长沙医学院临床学院 湖南 长沙 410219
摘要：目的 探索miR-185在胶质母细胞瘤增殖、凋亡中的机制。方法用Target scan human在线软件预测miR-185调控的靶基因；采用荧光素酶报告载体系统检测miR-185对M2型丙酮酸激酶（PKM2)3'UTR荧光酶活性的影响；蛋白质印迹法检测miR-185对PKM2蛋白表达的影响。将胶质母母细胞瘤细胞分为观察1组、对照1组、观察2组、对照2组、观察3组。观察1组转染miR-185 mimics,对照1组转染Scramble;观察2组转染PKM-snRNA,对照2组转染Control-siRNA;观察3组转染miR-185 inhibitors与PKM-snRNA。采用MTT法检测上述5组细胞增殖能力，采用AnnexinV-FITC和Pi染色法检测上述5组细胞凋亡率。结果在线预测软件发现miR-185与PKM2的3'UTR有共同的结合位点，荧光素酶报告载体系统显示在脑胶质母细胞瘤细胞中miR-185能抑制Wild4-KM2。报告质粒组荧光素酶的活性,Western blotting结果显示miR-185能下调胶质母瘤细胞中PKM2蛋白表达，证实PKM2是miR-185直接调控的靶基因；MTT结果显示，观察1组与观察2组胶质母瘤细胞OD值分别为0.446±0.034,0.472±0.028,与对照1组（0.649±0.041)和对照2组（0.610±0.023)相比，差异均有统计学意义（P均<0.05)。观察3组的OD值为0.606±0.016,与对照1组或对照2组相比，差异均无统计学意义；凋亡实验结果显示，观察1组与观察2组胶质母瘤细胞凋亡率分别为（29.13±2.04)%、(27.46±1.95)%,对照1组、对照2组分别为（8.76±0.53)%、(8.51±0.47)%,观察1组、观察2组与对照1组、对照2组比较,P均<0.05。观察3组的凋亡率为（9.47±0.61)%,与对照1组或对照2组相比,差异均无统计学意义。结论 miR-185可抑制人胶质母瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡;机制可能是通过下调PKM2表达实现。
关键词：胶质母瘤;微小miR-185;PKM2;细胞增殖;
miRNAs是一类非编码的小RNA分子，其与靶mRNA以碱基互补配对原则结合，使翻译抑制或mRNA降解,从而在转录后水平调控基因表达。最近大量研究显示，miRNAs在胶质母瘤生长调控中发挥重要作用。Cinzia等[1]研究证实有12个miRNAs表达特征与胶质母瘤的转移相关,且能预测胶质母瘤患者的生存和复发,其中一个就是miR-185。研究证实[2]miR-185在多种肿瘤中低表达，且类似抑癌基因样作用。Saeid等[3]研究显示，miR-185能抑制胶质母瘤细胞增殖与侵袭，且miR-185在胶质母瘤中低表达与患者的高复发和低生存率相关。M2型丙酮酸激酶(PKM2)是糖酵解过程中的关键限速酶，其功能是催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)产生丙酮酸。研究显示[4],PKM2在胶质母瘤、前列腺癌、肝癌等肿瘤中能促进有氧糖酵解与肿瘤的发生。Uğurel Elif等[5]研究发现,miR-185通过靶向调控PKM2抑制胶质母瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。而miR-185与PKM2在胶质母瘤中的生物作用和相关机制目前尚未完全阐明。本研究通过在线软件预测、荧光素酶报告载体及Western blotting等技术探讨PKM2与miR-185的关系，并进一步分析miR-185在胶质母瘤中的生物学作用及相关分子机制。
1材料与方法
1.1材料 胶质母瘤细胞由湖南肿瘤研究所提供,细胞经胰蛋白酶消化后置于DMEM/F12培养基中终止消化，吹打并计数，接种在培养皿中，放在孵育箱中培养7d，进行分组。Lipo-fectamine2000转染试剂购自山东康普森生物技术有限公司，miR-185 mimics、inhibitors及Scramble购自山东中杉金桥生物技术有限公司，PKM2 siRNA质粒购自山东博奥森生物技术有限公司，PKM23'UTR的各种报告基因（Wild-PKM2-3'UTR vector, Mut-PKM2-3'UTR vector)、双报告基因载体由生工生物工程(上海)股份有限公司构建，双荧光素酶活性检测试剂盒购自南京诺尔曼生物技术有限公司，PKM2抗体和p-actin抗体购自上海三维生物技术有限公司，PRIM1640培养基和小牛血清购自普莱柯生物工程股份有限公司，MTT粉购自浙江弘哲生物技术有限公司。
