刘小方[1]2000年在《溃疡性结肠炎患者肠粘膜及外周血淋巴细胞表型与功能研究》文中研究指明背景与目的 溃疡性结肠炎是一种结肠黏膜的慢性非特异性炎症，普遍认为免疫因素在其发病中起主要作用，其中肠黏膜免疫较外周血更能反映病变局部的情况。业已肯定Th1／Th2比例失衡参与了疾病的发生发展过程，确定Th1／Th2．比例对阐明疾病的确切发病机制及免疫防治均具有重要意义。目前，克隆病作为一种Th1型炎症的观点已被普遍接受，而UC中Th1／Th2比例尚无定论。淋巴细胞细胞毒性免疫反应的两个主要机制中，穿孔素途径是否参与了UC的发病尚未明确。 本研究在改进LPMC分离方法的基础上，对UC肠黏膜LPMC及外周血PBMC中淋巴细胞亚群比例变化与穿孔素在UC病变肠黏膜中的表达进行了研究，以期明确UC中Th1／Th2比例及穿孔素在UC发病中的作用。材料与方法 在19例活动期UC患者病变部位、12例大肠癌患者手术切除肠段的正常黏膜各取10块活检标本，分离LPMC，用双色、三色荧光流式细胞术对LPMC中T、B细胞百分比及CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞百分比进行检测，用三色荧光细胞内细胞因子染色法对Th1／Th2比例进行检测，并用
刘香[2]2007年在《溃疡性结肠炎患者外周血调节性T细胞功能状态的研究》文中认为前言炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一组累及胃肠道的自身免疫性疾病，包括溃疡性结肠炎(uclerative colitis，UC)和Crohn病(Crohn’sdisease，CD)。近年来，炎症性肠病(IBD)尤其是溃疡性结肠炎的发病率呈逐年上升趋势。其病因、发病机制目前仍不明确，认为与免疫、环境、感染及遗传等多种因素相互作用有关，其中免疫因素在IBD发病中起着重要作用，且已成为研究热点。炎症性肠病由过强的免疫反应所介导，T淋巴细胞在其中起重要作用，但T胞介导的免疫失耐受机制不很清楚。机体内存在以抑制免疫反应为主要功能特点的较独立的CD4~+T淋巴细胞亚群(现倾向于称为调节性T淋巴细胞，Treg)，其中CD4~+CD25~+T细胞是目前所认识的最重要的一群，调节性T淋巴细胞／致病性T淋巴细胞平衡是机体调节免疫反应的重要模式之一，其紊乱可能是很多自身免疫性疾病的发病机制。过强的免疫反应可由致病性T细胞(促炎促免疫T细胞)原发性功能增强引起，也可能由调节性T细胞免疫抑制功能原发性下降所引起。研究调节性T细胞在病人机体内的功能状态，回答炎症性肠病的发病是否与调节性T淋巴细胞的抗原特异性免疫抑制功能缺陷有关是值得尝试的。从正常人和UC患者外周血中收集并分离淋巴细胞和单核细胞，用自体肠道菌群制作成抗原，在体外培养中刺激淋巴细胞，然后检测代表调节性T细胞的表型CD25、CD152、CD45RB(CD45RO)，转录因子FOXP3，以及细胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4等，能够初步的评介出调节性T细胞的在UC中的数量及功能状态。材料与方法一、材料研究对象均来源于于中国医科大学盛京医院内镜中心做电子肠镜检查者。对照组15例，男8例，女7例，年龄20-57岁，平均36岁；溃疡性结肠炎(UC)组23例，男14例，女9例，年龄16-55岁，平均33岁。二、主要试剂及仪器Human Regulatory T Cell Staining Kit，CD4(7E14)-FITC／CD25(1TYV)-PECocktail，抗人CD45RO(UCHL1)／Biotin和CD152／Biotin，ELISA Kit，考马斯亮蓝总蛋白定量试剂等。流式细胞仪、低速低温离心机、CO_2孵箱、超声细胞破碎仪、酶标仪、可见光分光光度计等三、淋巴／单核细胞分离用肝素抗凝管采外周血10mL，10min内用RPMI1640(含10mmol／LHEPES，100kU／L青霉素、30mg／L庆大霉素)10mL稀释后加入2个15mL离心管，用连接6号加长针头的注射器抽Lympholyte-H(1．077 kg/L)，每管4mL缓慢加在稀释血液下面，1200r／min离心20min，取灰白层单个核细胞悬液，PBS洗2次，用5mL RPMI1640(含100mL／L胎牛血清，HEPES及双抗)混悬细胞，将低密度Percoll(1．068kg/mL，335mmol／L)4mL和高密度Percoll(1．080 kg/mL，335mmol／L)2mL分层铺在细胞悬液下面，2000 r／min离心15min，取低密度Percoll中段以上及至高密度Percoll中段的细胞悬液，分别作为单核细胞和淋巴细胞，PBS洗2次，苔盼蓝染色计数活细胞均在96％以上，取细胞悬液作离心涂片，Wrights-Giemsa染色鉴定，淋巴细胞和单核细胞的纯度分别在97％和90％以上。四、肠道菌群抗原的制作肠镜下取大肠标本，将其表面所带细菌接种到50ml疱肉培养基中，液体石蜡封闭，37℃培养48小时，离心、超声破碎及考马斯亮蓝法测细菌抗原总蛋白浓度。五、细胞培养培养基为约含10％自身血浆的RPMI-1640，滤除去血小板，用含双抗(100μ／ml青霉素+30μg／ml庆大霉素)、10mM HEPES及0．05mMβ-ME的RPMI-1640稀释后作为完全培养基。单核细胞以1×10~5个／孔加入96孔板，并以20μg／ml加入自身来源的肠道厌氧菌群抗原，对照孔不加细菌抗原，16小时后每隔2小时半量换液一次，共4次，以稀释除去细菌抗原，然后按8×10~4／孔加入自身的淋巴细胞，隔天半量换液一次。六、流式细胞术分离第2天及混合培养第14天的淋巴细胞用于流式细胞检测CD4、CD25、CD45RO、CD152及FOXP3的表达，操作按照试剂盒说明。七、ELISA培养上清液中细胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4的浓度用ELISA检测，按照说明操作。八、统计分析所有数据均用Mean±SD表示，计算用SPSS11．5完成，比较采用独立样本的t检验，P<0．05和P<0．01被认为分别具有统计学意义和显著意。结果一、淋巴／单核细胞的分离效果及鉴定淋巴和单核细胞计数在96％以上，淋巴细胞的纯度为95％以上，单核细胞的纯度在85％以上，从12ml人外周血中分离出1．23±0．33×10~7个淋巴细胞和1．76±0．71×10~6个单核细胞。二、未刺激淋巴细胞CD4、CD25和FOXP3的表达外周血淋巴细胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3的表达在对照组和溃疡性结肠炎组间无明显差别。约60％的CD25~+细胞同时表达FOXP3，85％的CD25~(hi)细胞同时表达FOXP3。无论在对照组还是UC组，CD25~(hi)和FOXP3的表达具有非常显著的相关性(P<0．001)。三、未刺激淋巴细胞CD4、CD25、CD45RO、CD152的表达约91％的CD4~+CD25~+T细胞同时表达CD45RO，CD152在CD4~+T细胞膜表面很少表达(约占1％)。对照组与UC组新鲜分离外周血淋巴细胞在CD45R0和CD152的表达上没有显著差别。四、淋巴细胞在体外培养中经自身肠道菌群抗原刺激后，细胞总数均增加(与未刺激比较，对照组和UC组分别平均增加21％和52％，均P<0．001)。