,NaIO3也对中脑多巴能神经元最丰富的区域腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)和黑质致密部(Substantia Nigra Pars Compacta, SNpc)造成损害,间接说明视网膜中DA-ACs的损伤是也存在直接性机制。此外,我们发现注射NaIO3之后,被认为在中脑多巴能神经元特异性表达的mir-133b在视网膜DA-ACs中表达明显上调。过表达的mir-133b抑制了一个重要的转录因子pitx3的表达,并导致视网膜多巴能系统一系列的缺失,如下调酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)、D2受体的表达和多巴胺(Dopamine, DA)的生产,这可能是DA-ACs、水平细胞和mRGCs出现病理学表现的主要原因。当mir-133b受到mir-133b/RNAi的干扰后,上述这些缺失减少了,DA-ACs和1mRGCs树突野也有所恢复,而且视网膜电图(Electroretinogram, ERG)的b波平均幅值和OPs波总幅值也明显提高,提示视功能得到一定改善。二、大鼠慢性视网膜色素变性对M(?)ller细胞的影响及其逆分化机制的研究。我们观察到在RCS大鼠视网膜变性早期,M(?)ller细胞可短暂表达视网膜前体细胞标志蛋白,但很快获得胶质命运,加重了视网膜的病变发展。初步研究表明let-7家族分子let-7e和let-7i在病变视网膜中显着高表达。let-7家族转录后调控是由RNA结合蛋白Lin28B调控,研究进一步证实了Lin28B而非Lin28A在这个过程中下调,Lin28B下调是导致let-7e和let-7i高表达的重要因素。Lin28B在体内或体外异位表达都会抑制let-7e和let-7i的高表达,从而动员M(?)ller细胞逆分化、增殖,促进逆分化M(?)ller细胞的神经元命运,抑制胶质命运。ERG检测表明a波和b波都有所恢复。我们的数据第一次证明在RCS大鼠视网膜病变模型中下调Lin28B同时上调let-7e和let-7i可能是影响视网膜再生修复的重要原因。综上所述,我们得出以下结论：一、NaIO3诱导大鼠急性视网膜色素变性过程中,视网膜内层各种神经元细胞受到不同程度损害,这种损害不仅源于感光细胞输入信息的丢失,也受病变因素的直接影响。二、NaIO3诱导大鼠急性视网膜色素变性过程中,DA-ACs的形态和功能受到严重影响,进而导致mRGCs继发性损害。叁、NaIO3诱导大鼠急性视网膜色素变性过程中,miR-133b过表达并下调其下游转录因子pitx3的表达水平是造成DA-ACs和mRGCs损伤的重要原因。四、RCS大鼠视网膜中M(?)ller细胞在病变早期具有视网膜前体细胞特性,但随着病情发展,很快形成胶质瘢痕,加速视网膜病变进程。五、RCS大鼠视网膜中Lin28B表达下调,同时let-7e和let-7i表达上调是影响M(?)ller细胞逆分化为视网膜前体细胞的重要机制。六、RCS大鼠视网膜中过表达Lin28b可以阻止逆分化M(?)ller细胞的胶质化,并诱导其向感光细胞分化。
刘东宁[2]2007年在《大鼠骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞诱导分化和体内移植研究》文中提出视网膜变性疾病是严重的致盲眼病,引起视力丧失的主要原因是视网膜神经细胞的不可逆损伤,目前临床上还没有有效的方法能阻止病变进展和恢复视网膜功能。干细胞移植治疗神经损伤和神经系统退行性病变疾病是医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点。其中骨髓间充质干细胞( bone marrow stromal cells , BMSCs)作为一种多潜能的成体干细胞,可以直接从病人自体骨髓中获得,并在体外大量增殖,同时可以避免异体和异种移植无法避免的免疫排斥问题,是目前干细胞移植研究的焦点。近年研究发现,BMSCs具有跨系统、跨胚层分化的潜能,在不同的诱导剂作用下,可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等多种中胚层来源的间质细胞和内胚层的肝细胞,还可分化为外胚层的神经祖细胞、神经细胞等。因此,BMSCs是未来用于干细胞移植治疗具有临床应用前景的种子细胞。目前,诱导BMSCs向视网膜神经细胞分化的研究刚刚起步,主要集中在以下两方面:一是采用共培养方法模拟视网膜的局部微环境进行诱导。二是采用细胞因子进行化学性诱导。鼠视网膜神经细胞的发生大致经历胚胎期和新生期两个阶段。新生阶段是鼠视网膜发育分化的第2个高峰期,存在大量未分化的细胞,是视杆细胞分化形成的主要阶段,提示新生鼠视网膜微环境内可能存在促进干细胞分化的多种细胞因子和细胞外基质成分。研究显示,视网膜干细胞与新生鼠视网膜神经细胞共培养后,能较多地分化为视杆细胞,BMSCs与新生鼠视网膜神经细胞共培养后可以获得视网膜神经节细胞特异性标记物Thy1.1表达阳性的细胞,但与新生鼠视网膜神经细胞共培养是否能诱导BMSCs分化为视杆细胞和其他视网膜神经细胞,目前尚不清楚。在诱导BMSCs分化为神经细胞的化学性诱导方法中,bFGF诱导方法是常用的一种经典方法,与其他化学性诱导方法相比,bFGF诱导的优点在于可以获得较高的神经细胞分化率。此外,bFGF联合细胞因子BDNF、NGF可以诱导BMSCs分化为以视杆细胞为主的视网膜神经细胞,但bFGF诱导是否直接诱导BMSCs分化为以视杆细胞为主的多种视网膜神经细胞,共培养微环境诱导和化学性诱导对BMSCs向视网膜神经细胞的分化效率有何不同,目前未见报道。