长沙医学院 湖南长沙 410219
【摘 要】目的 探讨葱白提取物对金黄色葡萄球菌生成膜的具体影响。方法 96孔金黄色葡萄球菌根据处理方法不同分为7组，分别是空表对照组（加入生理盐水）、条件对照组（加入浓度为0.016mmol/L的万古霉素）、实验1组（加入浓度为0.004mmol/L的葱白提取液）、实验2组（加入浓度为0.004mmol/L的葱白提取液）、实验3组（加入浓度为0.016mmol/L的葱白提取液）、实验4组（加入浓度为0.032mmol/L的葱白提取液）、实验5组（加入浓度为0.064mmol/L的葱白提取液），比较7组金黄色葡萄球菌药敏试验结果、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度、最小生物膜清除浓度的统计学差异。结果 SEM观察可以看见钛合金表面细菌聚集成团，大小形态不一，结构致密，葡萄球菌菌体周围被粘液样物质包绕，形成浓厚的云雾样生物膜；五组金黄色葡萄球菌和条件对照组的MIC、MBC、MBEC的差异显著（P<0.05），实验组MIC、MBC、MBEC显著低于条件对照组，实验组随着浓度越高，MIC、MBC、MBEC值越低。 结论 葱白提取物对金黄色葡萄球菌生物膜形成具有一定抑制效果，浓度越高抑菌效果越明显，而细菌生物膜形成受阻。
【关键词】葱白提取物；金黄色葡萄球菌；生物膜
自21世纪以来，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus SA）迅速成为国内外人畜感染的重要致病菌，造成严重的感染和发病，随着人畜抗生素的滥用，多重耐药菌，甚至“超级细菌”产生的报道逐年增多。细菌对抗菌药物耐药已成为世界难题，细菌耐药性仍呈现增长趋势[1]。2015年的中国细菌耐药监测（CHINET）报告中显示，从我国20所医院中所分离培养出的革兰氏阳性菌菌株26481株[2]，其中多见为金黄色葡萄球菌和肠球菌属[2]。为了能够有效的预防金黄色葡萄球菌的危害，其理想的药物、剂量、疗程仍不是很明确，且尚无特效治疗药物。因此，全面系统的探究金黄色葡萄球菌的致病机制及研究和开发特异性的新型治疗致病菌的药物是目前研究的热点。
1 对象与方法
1.1实验菌株：
96孔金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）。
培养基和菌液的制备：营养肉汤，取蛋白胨9.0g/L，牛肉粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，共计18g，调制pH至7.5，使其溶解于1mL蒸馏水中，加热至沸腾使其溶解，经高压蒸汽灭菌（121℃，20min）备用。营养琼脂：取蛋白胨9.0g/L，牛肉浸膏3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂1.0 g/L，共计18g，调制pH至7.0，使其溶解于1mL蒸馏水中，加热至沸腾使其溶解，经高压蒸汽灭菌（121℃，20min）备用。菌液的制备 在营养琼脂固体培养皿中接种金黄色葡萄球菌菌株，活化24h，挑取单菌落于固体斜面培养基，37℃培养24h，洗脱，并稀释至1×10^7CFU/mL菌液备用[3]。
1.2葱白提取物的提炼
将葱白提取物（由湖南山检测有限公司通过冷冻干燥和超临界C02萃取，生产批号：2018023116）溶于- 80℃配成0.07%的混合液；培哚普利（8 mg/片）碾碎后溶于蒸馏水，经超声波处理溶解后制备成0. 07%的混合液。
1.3分组方法
空表对照组13孔金黄色葡萄球菌仅加入生理盐水、条件对照组13孔金黄色葡萄球菌加入浓度为0.016mmol/L的万古霉素、实验1组加入浓度为0.004mmol/L的葱白提取液、实验2组加入浓度为0.004mmol/L的葱白提取液、实验3组加入浓度为0.016mmol/L的葱白提取液、实验4组加入浓度为0.032mmol/L的葱白提取液、实验5组加入浓度为0.064mmol/L的葱白提取液。
1.4数据采集