CD4~+T细胞的比例在对照组和UC组均明显上升(P<0．001)，而FOXP3~+、CD25~+FOXP3~+及CD25~(hi)FOXP3~+T细胞的比例变化不大。值得注意的是，无论CD4~+CD25~+FOXP3~+T细胞占CD4~+CD25~+T细胞的比例，还是CD4~+CD25~(hi)FOXP3~+T细胞占CD4~+CD25~(hi) T细胞的比例，在两组的所有研究对象中均呈下降趋势(均P<0．05)。五、溃疡性结肠炎组外周血淋巴细胞对自身肠道菌群抗原体外刺激的增殖比对照组高(P<0．001)，CD25~+或CD25~(hi)T细胞中FOXP3~+细胞的比例在刺激后UC组明显低于对照组(40．18％vs52．3％或53．90％vs 77．85％，均P<0．001)。六、外周血淋巴细胞与自身肠道厌氧菌群抗原刺激的单核细胞混合培养后，由单核细胞表达的IL-6和TNF-α在UC组明显高于对照组(P<0．01)。讨论调节性T细胞(Treg)以调节自身T细胞反应为主要功能。CD4~+CD25~+Treg细胞是目前研究较为深入的调节性T细胞亚群，分为天然Treg(natural Treg)和获得性Treg(adaptive Treg)。天然CD4~+CD25~+Treg细胞由胸腺中T细胞发育而来，在正常人和小鼠的外周血和脾组织的T细胞中约占5％～10％，在维持机体免疫自稳，调控免疫应答方面起重要作用。CD4~+CD25~+Treg细胞固有的表达IL-2αR(CD25)、IL-2βR(CDl22)、CILA-4(CD152)、GITR及高水平的CD44和中／低水平的CD45RB，Foxp3(鼠类为Foxp3)／FOXP3(人类为FOXP3)是特异性表达在CD4~+CD25~+Treg细胞上。本研究发现：外周血中淋巴细胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3的表达在对照组和溃疡性结肠炎组间无明显差别，表明IBD患者外周血中CD4~+CD25~+Treg保持了他们的抑制活性。约60％的CD25~+T细胞同时表达FOXP3，85％的CD25~(hi)细胞同时表达FOXP3。无论在对照组还是UC组，CD25~(hi)和FOXP3的表达具有非常显著的相关性(P<0．001)。FOXP3被认为是CD4~+CD25~+Treg细胞的特异性分子标记物，对CD4~+CD25~+Treg发挥功能是必需的，是Treg发育的一个重要开关，并为从分子水平揭示CD4~+CD25~+Treg细胞的发育及功能提供了新的研究途径。CD45RO~+细胞代表已经抗原刺激而分化的功能细胞，称为记忆性T细胞，为了探索CD4~+CD25~+Treg细胞与记忆性T细胞的关系，我们同时检测了CD4、CD25和CD45RO的表达。发现约91％的CD4~+CD25~+T细胞同时表达CD45RO，说明CD4~+CD25~+Treg细胞主要存在于记忆性T细胞池中，提示曾被接受过抗原刺激，其只占记忆性T细胞的1／5。活动期IBD患者肠粘膜记忆性T淋巴细胞的CD45RO~+表达增加，而且肠粘膜淋巴细胞表达早期激活抗原增加，这说明IBD患者肠粘膜T淋巴细胞的活性增强，免疫反应性增强。CILA-4(CD152)是重要的负向协同刺激分子配体，参与免疫反应的负向调节，自然产生的CILA-4~+(CD152)GITR~+CD25~+T细胞亚群对自身免疫性疾病有很强的抑制功能。我们的检测发现CD4~+T细胞膜表面很少表达CD152(约占1％)。对照组与UC组新鲜分离外周血淋巴细胞在CD45R0和CD152的表达上没有显著差别。免疫反应异常是IBD主要发病机制之一。正常个体大部分肠黏膜T细胞的主要刺激源于正常菌群，正常菌群抗原穿透黏膜固有层并持续存在，便会引起炎症性肠病(IBD)。在无菌环境下，给小鼠回输缺少CD4~+CD25~+Treg细胞不会引起IBD的发生，由此可见CD4~+CD25~+Treg细胞主要抑制过度抗病原体免疫，从而抑制对宿主过度的免疫病理损伤。我们用自身肠道菌群制备成抗原，与自体淋巴细胞混合培养，发现所有研究对象的淋巴细胞在体外培养中，经自身肠道菌群抗原刺激后，细胞总数均增加，CD4~+T细胞的比例在对照组和UC组均明显上升，而FOXP3~+、CD25~+FOXP3~+及CD25~(hi)FOXP3~+T细胞的比例变化不大，CD4~+CD25~+FOXP3~+T细胞占CD4~+CD25~+T细胞的比例及CD4~+CD25~(hi)FOXP3~+T细胞占CD4~+CD25~(hi)T细胞的比例，在两组的所有研究对象中均呈下降趋势。CD25~+或CD25~(hi)T细胞中FOXP3~+细胞的比例在刺激后UC组明显低于对照组。提示活化增殖的细胞中主要是CD4~+CD25~+FOXP3~-反应性T细胞，而不是CD4~+CD25~+FOXP3~+调节性T细胞，尤其明显见于溃疡性结肠炎组，说明UC的发病可能与调节性T细胞数量减少或功能障碍有关。肠抗原物质刺激和激活淋巴细胞和／或巨噬细胞，都能合成和分泌一些致炎介质，即促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子，二者之间的平衡失调是IBD的另一个重要发病机制。促炎性细胞因子IL-6是炎症反应中重要细胞因子，主要参与T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活。给严重免疫缺陷综合症小鼠注入IL-6R单克隆抗体，在输入CD45RB~(high)T细胞后，可以免得结肠炎；IL-6缺陷小鼠不易感染结肠炎。作为一种炎性蛋白，TNF-α在IBD发病中的作用是使炎性细胞聚集到局部炎症组织导致水肿，并参与肉芽组织形成。IBD患者肠道组织炎症与IL-1β、IL-6、TNF-α高表达相关。本研究中，由单核细胞表达的IL-6和TNF-α在UC组明显高于对照(P<0．01)，作为Th1细胞标记的IFN-γ、Th2标记的IL-4及重要的免疫抑制性细胞因子IL-10只低度表达，说明UC发病与促炎和抑炎两类细胞因子的比例失衡有关，UC的肠道炎症反应部分是由IL-6和TNF-α介导的。结论1、外周血中淋巴细胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3及CD45R0和CD152的表达上，在对照组和溃疡性结肠炎组组间无明显差别，UC患者外周血中CD4~+CD25~+Treg保持了他们的抑制活性。2、对照组和UC组外周血CD4~+CD25~+Treg细胞中，CD25~(hi)和FOXP3的表达具有非常显著的相关性，FOXP3是CD4~+CD25~+Treg细胞的特异性分子标记物，对CD4~+CD25~+Treg发挥功能是必需的，是Treg发育的一个重要开关。3、所有研究对象的淋巴细胞在体外培养中，经自身肠道菌群抗原刺激后，细胞总数均增加，活化增殖的细胞中主要是CD4~+CD25~+FOXP3反应性T细胞，而不是CD4~+CD25~+FOXP3~+调节性T细胞，尤其明显见于溃疡性结肠炎组，CD25~+或CD25~(hi)T细胞中FOXP3~+细胞的比例在刺激后UC组明显低于对照组。UC的发病可能与调节性T细胞分化不足或功能障碍有关。4、外周血淋巴细胞与自身肠道厌氧菌群抗原刺激的单核细胞混合培养后，由单核细胞表达的IL-6和TNF-α在UC组明显高于对照组，UC的肠道炎症反应部分是由IL-6和TNF-α介导的。