国内外一些学者将未诱导BMSCs直接移植至视网膜变性大鼠和激光损伤大鼠的视网膜下腔,可以观察到移植细胞在视网膜下腔存活、迁移并整合于宿主视网膜,细胞移植后宿主视网膜功能得到一定的改善,但直接移植的BMSCs迁移能力都偏低,分化为视网膜神经细胞的功能也不强。而BMSCs先进行体外诱导分化后,是否有利于提高其在宿主视网膜内存活、迁移和分化的能力,同时更好地改善宿主的视功能,还有待研究。基于上述的研究现状,本研究采用新生鼠视网膜神经细胞共培养和bFGF化学性诱导两种方法对BMSCs进行诱导,观察并对比两种方法对诱导后细胞向视网膜神经细胞方向分化的不同影响。在此基础上,将BMSCs经体外先行诱导分化后的混合细胞和未诱导的BMSCs分别移植至变性大鼠的视网膜下腔,观察并对比两种策略所移植的细胞在变性视网膜内的存活、迁移和分化,及其挽救变性视网膜的光感受器细胞的和改善视功能重建情况。本研究分为叁个部分:第一部分:大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定及细胞特性研究30d龄Long-Evans大鼠股骨来源的骨髓间充质干细胞分离、培养,并对其进行鉴定和生物学特性检测。成功建立成年Long-Evans大鼠股骨来源BMSCs的培养方法,原代培养细胞生长良好,7-10天融合成单层。传代后细胞呈均一的成纤维细胞样,经流式细胞仪检测纯度高达90%以上,生长良好,可以在体外大量扩增,具有干细胞的多向分化潜能。第二部分:大鼠BMSCs诱导分化为视网膜神经细胞的体外研究分别采用Transwell分隔共培养系统和bFGF化学诱导法对BMSCs进行诱导,观察不同诱导方法的诱导效率,以生长培养基DMEM/F12+10%FBS为对照组。结果显示:1.大鼠BMSCs与新生鼠视网膜神经细胞共培养后,随着时间延长,神经元样细胞逐渐增多。诱导后细胞可表达成熟神经元(MAP-2)、视网膜神经节细胞(Thy1.1)和视杆细胞(opsin)的标记物,而不表达双极细胞(PKCα)和神经胶质细胞(GFAP)标记物。诱导后5天MAP-2,Thy1.1阳性率最高,分别为10.8%和3.8%,与其他时间点相比差别具有统计学意义(P<0.01)。opsin阳性细胞出现在诱导后5天,阳性率为1.9%,与诱导后7天相比差别具有统计学意义(P<0.01)。2.大鼠BMSCs经bFGF诱导后,在1天时绝大多数细胞即呈现神经元样改变,但随着诱导时间延长,神经元样细胞大量脱落。诱导后细胞表达MAP-2、Thy1.1和opsin,不表达PKCα和GFAP。诱导后1天MAP-2,Thy1.1阳性率最高,分别为74.2%和15.6%,与其他时间点相比差别具有统计学意义(P<0.01)。opsin表达阳性的细胞仅出现在诱导后1天,阳性率为2.3%。3.对照组BMSCs未发生形态变化,MAP-2,Thy1.1,opsin,PKCα和GFAP表达均为阴性。4.在诱导的不同时间点,bFGF诱导组MAP-2和Thy1.1的阳性率均显着高于共培养诱导组(P<0.01)。bFGF诱导组仅在诱导后1d出现opsin表达阳性的细胞,而共培养诱导组在诱导5d时才出现opsin阳性的细胞。BMSCs经bFGF诱导后,随着诱导时间的延长,多数细胞脱落,存留的贴壁细胞显着少于共培养诱导组(P<0.01)。第叁部分:骨髓间充质干细胞经体外bFGF诱导后移植至RCS大鼠视网膜下腔后的存活、迁移、分化及其对视功能的改善将DiI荧光标记的未诱导BMSCs和bFGF诱导后1天的混合细胞(包含BMSCs,已表型分化的神经元和视网膜神经细胞)分别移植入RCS大鼠的视网膜下腔,以RCS-rdy大鼠作为正常对照,观察移植后不同时间点,移植细胞在宿主视网膜下腔存活、迁移和分化情况,以及对变性视网膜光感受器细胞的挽救作用和对视功能的改善。结果显示:1.未诱导的BMSCs和bFGF诱导后的混合细胞分别移植至RCS大鼠和正常对照大鼠视网膜下腔后,均可至少存活至移植后3个月。两种细胞移植后在RCS大鼠视网膜内存活细胞数均显着多于正常对照大鼠视网膜(P<0.05)。在移植后3个月,bFGF诱导后的混合细胞在RCS大鼠视网膜和正常对照视网膜内存活的细胞多于未诱导BMSCs移植组(P<0.05, P<0.01)。2.未诱导BMSCs直接移植后,在RCS大鼠视网膜内3个月迁移至内核层和神经节细胞层,在正常对照大鼠视网膜内主要存在于视网膜下腔,少数移植细胞迁移至内核层。在移植后1个月和2个月,未诱导BMSCs在RCS大鼠视网膜内迁移距离高于正常对照大鼠(P<0.05, P<0.01)。bFGF诱导后的混合细胞移植后,在RCS大鼠视网膜内2个月即迁移至神经节细胞层,而在正常对照大鼠视网膜内3个月时偶见移植细胞迁移至神经节细胞层。在移植后1个月和2个月,bFGF诱导后的混合细胞在RCS大鼠视网膜内迁移距离高于正常对照大鼠(P<0.05, P<0.01)。在移植后不同时间点,bFGF诱导后混合细胞在RCS大鼠视网膜内迁移距离均显着高于未诱导BMSCs(P<0.01)。3.未诱导的BMSCs在RCS大鼠视网膜内可以表达Thy1.1,opsin,PKCα和GFAP,在正常对照大鼠视网膜内,仅1个月时表达GFAP。bFGF诱导后的混合细胞在RCS大鼠视网膜内,仅在1个月时表达Thy1.1和GFAP,在正常对照大鼠视网膜内仅在1个月时表达GFAP。4.未诱导的BMSCs和bFGF诱导后1天的混合细胞移植至变性视网膜下腔后均能延缓光感受器细胞变性,外核层存留的细胞层数显着多于伪手术组(P<0.05)。