1.2miRNA和质粒瞬时转染消化细胞并吹打制成5X104个细胞/mL的悬液,按2mL/孔铺至6孔板内，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养至细胞汇合度达30%-50%时用于转染。在无菌EP管中配好Lipofectamin2000及待转染试剂；室温放置20min,使脂质体与DNA形成复合体。用无血清培养液轻轻洗涤待转染细胞,加入无血清RPMii640 1mL,然后将孵育好的载体和脂质体的混合溶液加至6孔板中，将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养,转染6h后换成RPMii640完全细胞培养基继续培养48h。
1.3 靶基因在线预测及荧光素酶活性检测打开。Target scan human 软件(http://www.targetscan.org/),在物种中选择人类,在相应miRNA文本框中选择miR-185,然后提交，系统自行运行后出现该miRNA可能调控的基因。培养胶质母瘤细胞,将胶质母瘤细胞分为实验1、2、3、4组，实验1组转染miR-185与Wild-PKM2,实验2组转染Scramble与Wild-PKM2,实验3组转染miR-185与Mut-PKM2,实验4组转染Scramble与Mut-PKM2,48h后收获细胞。按照南京诺尔曼生物技术有限公司双荧光素酶活性检测试剂盒说明书操作,用单光子检测仪检测细胞荧光素酶活性。计算相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。每组实验重复3次。
1.4 PKM2蛋白表达检测采用Western blotting法。将胶质母瘤细胞接种到24孔板中，分别转染miR-185 mimics与Scramble序列,48h后收集细胞,并提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。各组取等量样本,进行SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭，加入PKM2抗体或Pectin抗体,4℃过夜。TBST洗膜30min,加入二抗室温孵育1h,TBST洗膜30min,然后加ECL发光剂,X线片曝光、显影、定影。
1.5细胞增殖能力检测采用MTT法。将胶质母瘤细胞分为观察1组、对照1组、观察2组、对照2组、观察3组。观察1组转染miR-185 mimics,对照1组转染Scramble;观察2组转染PKM2-siR-NA,对照2组转染Control-siRNA;观察3组转染miR-185inhibitors与PKM2-siRNA,培养48h,收获细胞。消化各组细胞,取200μL即5x103个细胞接种于96孔板中，设复孔6个,培养至近饱和，每孔加20μL MTT液，孵育4h,每孔中加入DMSO 150μL,低速振荡10min,选择波长为570nm,于酶标仪上测定各孔0D值,实验重复3次。0D值代表细胞增殖能力。
1.6细胞凋亡检测采用AnnexinV-FITC/Pi染色法。细胞分组同MTT法,收集各组培养至80%左右汇合度的细胞，用PBS液洗涤细胞2次,离心，取约1x106个细胞，加入100μL的结合缓冲液悬浮细胞。加AnnexinV-FITC 5μL混匀，再加PIi1μL混匀。室温下避光反应15-30min,上机,流式细胞仪检测。
1.7统计学方法采用SPSS21.0统计软件。计量资料以x±s表示,两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1荧光素酶活性及PKM2蛋白表达比较在线预测软件（Target scan human)预测发现miR-185与PKM2有共同的结合位点。荧光素酶活性检测结果显示，实验1、2、3、4组胶质母瘤细胞荧光素酶活性强度分别为0.582±0.051、0.973±0.053、0.880士0.032、.970±0.020,实验1组与实验2组比较，P<0.01;实验3组与实验4组比较差异无统计学意义。表明miR-185mimics对突变型MutPKM2质粒组荧光素酶活性强度无明显影响，但能明显抑制野生型Wild-PKM2报告质粒组荧光素酶活性。West-ern blotting结果显示，在胶质母瘤细胞中转染miR-185 48h后PKM2蛋白相对表达量为0.437士0.015,较转染Scramble者(1.204±0.183)明显下调（P<0.01)。结果均支持PKM2是miR-185直接调控的靶基因。
2.2各组胶质母瘤细胞增殖能力比较 MTT结果显示,观察1组与观察2组胶质母瘤的OD值分别为0.446±0.034、0.472±0.028,与对照1组(0.649±0.041)和对照2组(0.610±0.023)相比，差异均有统计学意义（P均<0.05)。观察3组的OD值为0.606±0.016,与对照1组或对照2组比较差异均无统计学意义。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆在胶质母瘤细胞中外源高表达miR-185或沉默PKM2的表达，均能明显抑制胶质母瘤增殖，而miR-185inhibitors可拮抗si-PKM2对胶质母瘤细胞的增殖抑制作用。