吕汝西[3]2014年在《CD4+T细胞在溃疡性结肠炎患者外周血的表达及黄芩苷的体外干预作用》文中研究表明研究背景溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)是一种反复发作的慢性非特异性肠道炎症,病变局限在结直肠粘膜层及粘膜下层,以腹痛、腹泻、粘液血便为主要临床特征,与克罗恩病(Crohn's Disease, CD)同属于炎症性肠病(Inflammatory Bowel Diseases, IBD)。IBD主要多发于西方欧美等发达国家,但是随着生活方式的改变,其他国家的发病率在逐年增加,而在亚洲UC发病比CD更为普遍。遗憾的是,尽管目前的治疗手段能够减轻病理性肠道炎症,但是不能改变潜在的免疫紊乱或治愈该病,这样导致患者形成慢性、复发或者加重的状态。中医认为UC的致病因素是湿邪,与肠、肝、肾关系密切,疾病初起以实证为主而见湿热内蕴之候,久则伤脾及肾,入络,由于其病程长,病势缠绵,病变可及脏腑阴阳气血。其病位在肠,病在血分,活动期以湿热型最为多见;缓解期以本虚标实为多见,本虚为脾肾虚弱,标实为湿热。中医经典名方黄芩汤对于UC有良好的疗效,因此,合理开发天然药物复方或单体有望开辟一个治疗UC的新途径。UC的病因和机制仍不完全清楚,多认为遗传和环境因素的相互作用最终导致针对正常菌群组份的过度和失控的粘膜免疫反应是其主要病机。已有研究表明CD4+T细胞与UC的发病密切相关,Th1、Th2、Th17和Treg是其主要亚群。在趋化因子的作用下归巢至结肠是CD4+T细胞诱发UC局部免疫反应的重要步骤。T淋巴细胞的表面粘附分子控制其渗出进入淋巴或非淋巴组织,整合素在其中发挥重要作用,淋巴细胞粘附血管壁部分是由β1整合素(也称CD29)识别其配体VCAM-1控制的。有研究显示VCAM-1在DSS诱导的大鼠结肠炎中升高,免疫阻断后能够缓解肠炎,而我们前期的研究也发现湿热型肠炎大鼠结肠和湿热型UC患者结肠VCAM-1(CD29的配体)表达均升高,UC病变局限于结直肠可能与该部位VCAM-1的高表达并趋化CD4+CD29+T细胞有关。CD4+CD29+T细胞往往在再次免疫应答缺损疾病(如异位性皮炎和慢性肉芽肿病)中下调,而在急性丙型肝炎和牙龈炎等过度的炎症性疾病中比例升高。我们先前研究观察到湿热型UC患者和结肠炎模型大鼠外周血CD4+CD29+T细胞比例升高。因此,我们认为CD4+CD29+T细胞可能与UC的过度免疫反应有关。众所周知,UC是一种顽固的持续或反复复发的一种疾病,即使将UC或CD病变部位手术切除后,在肠道的其他部位仍会复发,而且肠外症状仍会持续存在。因此,有研究者认为长寿命记忆CD4+T细胞可能是导致IBD持续的主要原因。另外,以往多项研究表明以CD29作为记忆性细胞的标志物,并认为CD4+CD29+T细胞是记忆性CD4+T细胞的一种亚型,这些都反映出了,CD4+CD29+T细胞可能与UC的反复发作有密切的联系。由此可见,CD4+CD29+T细胞在UC复杂的免疫反应中扮演着重要角色,但其在UC中免疫作用的研究却极少,也未见到该类细胞在UC中与已知CD4+T细胞亚群之间关系的相关报道。CD4+CD29+T细胞究竟是独立与Th1、Th2、Th17和Treg的一种新CD4+T细胞亚群,还是在特定疾病中以某一或某些亚群为主的细胞群,仍不明确。目前,5-氨基水杨酸(5-amino salicylic acid,5-ASA)类药物是治疗UC的一线用药,60～70%的轻中度患者对其有临床反应。诱导缓解无效时,可加用激素以控制较为严重的症状。免疫抑制剂如环孢素-A(cyclosporine-A、CsA)、硫唑嘌呤类药物和新兴的生物制剂,如英夫利息单抗(infliximab, IFX)和阿达木单抗(Adalimumab, ADA)则用于激素难治性UC的治疗,取得一定效果。然而,这些药物均存在不同程度的胃肠道反应、感染、肿瘤等副作用,导致患者无法耐受,依从性降低。即使患者能够坚持长期用药,仍有部分患者的症状无法得到控制,导致反复复发,最终选择手术治疗。因此,UC的治疗在临床上仍然是一个棘手难题,亟需开发新的治疗途径。随着全球疾病谱和医疗模式发生重要变化,以及大量使用合成药带来的不良反应,开发利用中药、天然药物的呼声正在日益高涨,人们对天然药物维护健康或防治疾病充满了期望。黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分,具有抗炎和调节免疫的作用,有研究表明黄芩苷能够有效抑制Th17细胞的扩增和限制其向肾脏炎症部位的迁移,并且能够抑制脐静脉内皮细胞VCAM-1的表达。说明黄芩苷能够抑制CD4+T细胞某一类或某一些亚群,并限制其迁移至炎症组织。然而,黄芩苷是否对UC患者外周血CD4+T细胞亚群的功能和分化产生影响,还未见相关报道。因此,积极完善相关研究,有利于开辟治疗UC的新途径。综上所述,CD29粘附和记忆的两个特性,切中UC病变局限在结直肠和反复发作的两个重要临床特点,研究CD4+CD29+T细胞的功能及其与Th1、Th2、 Th17和Treg的相互关系,有利于阐明UC反复持续发生的机理。另外,黄芩苷具有抗炎和免疫调节作用,探讨黄芩苷对UC患者外周血T细胞的作用,有望开发出安全有效治疗UC的天然药物。本研究拟从细胞数量、主要转录因子mRNA的表达、主要细胞因子在血清中的表达3个层面分析UC患者外周血各CD4+亚群的表达情况,同时对CD4+CD29+T细胞的数量及与CD4+T细胞各亚群之间的联系进行深入研究,有利于进一步完善UC的免疫学机制。我们同时对黄芩苷体外刺激UC患者外周血T细胞的作用及可能的作用机制进行探讨,对合理开发中药及开辟治疗UC的新途径提供理论依据。目的1.通过流式细胞术及Rt-PCR分析UC患者外周血单个核细胞中CD4+T细胞各亚群(即Th1、Th2、Th17和Treg)的比例,并用蛋白芯片筛查外周血中相关细胞因子的表达。2.了解UC患者外周血单个核细胞中CD4+CD29+T细胞的水平,并探讨与疾病严重程度的相关性；通过流式细胞术圈门技术,分析UC患者外周血CD4+CD29+T细胞水平与CD4+T细胞亚群的关系。3.黄芩苷对UC患者外周血单个核细胞进行体外干预,观察CD4+T细胞相关细胞因子和转录因子的变化情况,探讨黄芩苷对UC患者CD4+T细胞的作用及其作用机制。方法一、UC患者CD4+T细胞亚群及其相关细胞因子的表达1.入选标准及分组：研究纳入2012年9月至2013年4月来南方医科大学南方医院就诊的UC患者(n=26,14名男性,12名女性,年龄32.2±11.0岁)。入选标准参考2012年中华医学会消化病分会炎症性肠病学组会议通过的《我国炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》。同时选21名健康者作为对照(13名男性,8名女性,年龄30.55±10.44)。2.结肠镜检查确定病变范围,并活检肠粘膜常规HE染色,观察组织病理学改变,同时对UC患者疾病活动指数(DAI)进行评分；3.在细胞表面标记物层面,用流式细胞术检测外周血PBMCs、CD4+T细胞亚群(Th1、Th2、Th17和Treg)匕例的改变,我们将IFN-T染色阳性的CD4+T细胞定义为Thl细胞,IL-4染色阳性的CD4+T细胞定义为Th2细胞。IL-17染色阳性的CD4+T细胞定义为Th17细胞。将CD4+CD25+Foxp3+阳性染色的细胞定义为经典Treg细胞。4.在转录因子层面,用Rt-PCR检测外周血PBMCs中CD4+T细胞亚群相关转录因子(T-bet、GATA-3、 RORc和FoxP3)的水平。