Rod-ERGb波在移植后1个月比伪手术组潜时缩短,幅值增加(P<0.05),Max-ERG b波在移植后1个月和2个月幅值增加(P<0.05)。而在移植后3个月Rod-ERG和Max-ERG b波潜时和幅值均无明显改善(P>0.05)。未诱导的BMSCs和bFGF诱导1天的BMSCs之间对变性视网膜的外核层存留和F-ERG功能改善没有显着差别(P>0.05)。结论:1.建立了具有高纯度和良好生物学特性的成年Long-Evans大鼠股骨来源BMSCs培养体系,扩展了BMSCs在眼科基础研究中的应用范围;2.bFGF化学性诱导和新生鼠视网膜神经细胞共培养均能诱导大鼠BMSCs分化为神经元、视网膜神经节细胞和视杆细胞;新生鼠视网膜微环境有利于诱导后细胞存活,但在短时间内诱导效率较低。而bFGF化学性诱导具有短时间内诱导大鼠BMSCs向神经元和视网膜神经细胞分化的优势,这为未来BMSCs应用于临床进行视网膜移植,使患者尽可能在短时间内获得有效治疗提供了一种新方法;3.BMSCs在体外经bFGF诱导后进行移植,存活和迁移能力增强,分化能力较弱,可延缓RCS大鼠视网膜光感受器细胞变性,在移植后1个月和2个月可部分改善宿主视功能,而在移植后3个月,不能挽救宿主视功能。这为未来视网膜移植如何进一步优化BMSCs,获得理想的诱导和移植策略,进而重建视功能,提供了一个新的思考方向。
魏勇[3]2003年在《小鼠视网膜干细胞的分离与诱导分化》文中提出鱼类及两栖类动物的视网膜睫状缘区(CMZ)存在视网膜干细胞，在视网膜损伤时，视网膜内有增殖潜能的细胞可快速增殖、分化以修复更新受损细胞。近年来，随着神经干细胞研究的不断深入，国外部分学者开始尝试哺乳动物视网膜干细胞的分离探索工作。研究资料显示，这些在进化上较高级的动物也存在着一个与鱼类及两栖类的CMZ区(睫状缘区)相似的区域，国内在视网膜干细胞的研究方面尚未见文献报道。目的：研究视网膜干细胞的分离、体外培养方法与增殖、分化规律，以期为视网膜疾病的研究提供基础性资料。方法：(1)应用细胞培养技术，在不同有丝分裂原(bFGF、EGF、胰岛素)作用下，比较胎龄17天昆明小鼠眼的睫状体部(CMZ)、视网膜色素部(RPE)、视网膜神经部(NR)以及虹膜部体外培养细胞的特点，确定视网膜干细胞的存在部位；(2)通过免疫细胞化学及免疫荧光方法研究视网膜干细胞的增殖及分化特性；(3)体外应用VEGF定向诱导视网膜干细胞向感光细胞分化。结果：(1)来自CMZ区的培养细胞，在特定外源性有丝分裂原作用下，可形成悬浮生长的细胞团，经多次传代，细胞增殖能力未见衰减。BrdU标记结果显示增殖的大部分细胞为BrdU阳性细胞，表明悬浮细胞团的形成主要是由分裂增殖的细胞组成。免疫荧光染色显示，培养细胞可表达神经干细胞的特异性抗原Nestin及胚胎发育早期视网膜内原始细胞的特异性抗原Chx-10。NR、RPE及虹膜部的分离细胞没有显示干细胞特性。(2)叁种外源性有丝分裂原bFGF、EGF及胰岛素作用比较显示：bFGF、EGF可使来自CMZ的培养细胞以悬浮细胞团的生长方式体外维持8代，细胞依然保持较强的未分化特性，增殖能力可维持在较稳定的水平，未见减弱；胰岛素的刺激作用较弱，来自CMZ区的体外培养细胞仅可维持5代，细胞增殖能力弱，每低倍视野下悬浮细胞团数量明显少于bFGF、EGF作用组。(3)来自CMZ区的视网膜干细胞经5%胎牛血清诱导可自发向成熟细胞分化，可分别表达神经元与神经胶质细胞的特异性抗原NSE、GFAP。经免疫荧光检测显示分化细胞分别表达感光细胞、双极细胞以及节细胞的特异性抗原Opsin、PKC及β-Tubulin。(4)VEGF与5%的胎牛血清共同作用可定向诱导视网膜干细胞向感光细胞分化，感光细胞的诱导生成数量是单用血清诱导数量的2.05倍。<WP=7>结论：(1)小鼠视网膜干细胞存在于睫状体部位，在外源性有丝分裂原作用下体外培养可显示干细胞的未分化特性及增殖、自我更新功能；(2)在5%胎牛血清诱导作用下，来自CMZ区视网膜干细胞具有多向分化能力，可分化为感光细胞、双极细胞以及节细胞等视网膜神经细胞；(3)VEGF可作为一种有效的诱导因子定向诱导视网膜干细胞向感光细胞分化。
戴方方[4]2016年在《联合脂肪间充质干细胞移植对糖尿病视网膜病变大鼠血—视网膜屏障的影响》文中提出目的：探讨脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, AMSC)联合类内皮细胞(endothelial-like cell, ELC)或人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)移植对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)大鼠的血-视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的影响及作用机制；评价不同剂量的AMSC移植治疗DR大鼠的效果。方法：以链脲佐菌素腹腔注射法建立Wistar大鼠糖尿病动物模型。于注射后7个月(30周)时,随机抽选大鼠行视网膜血管网消化铺片以明确DR血管性损伤的发生。原代分离、培养AMSCs和HUVECs,流式细胞仪进行鉴定。将AMSCs置于内皮细胞培养基中诱导分化得到ELCs。DR大鼠随机分组：未治疗组、诱导组(AMSCs +ELCs)、联合组(AMSCs+HUVECs)、高剂量组(AMSCs)及低剂量组(AMSCs),经尾静脉注射行细胞干预。