2.3各组胶质母瘤细胞凋亡情况比较凋亡实验结果显示,观察1组与观察2组胶质母瘤细胞凋亡率分别为（29.13±2.04)%、27.46±1.95)%,对照1组、对照2组分别为（8.76±0.53)%、(8.51±0.47)%,观察1组、观察2组与对照1组、对照2组比较,P均<0.05;观察3组的细胞凋亡率为（9.47±0.61)%,与对照1组或对照2组相比，差异均无统计学意义。在胶质母瘤细胞中外源高表达miR-185或沉默PKM2表达,均能明显诱导胶质母瘤细胞发生凋亡，而miR-185 inhibitors可拮抗si-PKM2对胶质母瘤细胞的凋亡诱导作用。
3 讨论
胶质母瘤的病理分级越高，侵袭性越强，肿瘤组织与正常脑组织的界限就越模糊，手术不易切除，对放疗、化疗的耐药性更高。其血管丰富、浸润性生长及高复发率等生物学行为使胶质母瘤患者的预后一直很差，这是长期影响神经外科发展的重大难题，早期手术是胶质母瘤患者的主要治疗手段，但遗憾的是大部分患者在确诊时已达晚期阶段。此外,胶质母瘤对多种化疗方案高度耐药,诸多患者死于癌症复发。因此,新的治疗策略开发迫在眉睫。近年来，大量研究表明miRNA在胶质母瘤发生发展中起重要调控作用，进一步研究其相关调控机制可能为胶质母瘤的治疗干预提供新的靶点[6]。在肿瘤发生中，miRNA通过调控其特定靶基因发挥癌基因或抑癌基因样作用。在肿瘤中高表达的miRNAs通过下调肿瘤抑制基因参与肿瘤的形成。然而,在肿瘤中表达缺失的miRNAs往往使癌基因表达上调[7]。miRNA在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，其主要原因[8]：①miRNA在肿瘤中的表达水平明显异于正常组织和血液;②miRNA在体内外表达调控能修饰肿瘤的表型。miRNA在不同肿瘤中的功能关键与其调控的靶点相关。大量研究表明[9-11],miR-185在多种肿瘤组织或细胞中表达下调，包括胶质母瘤,并在肿瘤细胞的增殖、转移及凋亡过程中发挥重要作用。miR-185在前列腺癌通过靶向雄激素受体抑制肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭。miR-185在胶质母瘤中通过直接靶向DNMT1、RhoA及CDC42抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭[12]。miR-185在乳腺癌中靶向调控c-Met,抑制乳腺癌细胞的增殖。miR-185在胶质母瘤细胞中低表达与患者复发、生存时间相关,即低表达者复发率高且生存时间短,而高表达者则相反[13]。Qadir等[14]研究发现，miR-185在胶质母瘤细胞中通过靶向DNMT1/PTEN/Akt通路抑制肿瘤细胞生长。本研究结果发现，在胶质母瘤细胞中高表达miR-185不仅能抑制肿瘤细胞增殖，还能诱导肿瘤细胞凋亡。
最初研究发现PKM2在胚胎组织中表达，而近年研究发现PKM2在肿瘤组织中亦高表达。研究显示[15]，PKM2在多种肿瘤中高表达，包括胶质母瘤，且PKM2在胶质母瘤中高表达与患者不良预后相关。Kefas等[16-17]在胶质母瘤细胞中用siR-NA特异性敲低PKM2,发现细胞的增殖、侵袭及存活率明显降低。此外，沉默PKM2后还能抑制胶质母瘤细胞的新陈代谢，谷胱甘肽和ATP水平明显降低[18]。PKM2在前列腺癌中高表达，在前列腺细胞中沉默PKM2能明显抑制细胞的增殖能力[19]。PKM2在乳腺癌中高表达，其高表达与乳腺癌患者的预后相关，且能促进乳腺癌干细胞的自我更新与成球能力，其机制可能与Wnt/β-catenin通路相关[20]。PKM2在胃癌中高表达，而外源高表达miR-let-7a能下调PKM2表达水平，并通过靶向调控PKM2从而抑制胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭[21]。本研究通过在线预测软件与荧光素酶报告载体证实PKM2是miR-185调控的直接靶基因。在胶质母瘤细胞中沉默PKM2能抑制胶质母瘤细胞的增殖并诱导凋亡，而将miR-185抑制剂与siRNA-PKM2共同转染于胶质母瘤细胞,能逆转胶质母瘤细胞的增殖抑制与凋亡诱导作用；说明miR-1855可能通过靶向调控PKM2抑制胶质母瘤细胞的增殖与诱导凋亡。上述结果以PKM2为靶点揭示了miR-185在胶质母瘤中的抑瘤机制，为今后miR-185的治疗干预提供了新的切入点。
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论文作者:黄震宇,连天,李远翰
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第06期
论文发表时间:2019/5/22
标签：胶质论文; 细胞论文; 转染论文; 肿瘤论文; 荧光论文; 凋亡论文; 基因论文; 《医师在线（学术版）》2019年第06期论文;