5.在细胞因子层面,使用美国RayBiotech公司的人Th1/Th2/Th17抗体芯片(QAH-TH17-1)筛选血清中CD4+T细胞相关的细胞因子,并进行半定量分析。6.在微环境层面,使用Rt-PCR检测肠粘膜活检组织中IL-17、IL-23、 IL-10mRNA的变化。二、UC患者外周血CD4+CD29+T细胞与辅助性T细胞的关系1.入选标准及分组：研究纳入2013年7月至2013年9月来南方医科大学南方医院就诊的UC患者(n=16,10名男性,6名女性,年龄28.9±10.2岁)。入选标准参考2012年中华医学会消化病分会炎症性肠病学组会议通过的《我国炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》。同时选16名健康者作为对照,男10名,女6名,年龄28.8±9.91岁。2.结肠镜检查确定病变范围,同时对UC患者疾病活动指数(DAI)进行评分；3.用流式细胞术,观察正常对照组和UC患者外周血中CD4+CD29+T细胞的水平,并分析其与DAI的相关性；4.通过流式细胞技术,以CD4+CD29+设门的基础上,比较UC患者和正常对照组CD4+IFN-γ+(Th1)、CD4+IL-4+(Th2)和CD4+IL-17+(Th17)的水平。三、黄芩苷体外刺激UC患者外周血单个核细胞对IL-23R/Jak2/Stat3通路的影响以中重度UC患者(n=52)和正常健康人(n=12)的外周血单个核细胞(PMBCs)为研究对象。UC的诊断标准及正常对照组的的选择同上。1.UC患者(n=12)和正常对照组(n=12)分离出的PBMCs,用Western Blotting检测UC患者和正常对照组IL23R、JAk-2、Stat-3和Smad蛋白的相对表达水平；2.UC患者分离出PBMCs后,用不同浓度黄芩苷进行刺激培养,细胞培养分组：UC患者(n=44)分离出的PBMCs用于黄芩苷的刺激培养实验,共分为4个组：①对照组(Control组)：DMSO+抗-CD3+抗-CD28刺激组；②黄芩苷低浓度组(BL组)：5μmol黄芩苷+DMSO+抗-CD3+抗-CD28刺激组；③黄芩苷中浓度组(BM组)：20μmol黄芩苷+DMSO+抗-CD3+抗-CD28刺激组；④黄芩苷高浓度组(BH组)：40μml黄芩苷+DMSO+抗-CD3+抗-CD28刺激组。其中DMSO,即二甲基亚砜,为黄芩苷的溶剂；3.用Rt-PCR,观察不同浓度黄芩苷对RORc mRNA的表达和IL-17mRNA的表达的影响；4.用Western Blotting技术,比较不同浓度黄芩苷对IL-23R、JAK2蛋白表达的影响；5.用Western Blotting技术,比较不同浓度黄芩苷对STAT3和Smad蛋白磷酸化的影响；统计学分析本实验采用SPSS16.0统计处理软件进行统计分析。常规进行方差齐性检验,正态性检验。计量资料实验数据以均数土标准差(x±s)表示,单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析。方差齐时,多重比较采用LSD法,方差不齐时进行Welch法校正,采用Dunnett'sT3法进行组间多重比较。正态分布资料的相关分析采用Pearson相关分析。以a=0.05作为检验水准,P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果一、UC患者CD4+T细胞亚群及其相关细胞因子的表达1.实验纳入的UC患者肠镜下表现和HE染色组织病理学特点符合UC的诊断标准；2.UC患者外周血Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)细胞的比例,与对照组相比,差别无统计学意义(t=1.791P=0.095和t=1.174,P=0.260)。Thl7细胞在UC患者外周血中的比例高于对照组,差异具有统计学意义(t=3.421,P=0.008)。而UC患者外周血Treg细胞比例,低于对照组,差异具有统计学意义(t=2.954,P=0.010)；3.UC患者PBMCs中T-bet和GATA-3mRNA的表达与对照组无明显差别(t=1.195, P=0.246; t=0.310, P=0.760)。RORc mRNA的表达高于对照组,差别有统计学意义(t=2.721,P=0.013)。而Foxp3mRNA的表达则低于对照组,差别有统计学意义(t=3.610,P=0.002)；4.使用蛋白芯片发现,在正常对照组和UC组外周血血清中,发现4个有差异的细胞因子,IL-2、IL-10、IL-21和IL-23,他们在UC组的水平均高于对照组,差异均有统计学意义(t=5.631,P<0.001;t=4.539,P<0.001; t=4.767,P<0.001; t=4.639,P=0.001);5.UC患者炎症部位活检组织、非炎症部位和对照组间IL-17、IL-23mRNA的表达差异有统计学意义(F=21.329, P<0.001; F=11.565, P<0.001),其中炎症部位IL-17、IL-23均高于非炎症部位(P<0.001,P<0.001)和对照组(P=0.002,P<0.001),差别具有统计学意义,IL-17、IL-23在非炎症部位与对照组差别无统计学意义(P=0.238,P=0.250)。但IL-10mRNA水平在UC患者炎症部位、非炎症部位和对照组三者间差异无统计学意义(F=0.058,P=0.944)。二、UC患者外周血CD4+CD29+T细胞与辅助性T细胞的关系1. CD4+CD29+T细胞在UC患者外周血中的比例高于对照组,差异具有统计学意义(t=7.142,P<0.001)；2.UC患者外周血CD4+CD29+T细胞水平与其DAI评分呈正相关(r=0.973,P<0.001),相关系数有统计学意义；3.流式分析发现在CD4+CD29+T细胞中,UC患者和正常对照组相比,IFN-y,IL-4的表达水平差异无统计学意义(t=1.619, P=0.119; t=0.526, P=0.640)。然而,IL-17的表达,在UC患者中高于正常对照组,差别有统计学意义(t=3.876,P=0.001)。三、黄芩苷体外刺激UC患者外周血单个核细胞对IL-23R/Jak2/Stat3通路的影响1.与正常对照组相比,UC患者IL-23R, Stat-3的表达升高,差异具有统计学意义(t=5.787, P<0.001; t=3.486, P<0.006)。而Smad的表达降低,差异具有统计学意义(t=2.827, P=0.018)。Jak-2的表达差异无统计学意义(t=0.639,P=0.537)。2. Control组、BL组、BM组、BH组间RORc、IL-17mRNA表达的差异有统计学意义(F=21.080,P<0.001和F=9.854,P<0.001)。BL组与Control组相比,RORc、IL-17mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0722, P=0.143)。而BM.BH组RORc mRNA的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.001,P<0.001),BM、BH组IL-17mRNA的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.002,P<0.001)。