于干预后2、4周,Evans blue渗漏实验评估大鼠的BRB功能；HE染色评估大鼠视网膜水肿度；qPCR及Western-blot检测大鼠视网膜细胞间黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促血管生成素-2(angiopoietin-2, Ang-2)的表达；免疫组织化学及共聚焦荧光染色观察移植细胞向视网膜的归巢；心、肝、脾、胰、肾的HE及免疫组织化学染色评估细胞移植的安全性。结果：1)DR模型：7个月时,糖尿病大鼠的视网膜血管网消化铺片可见闭锁的无细胞性毛细血管,DR大鼠模型建成。2)细胞培养：原代培养的AMSCs及诱导而来的ELCs均为成纤维细胞样。原代培养的HUVECs为铺路石样排列的多角形细胞,高表达内皮细胞标志分子CD31(99.52%)和vWF(99.63%)。3) BRB功能试验：干预后2周,与未治疗组相较,仅诱导组及低剂量组的Evans blue渗漏量有所减轻,BRB功能有改善。干预后4周,其余各干预组的BRB功能均较诱导组的为好。3) 分子表达：干预后2周,与未治疗组相较,仅低剂量组的ICAM-1蛋白水平有所下降；诱导组的ICAM-1及VEGF的基因转录转录及蛋白表达均有所上升；各组之间Ang-2的基因转录及蛋白表达均无统计学差异。干预后4周,与未治疗组相较,各干预组的ICAM-1蛋白表达均有所下降；低剂量组的VEGF的基因转录水平有所上升,但VEGF蛋白表达有所下降；诱导组的VEGF的基因转录水平有所上升,蛋白水平无明显变化；各组之间Ang-2的基因转录及蛋白表达水平均无统计学差异。4)视网膜结构：标化灰度值分析结果示,干预后2周,与未治疗组视网膜对应层次对比,仅低剂量组的外核层和视网膜神经纤维层水肿度有所减轻。干预后4周,与未治疗组视网膜对应层次相较,各干预组的外核层、除外诱导组的各干预组的内核层、联合组及高剂量组的内丛状层的水肿度均有所减轻。5)细胞归巢：免疫组织化学染色及共聚焦结果示,人源细胞在视网膜上散在分布,可能与视网膜血管有密切关系。6)移植安全性：HE染色镜下可见糖尿病肾病改变及肾脏多发肿瘤。仅联合组可以见到大量肾小管细胞管型。胰腺的胰岛细胞数目有所减少。心、肝、脾的结构大致正常。免疫组化结果示人源细胞密集于大鼠的脾脏和肾脏肿瘤周围,可见于肝脏汇管区,偶见于肾小管管壁和联合组的肾小管管腔。结论：AMSCs能够改善DR大鼠的BRB功能,该作用可能是通过抗炎作用来实现。单纯低剂量AMSCs治疗组能够更快改善DR大鼠的BRB功能。单纯AMSCs注射治疗DR的效果优于联合ELCs组。
白月[5]2011年在《光损伤视网膜片培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为视网膜样细胞的研究》文中研究指明目的:研究应用SD(Sprague-Dawley)大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液,诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外跨胚层诱导为视网膜样细胞的可能性。方法:1、SD大鼠MSCs的分离和培养:采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠MSCs,并用流式细胞仪对细胞纯度进行鉴定。2、SD大鼠视网膜片的取材:在显微镜下,彻底取下SD大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片。并对其常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织结构的完整性。3、视网膜片光损伤:在超净台内,将取下的SD大鼠视网膜片放入盛有Neurobasal培养基A(其中加入1:50的B27和0.5M L-glutamine)中,用(1950±200) Lux的光照强度照射45min,用电镜观察其光损伤程度。4、大鼠MSCs诱导分化的条件培养液制备:条件培养液Ⅰ:将SD大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合而成。条件培养液Ⅱ:未光损伤SD大鼠视网膜片培养的上清液与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合而成。条件培养液Ⅲ:直接用Neurobasal培养基A与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合制成。5、大鼠MSCs体外诱导成视网膜样细胞:3种条件培养液均培养诱导至第3代的SD大鼠骨髓间充质干细胞7-8d。用倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态学改变。6、用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测视紫红质(Rhodopsin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NES)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ,GFAP)等特征性标记在诱导后细胞中的表达情况。结果:1、流式细胞仪鉴定经贴壁筛选法可获得大量高纯度的大鼠MSCs。2、HE染色显示所取的SD大鼠神经上皮层结构完整。3、电镜结果显示光损伤后的SD大鼠视网膜片结构损伤严重。