采用纸片扩散法（K-B法）和VITEK -2全自动微生物药敏试验系统进行药敏试验。结果按照美国临床试验室标准化委员会（CLSI）标准判定。同时，对最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）进行检测，运用液体稀释法测定，具体操作如下：在96孔细胞培养板中，用液体培养基等倍稀释小檗碱药液（浓度为0.8 mg/mL-0.0125mg/mL），每孔加稀释小檗碱药液100 pdL，每孔加10 pdL供试菌液，37℃培养24 h后．以MTT法检测各孔600 mn波长下吸光度值。同步设培养基对照孔、菌液对照孔、药液对照孔。在培养基对照孔无菌生长和菌液对照孔有菌生长的情况下，分析判断实验孔结果。以完全无细菌生长的最低浓度作为药物对该菌的最低杀菌浓度（MBC），以OD值突然升高前的临界值为药物最低抑菌浓度（MIC）。考虑到药物本身有颜色，实验结果的OD值为去掉药物本底OD值后的余值。同时进行最小生物膜清除浓度（MBEC）的测定，运用96孔酶标板结晶紫法测定，具体操作如下：在96孔细胞培养板中，用液体培养基等倍稀释葱白提取物药液（稀释浓度为0.8 mg/InL-0.025 mg/InL），每孔先加稀释葱白提取物药液100 μL，再加100μL供试菌液，37℃培养24 h后，去掉孔内菌液，用生理盐水洗3次培养板，并于每孔加人1%的结晶紫100 lL，室温孵育1 inin，再加人30%的乙酸脱色5 min，于595 mn波长下测吸光度值。同步设培养基对照孔、菌液对照孔。在培养基对照孔无生物膜形成和菌液对照孔有生物膜形成的情况下。分析判断实验孔结果。以OD值突然升高前的临界值为药物最小生物膜清除浓度（iniiiunum biofilm eradication concen-tration，MBEC）。
1.5统计分析
数据库处理应用SPSS22.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料用（）表示，多组之间比较用独立样本F检验，两两组别之前比较用SNK法进行t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 金黄色葡萄球菌生物膜形成能力
空白对照组底部的结晶紫染色没有观察到附着染液，板孔呈透明色。金黄色葡萄球菌组有生物膜形成时，板孔因形成生物膜的厚薄不同，染色后在板孔底部呈现不同程度的紫色附着物，裸眼可见孔底的紫色附着物表明不同临床株间的附着能力不同。结果见图。图中孔1和孔2为空白对照组，底部染色后没有观察到附着染液，板孔呈透明色。孔3~10为金黄色葡萄球菌组，有生物膜形成，其中孔4及孔5部分区域有片状紫色附着物，部分区域观察不到紫色附着物；孔3和孔8部分区域孔底部有明显的深紫色，比正常染色颜色稍深；孔6、孔7、孔9和孔10整个底部均有紫色附着物，但部分区域颜色偏深，部分区域颜色偏浅。SEM观察可以看见钛合金表面细菌聚集成团，大小形态不一，结构致密，葡萄球菌菌体周围被粘液样物质包绕，形成浓厚的云雾样生物膜。
2.2 五组金黄色葡萄球菌MIC、MBC、MBEC的比较
五组金黄色葡萄球菌和条件对照组的MIC、MBC、MBEC的差异显著（P<0.05），实验组MIC、MBC、MBEC显著低于条件对照组，实验组随着浓度越高，MIC、MBC、MBEC值越低，见表1。
表1 五组金黄色葡萄球菌MIC、MBC、MBEC的比较
注：与条件对照组比较aP＜0.05，与实验1组比较bP＜0.05，与实验2组比较cP＜0.05，与实验3组比较dP＜0.05，与实验4组比较eP＜0.05
3.讨论
金黄色葡萄球菌生物膜的形成是一个复杂动态过程，Moormeier和Bayles[3]将生物膜形成过程分为五个阶段：黏附、聚集、分离、成熟、脱落。且有证据万古霉素对耐药性金黄色葡萄球菌作用在不断减弱，金黄色葡萄球菌对万古霉素的作用机制为包括如下几点：细胞壁增厚；肽聚糖交换减少；耐药基因转换等[4]。随着细菌膜的增厚和成熟，对外界的抵抗能力增强，接受抗生素的能力逐渐减弱，使其产生耐药性，成熟生物膜部分脱落释放出细菌，这些浮游菌遇到适宜表面时继续附着、发展、成熟，形成循环，因此生物膜的形成是一个动态过程。
论文作者:杨炎明,何俊杰,蒋璨,贺气志
论文发表刊物:《中国结合医学杂志》2018年11期
论文发表时间:2019/1/18
标签：葡萄球菌论文; 浓度论文; 葱白论文; 金黄色论文; 生物论文; 培养基论文; 细菌论文; 《中国结合医学杂志》2018年11期论文;