3.Control组、BL组、BM组、BH组间IL-23R、JAK-2蛋白表达的差异有统计学意义(F=9.142,P=0.006和F=6.910,P=0.013)。BL组与Control组相比,IL-23R、JAK-2的表达水平差异无统计学意义(P=0.376,P=0.513)。而BM、BH组IL-23R的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.022,P<0.001),而BM、BH组JAK-2的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.040,P=0.003)。4. Control组、BL组、BM组、BH组间p-stat3表达的差异有统计学意义(F=21.047,P<0.001)。BL组与Control组相比,p-stat3的表达水平差异无统计学意义(P=0.08)。而BM、BH组p-stat3的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.033,P<0.001)。四组间p-smad表达的差异有统计学意义(F=8.516,P=0.007)。BL组与Control组相比,p-smad的表达水平差异无统计学意义(P=0.534)。而BM、BH组p-smad的表达,高于对照组,差异具有统计学意义(P=0.043,P=0.002)。结论1.UC患者外周血中Thl7细胞及其主要转录因子RORc mRNA表达水平较对照组明显升高,而Treg细胞及其特异性转录因子Foxp3mRNA表达水平则明显降低,同时发现维持Th17细胞扩增和稳定性的IL-21、IL-23水平也升高,提示UC患者外周血存在Th17/Treg失衡,可能与UC的发病机制有关；2.UC患者炎症部位肠粘膜IL-17、IL-23mRNA高于非炎症部位和对照组,提示IL-23/IL-17通路参与维持Th17致病性；3.UC患者外周血中记忆性CD4+CD29+T细胞的数量增多,且与DAI呈正相关,提示其与UC的发病密切相关;4.UC患者记忆性CD4+CD29+T细胞表面IL-17的表达增多,提示Th17(CD4+IL-17+T)细胞可能是导致UC反复发作的主要“记忆性致病细胞”；5.UC患者PBMCs中IL-23R、Jak-2、Stat-3的表达明显升高,提示IL-23R/Jak2/Stat3通路参与了UC的发生。6.黄芩苷能够抑制UC患者PBMCs中RORc和IL-17A的表达,提示黄芩苷能抑制Thl7的功能,其作用可能是通过下调IL-23R和Jak2,抑制Stat3的磷酸化,上调Smad的磷酸化水平来实现的。
付妤[4]2009年在《Th细胞在IBS和IBD中的表型改变》文中指出第一部分：溃疡性结肠炎患者肠粘膜和外周血中Th细胞表型的改变目的：探讨Th细胞各亚群比例在溃疡性结肠炎发病中的变化及意义。方法：按照2007年济南标准收集UC患者20例，对照组16例。利用细胞内细胞因子染色和四色荧光抗体流式细胞术对UC组患者及对照组中肠粘膜和外周血淋巴细胞作表型分析，比较各组肠粘膜和外周血中Th1、Th2、Th17比例改变，Western blot检测各组肠粘膜IL-4、IL-12、IL-17表达，ELISA检测各组外周血IL-4、IL-12、IL-17水平。结果：(1)UC组患者肠粘膜中Th17比例和IL-17表达较对照组明显增加：Th17比例在UC组和对照组分别为3．75(6．93)vs．1．25(3．70)，P＜0．05；IL-17表达在UC组和对照组分别为0．20(0．15)vs．0．10(0．03)，P＜0．05。UC组患者肠粘膜中IL-17表达与疾病评分呈正相关(r=0．503，P=0．024)。UC中、重度患者外周血中Th17比例和IL-17表达增加：外周血中Th17比例在UC中、重度患者和对照组中分别为1．40(2．15)vs．0．70(0．33)，P＜0．05；外周血中IL-17含量在UC中、重度患者和对照组中分别为1．58(3．37)pg·ml~(-1)vs．0．19(0．64)pg·ml~(-1)，P＜0．05。(2)肠粘膜中Th1的比例在UC和对照组中分别为13．6(16．88)vs．9．10(17．53)；外周血中Th1的比例在UC和对照组中分别为12．85(9．28)vs．10．15(7．48)，UC组与对照组相比肠粘膜和外周血中Th1比例差异均无统计学意义，且不同活动度患者间无明显差异。肠粘膜中IL-12的表达在UC组和对照组中分别是0．22(0．16)vs．0．16(0．13)，表达无明显改变。外周血中IL-12水平在UC组与对照组中分别是1．59(2．26)pg·ml~(-1)vs．1．66(5．79)pg·ml~(-1)，两组之间差异无统计学意义。(3)肠粘膜中Th2的比例在UC和对照组中分别为1．10(1．53)vs．1．15(1．50)；外周血中Th2的比例在UC和对照组中分别为1．20(0．55)vs．1．10(0．45)，肠粘膜和外周血中差异均无统计学意义，不同活动度患者间差异无显著性。肠粘膜IL-4在UC组和对照组中分别是0．29(0．14)vs．0．23(0．11)，表达无明显改变。外周血IL-4水平在UC组与对照组分别是1．27(2．48)pg·ml~(-1)vs．0(2．5)pg·ml~(-1)，两组之间差异无统计学意义。结论：在Th细胞各亚群中Th17细胞是介导UC肠道局部和外周免疫应答的优势细胞，它可能成为UC治疗的有效靶点。第二部分：腹泻型IBS患者肠粘膜和外周血中Th细胞表型的改变目的：探讨Th细胞各亚群在腹泻型IBS患者中的变化，揭示IBS粘膜免疫激活具体免疫学机制。方法：按照罗马Ⅲ标准收集腹泻型IBS患者27例，另设对照组16例。采用细胞内细胞因子染色和四色荧光抗体流式细胞术检测各组肠粘膜和外周血中Th1／Th2／Th17比例，Western blot检测肠粘膜IL-4、IL-12、IL-17表达，ELISA检测外周血IL-4、IL-12、IL-17水平。结果：(1)腹泻型IBS患者部分肠粘膜病理学表现为非特异性炎症，归为IBS-A组，肠粘膜无非特异性炎症者归为IBS组。(2)IBS-A组患者肠粘膜Th17比例较对照组明显增加，为3．60(4．05)vs．1．25(3．70)，P=0．045，而Th1、Th2比例无明显改变；肠粘膜中相关细胞因子IL-4、IL-12、IL-17表达与对照组比较差异无统计学意义。IBS-A组外周血中Th1、Th2、Th17比例和对照组比较差异无统计学意义。外周血中相关细胞因子IL-4、IL-12、IL-17水平与对照组比较也无明显改变。(3)IBS组患者肠粘膜及外周血Th细胞比例和相关细胞因子表达均无明显改变。结论：腹泻型IBS患者部分存在肠粘膜非特性炎症，提示肠粘膜存在免疫激活，该免疫状态表现为Th细胞向Th17偏移。第三部分：Th17细胞在旋毛虫感染小鼠内脏高敏感性中的作用目的：研究发现旋毛虫感染小鼠在急性感染期会出现肠道功能紊乱，在肠道炎症消退后肠道功能紊乱症状仍可持续存在。本实验旨在阐明Th17细胞及相关细胞因子在旋毛虫感染小鼠急性和慢性感染期期出现的内脏高敏感性中的作用。方法：实验分为对照组、感染后2周组、8周组和12周组。