4、诱导7-8d后的SD大鼠MSCs置倒置相差显微镜下观察:条件培养液Ⅰ诱导组的细胞有较多突起,发生迁移并建立突触联系,而条件培养液Ⅱ及条件培养液Ⅲ只有少数细胞发生上述改变。5、免疫细胞化学染色显示:3组不同检测指标阳性率分别为:条件培养液Ⅰ组Rhodopsin(37.97±7.84)%、NSE(21.59±2.98)%、GFAP(20.73±5.25)%,条件培养液Ⅱ组Rhodopsin(10.23±2.05)%、NSE(16.24±1.10)%、GFAP(15.92±0.96)%,条件培养液Ⅲ组Rhodopsin(0)、NSE(6.24±4.58)%、GFAP(4.96±1.79)%。将叁种培养条件下所表达的阳性细胞分别进行统计学分析,组间差异有统计学意义。RT-PCR鉴定也显示同样结果:条件培养液Ⅰ组Rhodopsin(0.3915±0.00644)、NSE(0.2019±0.00682)、GFAP(0.1972±0.00211),条件培养液Ⅱ组Rhodopsin(0.0983±0.00319)、NSE(0.1048±0.00323)、GFAP(0.1040±0.00254),条件培养液Ⅲ组Rhodopsin(0.0044±0.00126)、NSE(0.0498±0.00149)、GFAP(0.0467±0.00333)。结论:光损伤SD大鼠视网膜片培养上清液可诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为视网膜样细胞,研究结果为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。
黄健发[6]2017年在《人外周血单个核细胞的预诱导培养及在视网膜变性小鼠眼内的存活和功能研究》文中研究指明干细胞是一类在拥有自我更新和潜在分化能力的同时能保持未分化状态的细胞(1)。而成人外周血单个核细胞(hPBMCs)中存在一小簇异质性的干细胞。由于这些干细胞具有多向分化潜能、获取方便、来源广泛的特点,使其成为干细胞治疗的理想资源。视网膜变性是一种表现为进行性感光细胞及色素上皮功能丧失的遗传性疾病,是眼底病导致失明的重要原因之一。该病至今还没有有效的治疗方法,而干细胞移植治疗为视网膜变性疾病的治疗提供了一条新的途径。干细胞治疗发挥疗效的前提条件是干细胞能够移植到体内并长时间存活。本研究的主要目的在于实现hPBMCs在体外的预诱导培养,并将体外预诱导培养后的hPBMCs移植到视网膜变性小鼠(视网膜色素变性模型小鼠和视网膜慢变性小鼠)的视网膜下腔,研究hPBMCs的存活以及对小鼠视网膜功能恢复的影响。本论文首先从健康成人静脉中抽取外周血;用淋巴细胞分离液从外周血提取hPBMCs。将获取的hPBMCs与新生大鼠的视网膜进行4天的预诱导性共培养,并通过实时定量PCR及流式细胞术检测预诱导培养后,视网膜神经细胞及光感细胞的标记物表达情况,验证hPBMCs分化成为神经细胞和光感细胞的可能性。再接着把诱导培养后细胞群注射到视网膜变性小鼠的视网膜下腔。最后,在细胞移植后第5个月用视网膜电生理检测仪检测小鼠视网膜生物电的恢复情况;在细胞移植后第6个月用免疫荧光化学、流式细胞术及RT-PCR来分析移植的hPBMCs的存活情况。移植hPBMCs六个月后视网膜慢变性小鼠眼球切片的免疫荧光结果显示,在视网膜的内核层和节细胞层均有移植的细胞存在,而且部分细胞有神经干细胞标志物Nestin,神经祖细胞标志物Vimentin、βⅢ-tubulin,神经细胞标志物MAP2,及光感细胞标志物Rhodopsin表达。流式细胞术检测显示,实验组的手术眼有19.35±10.33%的细胞表达抗人线粒体特异性抗体信号;同样的,在实验组的非手术眼也有11.55±1.52%细胞表达。PCR结果显示,人的细胞色素b基因在移植六个月后仍在小鼠的实验眼中有表达。全视野视网膜电图(ERG)结果显示,移植五个月后,有部分治疗小鼠的实验眼恢复对光反应。以上结果表明,移植到视网膜下腔的经预诱导培养后的成人外周血单个核细胞在移植后六个月内能以神经细胞及光感细胞的方式存活,并发挥修复作用。
穆毓[7]2009年在《不同鼠龄大鼠视网膜干细胞的体外培养及鉴定》文中研究表明视网膜干细胞作为神经干细胞的一种,具有可以体外分离、诱导的潜能,并且理论上可以移植入受损伤眼内治疗不可逆性视网膜疾病。与其他来源干细胞相比,视网膜干细胞又以其容易获得,具有良好的组织同源性,不易发生免疫排斥反应等优点成为研究的热点。本实验拟通过对不同鼠龄来源视网膜干细胞的培养,探讨不同年龄阶段视网膜干细胞的特点,建立成熟的体外分离、培养及鉴定方法,为进一步研究其分化机理和治疗潜能奠定理论基础。分别取鼠龄为孕18天,出生后48小时,7天,13天,21天,2个月Wistar大鼠的睫状体部(含色素层)于无血清添加外源性生长因子,且没有神经营养添加剂的培养液中培养。取出生后大鼠的视网膜组织在上述培养液中培养,作为阴性对照。取孕18天胎鼠的脑组织在相同培养条件下培养,作为阳性对照。通过目的细胞形态与同条件生长的视网膜细胞和胎鼠的脑组织培养所得细胞相比较,发现出生后的大鼠视网膜中不存在可以增殖、具有自我更新能力的干细胞,而从睫状体部提分离培养所得的细胞生长形态与胎鼠培养获得的神经干细胞形态相似,都能形成悬浮生长的细胞团,且传代后重新形成细胞团。免疫荧光方法对细胞团细胞进行鉴定,nestin反应呈阳性。通过不同鼠龄视网膜干细胞的分离、培养及鉴定发现:从胚胎大鼠视网膜中可以培养出表型与视网膜干细胞相似的细胞;出生后至成年阶段大鼠睫状边缘区存在具有自我更新及多分化潜能的神经干细胞,出生13日内大鼠睫状体中分离出来的视网膜干细胞较容易进行体外培养;出生后大鼠视网膜中未分离出可以体外培养的干细胞。
