王海[1]2004年在《蒽高效降解菌的选育及其增强型绿色荧光蛋白标记》文中进行了进一步梳理生物强化技术(bioaugmentation)自20世纪70年代产生以来,已被广泛应用于去除土壤、地下水、地表水中难降解有机物,提高了传统活性污泥法等废水处理技术对难降解有机物进行处理的能力,解决了污染环境中降解微生物缺乏或活性低的问题。生物强化技术已在生物修复中显现出强大的生命力,其核心是投加高效微生物。因此,如何得到高效微生物引起环境工作者的广泛关注。 本实验以蒽(多环芳烃中具有代表性的有毒有害污染物)为唯一碳源和能源,从具有蒽降解性能的混合菌群中分离、纯化出单株蒽降解菌ANl,以该株菌为出发菌,先后开展紫外线诱变、压迫条件下的反复适应驯化、离子注入诱变、原生质体诱变以及报告基因EGFP的标记及其活性和存活能力检测等工作,期望获得可用于生物强化的外源高效降解菌,该菌携带有报告基因。实验过程如下: 1.将本实验室从石化污染的污泥中分离出来的具有蒽降解性能的混合菌群,进行再生、富集、纯化,得到降解蒽的单株细菌,以此作为出发菌株,在压迫条件下经反复适应驯化和降解活性检测,筛选出降解活性和存活能力都较高的菌株ANl,对该菌进行紫外线诱变,然后在以蒽为唯一碳源的无机盐培养基中进行处理,得到生长良好的突变株ANul。 2.本实验通过正交试验选择了最佳培养条件:pH8.0、Tween80体积比0.4%、37℃、150r/min、葡萄糖100mg/L。以蒽为唯一碳源,通过间歇式饥饿、逐步提高碳源浓度的方法,驯化具有蒽降解活性的ANul,得到蒽降解活性和蒽耐受能力都有了一定提高的菌株ANuml,其性能为:最高耐受浓度达到200mg/L,培养30h的降解率为58%。 3.进一步将离子注入技术应用于降解菌的诱变选育,试图通过N~+离子注入诱变提高其对蒽的降解能力和环境适应性,使其成为优势降解菌并运用于生物强化,为生物强化技术增添了一种新的菌种诱变途径。在实验中,对突变株进行原生质体制备及其离子注入诱变,得到对蒽具有高效快速降解且性状稳定的两株菌ANI815(ANuml经两次离子注入诱变的突变株)和ANI315(ANuml原生质体
魏明宝[2]2004年在《构建蒽高效降解遗传重组菌的研究》文中进行了进一步梳理多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类广泛分布于天然环境中的有毒有机污染物,难于生物降解。环境中的PAHs易进入生物体和沉积物中,并通过食物链进入人体,对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害。生物修复的生物强化技术是治理多环芳烃污染的重要方法。An2是高效多环芳烃降解菌,铜绿假单胞菌具有较好的产生物表面活性剂的能力,本实验通过对An2低能N~+诱变和铜绿假单胞菌绿色荧光蛋白标记,然后进行细胞电融合,以期得到降解多环芳烃能力更强的遗传修饰菌。主要内容包括以下几个方面: 1.根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因设计了上下游引物P1和P2,通过对铜绿假单胞菌绿色荧光蛋白标记研究,构建了铜绿假单胞菌标记系统,获得带有EGFP标记的菌株,为进行相关的跟踪研究创造了条件。该菌株绿色荧光标记性能稳定,通过转化子基因组DNAPCR和斑点杂交检测,外源EGFP基因存在于转化子染色体上。 2.通过蒽降解菌An2低能N~+诱变,获得突变株An815,对蒽的耐受能力和降解能力显着提高。 3.通过对An815和带EGFP标记的铜绿假单胞菌原生质体制备与再生进行正交实验,探讨各因子对原生质体制备与再生影响水平,确定原生质体制备与再生的最优条件。 4.通过An815与带EGFP标记的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa/EGFP)原生质体电融合,得到一株融合子R2,该融合子不仅具有An815菌高效降解蒽的能力,而且具有铜绿假单胞菌产生生物表面活性剂的能力,蒽的降解效率显着提高。 5.通过采用摇瓶好氧试验,用融合子R2改善常规生物处理,对焦化废水进行了生物强化降解初步研究。加入融合子R2的改良污泥对焦化废水COD的去除率达到66.4%,与对照组相比提高了16.2%,证明融合子R2投加提高了活性污泥对焦化废水的降解率,在焦化废水的降解中具有应用潜力。
邓欢欢[3]2004年在《耦合系统融合子在黄麻根际存活能力及植物生长的研究》文中研究表明多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是环境中普遍存在的一类“叁致”毒性有机污染物。由于PAHs性质稳定、难于降解,因此具有长效性和累积效应,会在土壤中长期存留,造成严重环境污染。修复多环芳烃污染土壤的方法很多:主要有物理修复、化学修复和生物修复。而生物修复技术由于其成本低、无二次污染、可大面积应用等特点,成为了土壤修复中的一个研究热点。 本实验选用经本实验室选育的生物表面活性剂产生菌P.aeruginosa/EGFP、蒽高效降解菌ETAN315和黄麻根区优势菌Tu-1为出发菌株,P.aeruginosa/EGFP和ETAN315已经由本实验室进行了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记。通过原生质体电融合得到了两类融合子:一种是即能产生生物表面活性剂又能在黄麻根区较好生长的融合子Tu-P,一种是即能高效降解多环芳烃蒽又能在黄麻根区较好生长的融合子Tu-An。我们将出发菌株P.aeruginosa/EGFP、ETAN315以及两类融合子Tu-P、Tu-An分别投加到被多环芳烃蒽污染的黄麻根区土壤中,与之构成植物-外源微生物的耦合降解系统,初步研究了外源性细菌在植物根区的存活能力和对植物生长的影响。主要研究内容包括: 1.对两类融合子的电融合过程及筛选进行了研究,结果发现在交流频率500kHz,电场强度45V/cm,融合瞬时脉冲电场强度450V/cm,脉冲幅宽5us,个数2个隋况下融合较为合适。使用含有氯霉素和卡那霉素的双抗培养基平板来对两类融合子进行筛选,并得到了两株融合子Tu-P和Tu-An。 2.将得到的两株融合子Tu-P、Tu-An和出发菌株P.aeruginosa/EGFP、ETAN315分别投加到已被多环芳烃蒽污染的黄麻根区土壤中,结果发现融合子在黄麻根区的存活数量要远远大于出发菌株;而在混合投加2种融合子Tu-P、Tu-An(1∶1接种量)的情况下,存活数量最高,在35天后,可检测数量仍然可以达到接近10~6的可观数量,这样的情况同样出现在我们预先设置的5个污染水平,这可以解释为我们设想的植物-多菌株耦合协同降解作用的表现是良好的。 3.比较了移栽和直接播种两种植物修复方法,在一周内,在轻度污染和中度污染的情况下,两种方法的植物存活率相差不大,但在严重污染的情况下,移栽的植物存活率只有60%,而直接播种则达到了90%,说明在实际修复工作中采用直接播种的方法是较为妥当的。我们监测了构建植物-外源微生物耦合系统后42天内的植物生长高度变化,发
参考文献：
[1]. 蒽高效降解菌的选育及其增强型绿色荧光蛋白标记[D]. 王海. 武汉大学. 2004
[2]. 构建蒽高效降解遗传重组菌的研究[D]. 魏明宝. 武汉大学. 2004
[3]. 耦合系统融合子在黄麻根际存活能力及植物生长的研究[D]. 邓欢欢. 武汉大学. 2004