用含有旋毛虫的混悬液灌胃方法感染NIH小鼠，剂量为300条／只；结直肠扩张诱导的腹部回撤反射(AWR)评估内脏敏感性；HE染色观察空肠和结肠粘膜炎症状态；细胞内细胞因子染色检测空肠和结肠粘膜固有层Th17细胞比例；Wentern blot检测空肠和结肠粘膜IL-17、IL-23和TGF-β1蛋白表达。结果：旋毛虫感染造成的空肠和结肠一过性炎症在感染后2周时最明显，感染后8周时肠粘膜破坏和炎症反应基本消失，感染后12w时空肠和结肠粘膜无明显炎症改变。AWR评分在感染后2周时最高，感染后8周和12周时仍高于对照组水平(P＜0．05)。空肠和结肠粘膜固有层Th17细胞比例和IL-17表达在感染后2周时增高(P＜0．05)，感染后8周和12周降至正常水平。感染后2周，感染组和对照组小鼠空肠粘膜Th17细胞比例分别是9．13±2．73 vs．3．78±1．97，P＜0．01；结肠粘膜中Th17细胞比例分别是8．00±2．43 vs．3．6±1．80，P＜0．01。感染后2周，感染组和对照组空肠中IL-17含量分别是1．70±0．47和0．68±0．26，P＜0．01；结肠中IL-17含量分别是0．59±0．12和0．44±0．09，P=0．041。2周时空肠和结肠粘膜IL-17表达与AWR评分呈正相关，相关系数分别是r=0．658，P=0．032和r=0．532，P=0．04。空肠和结肠粘膜TGF-β1表达在感染后2周时增加，8周和12周降至正常水平。感染后2周，空肠中TGF-β1含量在感染组和对照组分别是0．31±0．03和0．17±0．05，P＜0．01；结肠中TGF-β1含量在感染组和对照组分别是0．11±0．03和0．08±0．02，P=0．035。急、慢性感染期间空肠和结肠粘膜IL-23表达无明显改变。结论：旋毛虫感染NIH小鼠造成肠道一过性炎症，炎症急性期和慢性期小鼠内脏敏感性增加。Th17细胞的主要效应因子IL-17可能影响了急性期感染期小鼠内脏敏感性，TGF-β1可能诱导了Th17细胞的改变。
余建[5]2004年在《人骨髓间充质干细胞对外周血T淋巴细胞体外活化影响的研究》文中研究说明骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是一种存在于骨髓中的非造血组织干细胞，具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力，近来研究发现，BM-MSCs除具有支持体外造血，促进体内造血功能重建外，在骨髓移植中还具有抑制移植物抗宿主病(GVHD)的作用。 造血干细胞移植尤其是异基因造血干细胞移植(Allo-BMT)是当前治疗白血病、再生障碍性贫血和多种血液系统疾病的有效治疗方法，但Allo-BMT后的移植排斥和GVHD是影响Allo-BMT临床疗效的主要障碍。目前虽然已有多种治疗方法，但疗效仍有待于进一步提高。由于BM-MSCs具有容易取得、能自我更新和高度增殖的特点，若研究证实其确能起到抑制GVHD的作用，则其将成为一种具有重要临床应用价值的抗移植排斥和GVHD的工具。 有关BM-MSCs抑制GVHD的机理，目前认为主要和其能抑制T淋巴细胞对刺激的反应性有关。多项研究发现，T淋巴细胞无论是被异源性经照射的DC细胞或外周血淋巴细胞，还是被多克隆激活剂激活后，在自体或异体的人BM-MSCs实验组中，T淋巴细胞的增殖均被明显抑制，且这种抑制作用与加入的BM-MSCs的数量成正比。BM-MSCs对CD4~+和CD8~+的淋巴细胞增殖均有抑制作用，这种抑制作用和T淋巴细胞凋亡无关，而与其分泌的细胞因子TGF-β1和HGF相关。但也有学者认为BM-MSCs的抑制作用和IL-10、TGF-β1和前列腺素浙江大学硕士学位论文EZ均没有显著相关性。此外还有研究者认为BM一MSCs的免疫抑制作用和可溶性细胞因子的分泌无关，而和细胞接触有关。因此BM一MSCs抑制T淋巴细胞对刺激物的增殖反应机理还有待于进一步的研究。 本实验以植物血凝素(P HA)刺激人外周血T淋巴细胞作为反应体系，观察人BM一MSCs对人外周血T淋巴细胞体外活化的影响，进一步明确人骨髓间充质干细胞是否具有抑制淋巴细胞对刺激的反应性的作用，并通过T淋巴细胞凋亡检测及细胞培养上清液细胞因子检测的方法，初步探讨其作用的可能机理。 本研究首先通过Ficon密度梯度离心法，得到低密度的单个核细胞，然后利用MSCs的粘附特性，分离和纯化MSCs。骨髓单个核细胞接种于培养瓶后，2一3h细胞开始贴壁，24h后贴壁细胞数目不再增加。48h更换培养液后，贴壁细胞开始分裂增殖，部分区域形成细胞团簇，细胞呈现梭形外观。2周后，细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显方向性，呈漩涡状、网状、辐射状。培养至2一3周贴壁细胞接近80%一90%融合。传代培养后，传代细胞在12h内完全贴壁，细胞重新变为梭形细胞，与成纤维细胞形态相似。细胞传代后生长迅速，增殖快，大约7一10天达到完全融合。 流式细胞术检测显示，体外培养的MSCs表达CD29、CD44和CD166，不表达CD 14、CD34、CD45和HLA一DRa 淋巴细胞增殖率检测显示，在PHA体外活化T淋巴细胞反应体系中加入无关供者的BM一MSCs，加入细胞浓度不同，淋巴细胞增殖率不同(F=65.641，P<0 .01)。BM一MSCs能抑制淋巴细胞对PHA刺激的反应性，不同MSCs细胞浓度组之间的差异均具有显著性意义(P<0.01)。双因素相关性分析显示BM一MSCs对淋巴细胞增殖的抑制能力与MSCs和单个核细胞比例呈正相关(r=0.998，P<0 .05)。BM一MSCs的抑制作用以MSCs高细胞浓度组(间充质干细胞数量相当于单个核细胞数量的40%)最为明显，抑制率达到83.95士9.25%，而MSCs中细胞浓度组(间充质干细胞数量相当于单个核细胞数量的20%)和MSCs低细胞浓度组(间充质干细胞数量相当于单个核细胞数量的10%)的抑制率分别为59.82士13.20%和41.08士15.23%。在增殖反应第0天和第3天加入BM一MSCs，浙江大学硕士学位论文均能抑制T淋巴细胞增殖，但第0天加入者其抑制作用更为明显，两者相比有显著性差异(P<0.01)。 T淋巴细胞凋亡检测结果显示与对照组相比，BM一MSCs实验组培养5天后的外周血单个核细胞AnnexinV勺CD3+百分率并没有增加，两者相比没有显著性差异(P=0.3 10)。 ELISA检测显示阳性对照组和不同MSCs细胞浓度实验组培养上清液中TGF一pl浓度无显著性差异(F=0.295，P二0.828)。双因素相关性分析显示BM一MSCs的免疫抑制作用和培养上清液中TGF一pl的浓度无关(r=0.1%，P二0.875)。而阳性对照组和不同MSCs细胞浓度的实验组培养上清液中IL一10浓度有显著性差异(F二18.973，P<0.01)。与阳性对照组相比，各实验组培养上清液中的IL一10浓度上升，且不同MSCs细胞浓度实验组之间的差别均有显著意义 (P<0 .05)。双因素相关性分析显示BM一MSCs的免疫抑制作用和培养上清液中IL一10的浓度呈正相关(r=0.999，P<0.05)。 综上所述，本实验结果表明①人BM一MSCs能抑制T淋巴细胞对PHA刺激的反应性，不受MHC分子限制，其抑制能力与MSCs和单个核细胞比例呈正相关。②人BM一MSCs的免疫抑制作用和外周血T淋巴细胞凋亡无关。③人BM-MSCs的免疫抑制作用和细胞培养上清液中TGF一pl浓度无关。④人BM一MSCs的免疫抑制作用和细胞培养上清液中几一10的浓度呈正相关。