蹇骞[8]2015年在《大鼠视网膜色素变性Müller细胞逆分化和转分化的分子机制研究》文中研究表明视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)是遗传性视觉损害和盲目的最常见原因之一,表现为进行性感光细胞及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)功能丧失。其确切病因不明,一旦发病,无论患者自身修复或临床常规治疗均很难逆转该病进程。与之完全不同的是,我们在低等脊椎动物鱼和两栖类看到,视网膜损伤后可以完全修复和再生,原因是其视网膜中终生存在具有内源性干细胞潜能的Muller胶质细胞。在病理情况下,该Muller胶质细胞能够逆分化为视网膜干细胞,发挥神经再生的作用,完全恢复视网膜功能。但在高等哺乳动物,Muller细胞的干细胞潜能受到很大的限制。寻求一种安全有效的途径,持续激活视网膜Muller细胞,是实现高等哺乳动物视网膜神经再生的瓶颈问题。通过对视网膜变性和再生过程中Muller细胞逆分化情况及其调控机制的研究,可能揭示成年哺乳动物视网膜再生的奥秘。NaIO3引起的急性视网膜变性是一种经典的视网膜色素变性模型。皇家外科学院大鼠(Royal College of Surgeon's rat,RCS rat)是一种研究遗传性视网膜色素变性的经典模型,其发病机制和转归与人类相似。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells,BMSCs)移植治疗视网膜变性疾病的显着疗效在国内外研究中均得到了广泛的证实,可以用于研究视网膜再生。有研究发现,变性损伤视网膜细胞和BMSCs均能不同程度的分泌一种或多种神经营养因子(Neurotrophic factors, NTs)。NTs介导的信号通路对干细胞存活、迁移、粘附、自我更新和分化命运都有重要的影响。它经由p27kip1介导可促进干细胞进入细胞分裂周期[35-37],经由Hes1可促进干细胞向神经方向分化,抑制胶质命运[39-42]。但在视网膜变性和干细胞移植后神经再生过程中,该信号途径发生了怎样的变化,能否发挥其重要的调控功能,并对Muller细胞产生影响,目前尚不清楚。基于上述研究现状和本实验室基础,我们提出如下假说：釚性视网膜色素变性过程中可能通过分泌有限的NGF等NTs,经由Hesl短暂邀Muller细胞的逆分化,随着NTs的消失,最终导致Muller细胞胶质化。而慢性视网膜色素变性过程中,移植的BMSCs能够持续分泌NTs,抑制Muller细胞的胶质命运,进而促进Muller鱼胞逆分化和神经再生,延缓视网膜色素变性疾病进程,挽救视功能。我们将探讨神经营养因子信号通路参与Muller细胞逆分化和胶质化命运调控的可能机理,研究结果为建立有临床应用前景的内源性干细胞神经再生奠定理论基础。本研究包括两个部分：第一部分：大鼠急性视网膜色素变性过程中Muller细胞逆分化和转分化的分子机制研究正常大鼠采用NaIO3腹腔注射,建立急性视网膜色素变性模型。注射PBS的正常大鼠作为对照。通过视网膜冰冻切片免疫荧光双标技术和qRT-PCR技术观察到在损伤后3-7天,视网膜Muller细胞重新回到细胞周期出现逆分化,表达细胞增殖标记BrdU. PCNA,视网膜干细胞表达PAX6,且转分化表达视网膜神经元标记crx、rhodopsin。同时,蛋白芯片、ELISA、免疫荧光双标技术和qRT-PCR检测发现,视网膜中NGF含量增高,Muller细胞NGF/TrkA信号高表达,其下游的细胞周期依赖激酶抑制剂p27kip1表达降低,核蛋白Cyclin D1表达增高,调控细胞重新回到细胞周期开始分裂增殖。此外,NGF/TrkA信号通路下游的转录抑制因子Hes1表达降低,促进Muller细胞的神经分化。该活化过程非常短暂,到了损伤后28天,NGF/TrkA信号通路关闭,Muller细胞逆分化和神经分化水平降低,Muller细胞走向胶质命运出现胶质化,大量表达GFAP。为进一步验证该分子机制在视网膜修复过程中的调控模式,我们选择了更加稳定和成熟的慢性遗传性视网膜变性模型——RCS大鼠,行rBMSCs视网膜下腔移植。第二部分：RCS大鼠移植rBMSCs后Miiller细胞逆分化和转分化的分子机制研究将rBMSCs移植到RCS大鼠视网膜下腔作为实验组,视网膜下腔注射PBS的RCS大鼠作为伪手术组,未处理的RCS大鼠作为空白对照组。通过ERG检查发现术后2w、4w、8w,大鼠视网膜功能显着改善,明显高于PBS伪手术组和空白对照组。同时,外核层厚度亦较对照组增加。视网膜冰冻切片免疫荧光双标技术和qRT-PCR检测观察到在移植后2-4w,视网膜Muller细胞重新回到细胞周期出现逆分化,表达细胞增殖标记BrdU、PCNA,视网膜干细胞表达SOX2、PAX6,且转分化表达视网膜神经元标记crx、opsin。将体外培养的Muller细胞与rBMSCs共培养,通过细胞免疫荧光双标染色发现,Muller细胞同样出现逆分化,表达细胞增殖标记BrdU,视网膜干细胞标记SOX2,转分化表达视网膜感光前体细胞标记crx。通过ELISA检测发现,rBMSCs能够大量释放NGF,其培养基中NGF含量是对照组的3-5倍。同时,我们还发现NGF蛋白可以在离体和在体情况下短时间内激活Muller细胞逆分化,表达细胞增殖标记BrdU,视网膜干细胞标记SOX2等。而NGF中和抗体则可以暂时部分抑制1BMSCs对Muller细胞的作用。