黄毅[6]2016年在《外周血T细胞及其亚群与末端回肠炎关系的研究》文中研究说明目的:探讨外周血T淋巴细胞及其亚群构成比例在末端回肠炎发病过程中的变化及其意义。方法:取SD大鼠90只。体重均为200至350g。将大鼠随机分为M、S、C三组。M组:模型组(Model);S组:缝线组(Suture);C组:对照组(Control)。每组30只。三组分别采取不同的处理。M组:回肠远端与结肠近端吻合,制造结肠-回肠反流模型。S组:制造与M组在回肠和结肠相同位置的同等程度的肠道损伤,而不建立反流模型,形成对照。C组:仅麻醉,不行手术。三组大鼠饲养及护理均相同。分别于术后第2、4、8周,每组随机抽取10只大鼠进行静脉采血及取回肠组织。静脉血用流式细胞术检测T细胞亚群。回肠组织制成切片进行病理评分。结果:1.外周血T细胞亚群构成比例检测:(1)实验大鼠DNT细胞构成比例情况:术后M组、S组大鼠DNT细胞构成比例均明显增加,M组更明显(P<0.05),到第2周时达到高峰,说明DNT可能参与了急性炎症反应过程。从第2周开始至第八8周数值逐渐下降,S组在第4周时基本恢复正常值,M组较S组慢,M组与S组比较有显著差异(P<0.05)。说明DNT细胞在实验末端回肠炎急性期(0-4周)变化最明显。(2)实验大鼠T4细胞构成比例情况:术后M组、S组大鼠T4细胞构成比均明显降低,m组表现更明显(p<0.05),术后第2周数值最低值。术后第2周开始,s组大鼠t4细胞构成比开始增加,到第4周时接近正常水平,而同一时期m组维持在低值水平,有少数数值甚至比第2周时更低,4周以后开始回升到正常值水平。说明末端回肠炎的早期(0-4周),t4细胞可能扮演了重要的角色。(3)实验大鼠t8细胞构成比例情况:术后2周内,m组、s组大鼠t8细胞构成比例均增加,m组、s组有显著差异(p<0.05)。第4周时,m组t8细胞构成比例进一步升高,而s组基本达到正常水平(p<0.05)。第8周时,m组恢复正常水平。说明末端回肠炎发病的4-8周内,t8细胞可能起了着重要的作用。(4)实验大鼠dpt细胞构成比例情况:术后m组大鼠dpt细胞构成比例明显增加,第4周达到高峰,4-8周逐渐下降,到第8周时仍高于c组,而s组dpt细胞数量变化始终不明显,m、s组有显著差异(p<0.05)。结果提示,dpt细胞可能参与了末端回肠炎的发病整个过程(0-8周)。2.外周血t细胞亚群构成比例与回肠组织炎症程度的相关性:通过对m组术后病变明显处组织的肉眼和镜下观察发现,在实验性末端回肠的整个发病过程中,随着时间延长,病变处肠组织病理评分越高,炎症表现越严重。通过m组和c组各t细胞亚群构成比与炎症评分的相关性分析表明,dnt、t8、dpt三类细胞与末端回肠组织炎症严重程度具有正相关性(r值分别为0.518、0.482、0.714,p<0.05),t4细胞与末端回肠组织炎症严重程度具有负相关性(r=-0.506,P<0.05)。结论:1.在ETI中,DNT、T8、DPT三类T细胞亚群增加,T4细胞减少,外周血T细胞各亚群可能均参与了ETI的发病过程。2.DNT、T8、DPT三类细胞与末端回肠组织炎症严重程度具有正相关性,T4细胞与末端回肠组织炎症严重程度具有负相关性,T细胞各亚群可能作为监测末端回肠炎症程度的重要指标。
农荣卯[7]2013年在《姜黄素对大鼠溃疡性结肠炎IL-23/IL-17表达的影响》文中研究指明目的应用姜黄素干预TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型,研究姜黄素对大鼠溃疡性结肠炎肠黏膜及外周血IL-17、IL-23表达的影响,以探讨姜黄素对溃疡性结肠炎抗炎作用的新机制。方法将60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、姜黄素治疗组(C组)和柳氮磺吡啶治疗组(D组),每组均为15只。B、C、D组大鼠按体重分别以100mg/kg的TNBS+50%乙醇溶液0.25ml灌肠制备大鼠结肠炎模型,A组大鼠予相同剂量的0.9%氯化钠溶液及50%乙醇溶液0.25ml灌肠。造模后第2日开始,按体重C组每日予100mg/kg姜黄素溶液灌胃,D组每日予100mg/kg的SASP溶液灌胃,A、B组每日予相同剂量的0.9%氯化钠灌胃,并观察大鼠每天饮食、体重变化、大便性状及潜血情况,评价各组大鼠疾病活动指数(DAI)；灌胃7天后,采集大鼠血液及结肠标本备检,观察并评价结肠黏膜损伤指数(CMDI)及组织病理学活动指数(HAI),免疫组化法测定肠黏膜组织IL-17及IL-23表达水平,ELISA法测定血清IL-17及IL-23水平。结果与模型组相比,姜黄素组DAI评分(1.22±0.88vs2.15±0.76)、CMDI评分(2.53±1.12vs4.53±0.63)、HAI评分(4.06±1.70vs7.06±1.22)、肠黏膜IL-17(2.46±1.06vs5.86±1.92). IL-23(3.06±1.79vs5.40±1.80)及血清IL-17(1.57±0.32vs2.11±0.25)和IL-23(4.99±1.74vs7.41±0.96)表达水平均有下降,差异有统计学意义(P<0.05);姜黄素组与SASP组相比,DAI评分、CMDI评分、HAI评分、IL-17和IL-23表达水平均无明显差异性(P>0.05)。结论姜黄素可以通过抑制IL-23及IL-17的表达,减轻TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎的肠道炎症,具有抗炎作用。
马海龙[8]2016年在《自然感染细粒棘球蚴对肠道粘膜免疫屏障的影响研究》文中提出背景:由细粒棘球绦虫的幼虫引起的棘球蚴病,是一种人畜共患的寄生虫病,高发于我国及世界各地的畜牧区,分布地域相当广阔,目前已成为全球性的公共卫生问题。人类及部分食草类动物(如绵羊等)因为误食了由其终末宿主排出的虫卵成为其中间宿主,虫卵经过胃,最终在十二指肠及小肠上段肠粘膜内寄居,在此虫卵孵化出六钩蚴,穿过肠粘膜屏障入血并到达肝脏及其他器官,对机体的健康危害极大。既往研究发现,细粒棘球蚴之所以能够在机体内长期生存,是其通过影响宿主Th1及Th2两型细胞免疫应答平衡因子,诱导非保护性的Th2型免疫应答成为主导,利于细粒棘球蚴在体内的生长。但是,肠粘膜免疫屏障系统是机体内最大的淋巴免疫系统,是细粒棘球蚴进入机体的第一道屏障,其对肠粘膜免疫屏障影响的相关研究鲜有报道,本研究旨在通过自然感染细粒棘球蚴的绵羊做为大动物研究对象,采取随机对照实验,应用酶联免疫吸附测定(ELISA)及免疫组化等方法,分析Th1/Th2相关的部分免疫因子(IL-6,IL-10及IFN-γ)在外周血和小肠粘膜组织内的水平变化;同时,应用阿苯达唑质脂体治疗自然感染细粒棘球蚴感染的绵羊,进一步评价细粒棘球蚴感染后对外周血及肠粘膜内Th1/Th2所介导的免疫反应的影响;此外,通过对肝细粒棘球蚴患者与正常人群中幽门螺杆菌感染率的进行病例对照研究,以期从肠道微生态角度来探讨,肠道微生态变化对细粒棘球蚴影响肠粘膜免疫屏障功能可能起到的作用。最终来研究,自然感染细粒棘球蚴对肠道粘膜免疫屏障可能发生的影响,为今后预防和治疗细粒棘球蚴感染提供可行性研究方向。方法:用B超初检和CT复检的方法,从新疆巴音布鲁克草原986只绵羊中,筛选出年龄在24-36月左右,自然感染细粒棘球蚴的雌性绵羊20只,按随机数字表法,分为两组,分别为使用阿苯达唑治疗组和细粒棘球蚴感染组,以及按同法筛选出未感染组绵羊10只,做为正常对照组。严格随机三盲方法,对上述三组实验对象进行治疗及饲养3月后,进行外周血采集、处死后小肠粘膜标本收集。用ELISA法对外周血中IL-6,IL-10及IFN-γ等免疫因子水平进行测定,分析细粒棘球感染及阿苯达唑质脂体治疗后外周血中免疫因子的变化;同时通过对小肠粘膜石蜡切片进行免疫组化染色,比较IL-6,IL-10及IFN-γ等免疫因子的阳性表达水平;此外,通过随机选取临床确诊感染细粒棘球蚴患者51例及正常健康体检人群30例成人做为对照组,使用化学发光法检测幽门螺杆菌感染情况,进一步探讨,肠道微生态对细粒棘球蚴作用于肠粘膜免疫屏障过程中的可能影响。结果:1)ELISA法对自然感染细粒棘球蚴绵羊外周血免疫因子IL-6、IL-10、IFN-γ进行测定提示:感染组上述3种免疫因子水平均高于对照组,但只有IL-10具有统计学意义(P<0.001);免疫组化法对自然感染细粒棘球蚴绵羊肠粘膜内免疫因子IL-6、IL-10、IFN-γ进行测定提示:感染组仅有IFN-γ明显高于对照组,并有统计学意义(P<0.005);2)阿苯达唑脂质体治疗干预后,ELISA法测定外周血Th2相关免疫因子IL-6,IL-10均有降低,但仅有IL-10具有统计学意义(P<0.01);阿苯达唑脂质体治疗后,肠粘膜免疫组化结果示:肠粘膜内Th1相关免疫因子IFN-γ保持在较高水平,并具有统计学意义(P<.01),肠粘膜内Th2相关免疫因子IL-10有所降低,但没有统计学意义(P=0.893);3)用化学发光法对51例细粒棘球感染患者进幽门螺杆菌抗体检测发现阳性率达74.51%,而对照组为50.00%,两者具有统计学差异(P=0.025)。结论:本研究利用自然感染细粒棘球蚴绵羊做为研究对象,更接近同样做为细粒棘球感染中间宿主的人类感染模式。研究发现,自然感染细粒棘球蚴绵羊外周血中免疫反应主要以Th2型为主,而肠粘膜免疫反应可能以Th1型为主;行阿苯达唑质脂体进行干预治疗后结果提示:阿苯达唑质脂体可增强机体体液及肠粘膜免疫屏障的Th1型免疫反应,对Th2类免疫因子有抑制作用;在对人细粒棘球蚴感染与幽门螺杆菌感染相关性病例对照研究结果提示:肠道微生态的变化可能对细粒棘球蚴感染后,肠粘膜免疫屏障功能改变具有影响,其中幽门螺杆菌可能与细粒棘球蚴存在协同感染可能,为进一步研究细粒棘球蚴如何影响肠粘膜屏障提供了一个可能的研究方向。
董云霞, 孙蓬然, 郑长青[9]2007年在《调节性T细胞与炎性肠病研究进展》文中研究指明炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)为非特异性炎症性肠病,主要包括溃疡性结肠炎(Ul-cerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。其病因和发病机制尚未完全明确。已知肠道粘膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD中发挥着重要作用。笔者对调节性T细胞在肠道免疫系统中的作用与IBD的发病机制相关性的研究进展做一综述,为临床治疗IBD的新药研究提供可能性的途径。
李金厚[10]2014年在《肠易激惹综合征结肠粘膜TH17细胞的免疫激活及相关因素的研究》文中进行了进一步梳理目的肠易激惹综合症是临床常见胃肠功能紊乱性疾病，发病机制复杂，涉及感染、应激、过敏、自主神经功能紊乱、内分泌等多方面原因，尚无完美机制阐释发病机制。在炎症性疾病关节破坏性疾病中发现T细胞亚群，命名TH17细胞，分化来源于CD4+T细胞，TH17细胞通过分泌IL-17参与多种疾病的发生发展机制，探讨TH17细胞激活与肠易激惹综合征的发病关系。探讨TH17细胞在肠易激惹综合征中激活影响因素与食物过敏、应激的联系。方法根据罗马III诊断标准选取IBS-D病例组30人，取正常志愿者20人作为对照组。对研究对象检测血清标本中IL-17含量；对所有研究对象进行心理测试，行焦虑和焦虑量表评分，评估焦虑与抑郁状态的症状积分严重程度；对研究对象抽血行血清14种食物过敏原检测，检测过敏原；并分别电子结肠镜检查，分别在回盲部、横结肠、乙状结肠取组织病理进行IL-17免疫组织化学染色，免疫组化后医学图像处理对比病例组与对照组中组织的表达评定免疫组化积分。分析焦虑、抑郁，过敏原，对肠粘膜TH17细胞及外周血IL-17的影响。结果1、病例组与对照组，结肠粘膜TH17细胞免疫组化积分，病例组：8±4.26，对照组4.9±3.77，两组比较，有统计学差异（P<0.05）。2、病例组与对照组，血清IL-17水平，病例组：24.71±20.62，对照组19.66±15.99，两组比较无统计学差异（P>0.05）。3、病例组与对照组心理应激：焦虑评分，7.13±4.48，1.70±1.56，两组比较有统计学意义（P<0.01）；抑郁评分，6.97±3.31，2.10±1.83，两组比较有统计学差异（P<0.01）。4、病例组与对照组食物过敏原检测结果：病例组：青霉素（病例组25/30，对照组11/20，P<0.05）；牛奶（病例组26/30，对照组7/20，P<0.01）；羊肉（病例组23/30，对照组9/20，P<0.05），有统计学差异。两组比较过敏原积分，病例组：20.67±7.96，对照组：3.65±3.65，有统计学差异（P<0.01），过敏原种类，病例组：12.3±4.66，对照组：10.85±2.28，没有显著统计学差异（P>0.05）。5、病例组与对照组，免疫组化积分与过敏原积分及过敏原种类相关分析结果分别为：相关系数r=0.579；r=0.477，均有统计学相关关系（P<0.05），与焦虑：r值0.123；抑郁：r=0.354；血清IL-17：r=0.159，都没有相关关系（P>0.05）。结论1、IBS-D结肠粘膜存在TH17细胞的免疫激活，TH17细胞可能参与IBS-D的发病机制。2、IBS-D结肠粘膜TH17细胞的激活与食物过敏严重程度相关，食物过敏可能是IBS-D诱发因素。3、IBS-D存在心理应激水平差异，焦虑及抑郁可能参与IBS的发病，但心理应激的可能与TH17细胞活化无关。
参考文献：
[1]. 溃疡性结肠炎患者肠粘膜及外周血淋巴细胞表型与功能研究[D]. 刘小方. 中国协和医科大学. 2000
[2]. 溃疡性结肠炎患者外周血调节性T细胞功能状态的研究[D]. 刘香. 中国医科大学. 2007
[3]. CD4+T细胞在溃疡性结肠炎患者外周血的表达及黄芩苷的体外干预作用[D]. 吕汝西. 南方医科大学. 2014
[4]. Th细胞在IBS和IBD中的表型改变[D]. 付妤. 华中科技大学. 2009
[5]. 人骨髓间充质干细胞对外周血T淋巴细胞体外活化影响的研究[D]. 余建. 浙江大学. 2004
[6]. 外周血T细胞及其亚群与末端回肠炎关系的研究[D]. 黄毅. 南华大学. 2016
[7]. 姜黄素对大鼠溃疡性结肠炎IL-23/IL-17表达的影响[D]. 农荣卯. 广西医科大学. 2013
[8]. 自然感染细粒棘球蚴对肠道粘膜免疫屏障的影响研究[D]. 马海龙. 新疆医科大学. 2016
[9]. 调节性T细胞与炎性肠病研究进展[J]. 董云霞, 孙蓬然, 郑长青. 实用药物与临床. 2007
[10]. 肠易激惹综合征结肠粘膜TH17细胞的免疫激活及相关因素的研究[D]. 李金厚. 泰山医学院. 2014
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