经免疫荧光双标技术和’Western-blot技术检测发现,移植组视网膜Muller细胞高表达NGF受体TrkA,且NGF/TrkA信号通路下游分了p-PI3K、p-Akt、p-CREB均表达增加。至术后8w,NGF/TrkA信号通路表达降低,Muller细胞逆分化也回到对照组水平。体外培养的rBMSCs同样可以上调Muller细胞NGF/TrkA信号通路下游分子p-PI3K、p-Akt、 p-CREB蛋白水平的表达。且在该体系中加入TrkA阻断剂252a后,NGF/TrkA信号通路表达降低,Muller细胞逆分化被抑制。与急性视网膜色素变性过程中NGF少量分泌短暂激活Muller细胞相比,视网膜神经再生过程中,移植的rBMSCs能够更加稳定的分泌NGF,持续激活Muller细胞逆分化和神经分化,显着改善视功能。在两个阶段Muller细胞的活化中,NGF/TrkA信号通路均发挥了重要的调控作用。本研究结论：1、大鼠急性视网膜色素变性初期,Muller细胞表现出内源性干细胞潜能,短暂的逆分化并转分化为视网膜神经元,表达视网膜前体干细胞和视网膜神经元标记。同时,变性视网膜在早期短暂性地分泌NGF并激活其受体TrkA。这一结果提示内源性干细胞可以被急性视网膜色素变性短暂激活,为研究内源性干细胞在视网膜变性中的作用奠定了基础。2、率先研究了rBMSCs在在体和离体情况下,持续激活视网膜内源性干细胞Muller细胞,使Muller细胞重新进入细胞周期并促进其逆分化和转分化,发挥神经再生作用,挽救视功能。为干细胞经激活内源性干细胞治疗视网膜变性疾病提供了实验证据。3、体外培养的rBMSCs可以稳定持续地分泌NGF,该分子可以在在体和离体情况下,促进视网膜内源性干细胞Muller细胞重新进入细胞周期并向神经元方向分化。可能是rBMSCs治疗视网膜变性疾病有效性的机制之一。4、本研究发现,NGF/TrkA信号通路是rBMSCs激活Muller细胞逆分化的重要调控途径,它经p27kip1开启Muller细胞逆分化,并经有Hes1促进其向神经分化,抑制胶质命运。揭示了rBMSCs促Muller细胞逆分化的分子机制。
肖庆[9]2010年在《小鼠视网膜多潜能干细胞的分离培养和小鼠胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化的研究》文中研究指明研究背景视网膜色素上皮(Retinal Pigment EPithelium, RPE)具有复杂的结构和特殊的生理机能。RPE能吞噬脱落的光感受器细胞外节膜盘(rodoutersegmeni, ROS),这对光感受器细胞外节的更新及维持正常视觉功能至关重要,其功能障碍会导致严重视网膜疾病和一些严重的遗传性变性眼病,如Best病、Stargardt病、Leber先天性黑曚和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD);等。因此应用RPE细胞移植治疗某些眼底疾病是其中的一个研究热点,目前面临的主要问题是如何获得合适的RPE移植细胞,才能在移植后与宿主残留的视网膜细胞达到最佳的整合效果,以求最大限度地重建患者的视功能。组织细胞工程尤其是干细胞工程的兴起为视网膜损伤的治疗提供了一种新的途径。极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cell, VSEL)是美国路易斯维尔大学Kucia研究小组从小鼠骨髓和人脐带血中分离出scal+lin-CD45-、具有类似胚胎干细胞生物特性的的多能干细胞,Liu等从小鼠视网膜神经上皮中分离了相似的视网膜多潜能干细胞(retinal multipotential stem-like cells, retinalPSC)。已有研究证实：这些多潜能干细胞不仅具有与胚胎干细胞相似的形态学特征和细胞标记物,而且具有胚胎干细胞多分化潜能的特性,在体外可以被诱导分化为内胚层、中胚层、外胚层细胞,潜在分化能力强,若作为组织工程和临床治疗的种子细胞,可避免伦理争议,具有良好的应用前景。通过免疫磁珠分选的方法,我们从新生小鼠小鼠的神经视网膜组织中得到scal+lin-CD45-的同一细胞亚群,通过细胞免疫荧光和流式细胞仪检测其特性,为视网膜移植的供体选择提供新的来源。当然,目前最广泛的种子细胞来源还是胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES).胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)具有无限扩增和多向分化潜能的特点,因此关于其诱导分化的研究成为干细胞研究的热点。如能在体外将胚胎干细胞(ESCs)源源不断地诱导分化成患者所需要的靶细胞(如RPE、光感受器细胞细胞),可望突破视网膜移植中面临的供体来源有限的难题,具有广阔的应用前景。目前,将ESCs体外诱导分化成RPE细胞的研究已经取得了一定的成果,借鉴皮肤黑色素细胞诱导时采用的ST2细胞层和类似的诱导条件,采用PA6间充质细胞系作为饲养细胞层,小鼠ES细胞能分化为呈六角形排列的、胞浆中出现色素颗粒的RPE细胞,但其诱导效率低。除了共培养或组织移植,目前尚无较好获得有效RPE的高效率方法。因此,我们设想建立一种无饲细胞层体外培养的小鼠ES诱导成光感受器和RPE的培养体系,提高ES向RPE诱导效率。目的1探讨免疫磁珠分选方法从新生C57小鼠视网膜神经上皮中分离出具有多潜能干细胞特性的scal+lin-CD45-细胞群的可行性。2研究小鼠视网膜多潜能干细胞与小鼠胚胎干细胞的形态特征及基因表达差异。3探讨小鼠视网膜多潜能干细胞向RPE分化的途径,建立一种无饲细胞层培养的小鼠ES分步诱导成RPE的高效培养体系。方法1小鼠视网膜多潜能干细胞的获取：取初生1天C57小鼠神经视网膜组织制成单细胞悬液,使用免疫磁珠分选的方法先行Lin-阴性分选后行Scal+阳性分选得到scal+lin-CD45-细胞群,使用流式细胞技术和细胞免疫荧光法鉴定其具有极小胚胎样干细胞的特性。2小鼠视网膜多潜能干细胞和胚胎干细胞的培养：用小鼠成纤维细胞作为饲细胞层,神经干细胞培养基和胚胎干细胞完全培养基分别培养两种细胞,并观察形态特性。3小鼠胚胎干细胞和视网膜多潜能干细胞及RPE的鉴定：采用碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase, AKP)进行小鼠ES鉴定,采用免疫组织化学方法检测小鼠视网膜多潜能干细胞；用Real Time-PCR方法检测全能性基因Oct4,Nagnog,Sox2在小鼠ES,小鼠视网膜多潜能干细胞与小鼠RPE的表达差异；Reverse Transcription-PCR检测小眼球相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase, Tyr)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein-1, TRP1),视网膜色素上皮细胞65蛋白(retinal pigment epithelial protein-65, RPE65)在小鼠ES,视网膜多潜能干细胞与RPE的表达差异。4小鼠ES与诱导产生的RPE基因表达差异性检测：小鼠ES无饲细胞层培养,并添加诱导因子进行26天的诱导方案,采用细胞免疫组织化学方法检测诱导形成的RPE,Real Time-PCR检测ES和RPE的Oct4、Nagnog、Sox2基因表达差异,Reverse Transcription-PCR检测MITF、TYR、TYRP1、RPE65在小鼠ES与RPE的表达差异。结果1小鼠视网膜多潜能干细胞分选率：利用免疫磁珠分选的方法从新生小鼠神经视网膜组织中分离出scal+lin-CD45-细胞群,细胞计数分选得率为1.2%。该细胞群干细胞抗原Scal表达率达96.5%,大小为2-6um,形态呈小圆形,核质比高。2小鼠视网膜多潜能干细胞组织形态学、免疫组化及基因表达：形态呈小圆形,直径2到6um, Scal表达阳性；全能性基因Oct4、Nagnog、Sox2的表达比小鼠ES低,比小鼠视网膜色素上皮细胞高,不表达RPE的标记性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65;小鼠ES呈克隆状生长,排列紧密,细胞集落隆突有立体感,边缘整齐清晰,形似鸟巢。单个细胞胞浆少,细胞核大,核仁明显,界限不清。AKP阳性,全能性基因Oct4、Nagnog、Sox2的高表达。3小鼠ES向RPE的定向诱导：本实验中尚未从小鼠视网膜多潜能干细胞成功获得RPE；但小鼠ES无饲细胞层培养并添加诱导因子可定向分化为RPE,获得的RPE角蛋白表达阳性,Oct4、Nagnog、Sox2不表达,表达RPE的标记性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65。结论1利用免疫磁珠分选的方法可以从新生C57小鼠神经视网膜中成功分离出scal+lin-CD45-细胞群,其分选率为1.2%。2小鼠视网膜scal+lin-CD45-细胞群具有VSEL的特性。形态呈小圆形,直径2到6um,全能性基因的表达比小鼠ES低,比小鼠视网膜色素细胞高,不表达RPE的标记性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65具有成体干细胞的特性。3本实验小鼠视网膜多潜能干细胞诱导成RPE存在一定困难,但成功建立了一种小鼠ES无饲细胞层培养并添加诱导因子向RPE诱导的高效培养方案。
邵敬芝, 彭广华[10]2016年在《干细胞移植治疗视网膜变性疾病的研究进展》文中指出视网膜变性疾病是一类与遗传相关的变性疾病,导致患者渐进性视觉丢失,是主要的致盲性眼病之一,其共同病理基础是视网膜光感受器细胞的变性、坏死和凋亡,然而目前尚无有效的治疗方法。细胞移植治疗是目前实验研究治疗视网膜变性疾病的主要方法之一。近年研究表明将感光前体细胞或视网膜色素上皮细胞移植到视网膜下腔或玻璃体内,可以延缓宿主感光细胞的凋亡、替代凋亡的感光细胞、挽救残存的视觉功能和修复视网膜结构。细胞移植治疗的一个很重要的问题是移植细胞的来源问题,目前主要的移植细胞来源是视网膜祖/干细胞、胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞等。本文就干细胞移植治疗视网膜变性疾病的研究进展进行综述。
参考文献：
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[5]. 光损伤视网膜片培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为视网膜样细胞的研究[D]. 白月. 福建医科大学. 2011
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[10]. 干细胞移植治疗视网膜变性疾病的研究进展[J]. 邵敬芝, 彭广华. 眼科新进展. 2016
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