摘要：转基因技术给全球的食品行业带来了巨大的经济效益，随着世界上各国不断对转基因技术和转基因农产品的开发利用，人们开始广泛关注食用转基因产品对人类健康的影响以及种植转基因农产品对生态环境的影响。各国政府和国际机构都十分重视对转基因作物及转基因食品进行综合评价，对转基因作物及转基因食品的综合评价需要一套科学合理的安全评价体系，也应该建立一套完善、严格的法律法规。本文分析了实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用。
关键词：实时荧光定量PCR技术；转基因食品检测；应用
转基因食品是由转基因生物加工生产的食品和食品添加剂。随着转基因技术的推广，转基因食品已广泛渗透到食物链中。近年来，食品生产企业应用转基因技术进行食品的商品化生产与加工。转基因食品的种类迅速增加，产销量与销售额也大幅上升。
一、概述
常规PCR 技术虽然快速简便，但不能进行定量检测，在常规PCR 技术上进行一些改进使其能够进行一定程度的定量检测，例如，PCR- ELISA 法、竞争性PCR 法，这些能够进行一定程度定量检测的PCR 技术所面临的最大难题是PCR 的假阳性污染问题。用PCR- ELISA 法、竞争性PCR 法方法进行检测，都离不开一个关键过程—PCR 后处理过程，虽然具体的方法不同，所采取后处理流程不同，但这些后处理过程中，都容易使PCR 产物飞散到空气中。如果在进行产品检测中，出现了PCR 产物的飞散，极容易造成待检产品出现假阳性结果。另外，这些改进后的定量检测方法，其技术上的机理都是检测PCR 终产物，而PCR 技术本身会造成原始模板数量和终产物之间的相关性出现干扰，因此其定量的准确性受到了很大的限制。随着PCR 技术的深入发展，PCR 技术和探针杂交技术进一步交融，从而出现了FQPCR 技术，即荧光定量PCR技术，该技术融合了PCR 技术和探针杂交技术各自的优点，通过对PCR 过程中的荧光变化的直接探测，可以获得待检产品的DNA 模板的准确定量结果。作为目前最先进的PCR 技术，将荧光定量PCR 应用于转基因食品的检测，具有很高的研究价值和实用价值。
二、实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用
1.食源性致病菌的检测。随着分子细菌学和生物学的研究更加深入，荧光定量PCR 技术可以作为一种新的手段检测致病菌。一是沙门氏菌检测。沙门菌作为引起食物中毒的主要致病菌，能引起人类急性肠胃炎伤寒和副伤寒等多种疾病，严重威胁着人们的身体健康及食品安全，在公共卫生上具有十分重要的意义，特异基因设计一对特异引物，利用Real–timePCR 方法检测大肠杆菌O157：H7 只需要3 小时，灵敏度达2×101 CFU/mL 细菌，具有较强的特异性。检测牛奶中的大肠杆菌O157：H7 时用脱氧胆酸钠和叠氮溴化丙锭来消除死菌的干扰灵敏度可达102 CFU/mL。可见，利用Real–time PCR 技术及结合其他试剂可更快速、高敏感性的检测此致病菌。
2.转基因成分检测。当前，国际社会对转基因食品检测技术路线主要有两条：一是直接检测外源基因DNA；二是对外源基因表达产物蛋白质进行检测。随着检测技术不断提高，对食品转基因检测已从定性提高到定量水平。结合PCR 和探针杂交技术的实时荧光定量PCR 技术，通过探测PCR 过程中荧光信号变化，准确定量DNA模板量，其检测灵敏度比常规PCR 技术高100 倍左右，可检测到每克样品中含2 pg 转基因DNA。在进行转基因成分定量分析时，依据所检测的外源目标序列不同，转基因食品实时荧光定量PCR 检测水平可分为4 种：通用序列检测、基因特异性序列检测、结构特异性序列检测和品系特异性序列检测。近年来有许多利用Real–time PCR 技术检测转基因的报道。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆根据转基因玉米的左侧侧翼序列和玉米内标基因分别设计特异性引物及Taqman 探针，通过实时荧光PCR 技术建立定量特异性检测方法。该技术灵敏度高、特异性强。同时检测转基因番茄内源基因和三个在转基因产品中最常用的成分，结果表明，该方法筛选转基因番茄产品是可行的，即使对一些加工食品。采用实时荧光定量PCR技术检测耐除草剂转基因大豆A5547–127。结果表明，该方法的LOD 和LOQ 分别是1 和10 copies/μL，试验偏差值均在允许范围之内，可以为转基因大豆提供科学的定量检测依据，为转基因作物的鉴定、检测提供新方法。此外，实时荧光定量PCR 技术在肿瘤检测方面也有研究和应用。采用实时荧光定量PCR 法检测端粒酶逆转录酶的mRNA 表达，结果表明，端粒酶与人肺腺癌耐药细胞的多药耐药密切相关，其有可能作为逆转耐药的新靶点。该方法可通过测定病人的外周血CTCs 的相对数量来检验治疗效果，还可为早期患者设计更全面、合理的治疗方案。
3.数字PCR技术。数字PCR技术是利用PCR技术结合微流控或微滴化方法进行计数的核酸绝对定量技术。它的原理是将稀释后的核酸溶液分散至微反应器或微滴中，经PCR扩增后，含有目标DNA模板的反应器能够发出荧光信号，根据计算荧光反应的微反应器或微滴的数目进行定量检测。应用于植物源性转基因食品检测的数字PCR技术，包括微滴数字PCR技术和微流控芯片数字PCR技术。微滴数字PCR技术是将预混合的PCR反应体系随机分散到数万至数十万个微滴中形成油包水的结构，扩增产物发出的荧光信号根据泊松分布公式进行计算，进而进行定量检测。微滴反应能够大幅度分散反应体系，有效降低抑制因子的作用，保证检测过程中的扩增效率，对于含有微量目标DNA的样品具有良好检测效果，适用于复杂食品体系与深加工食品中转基因成分的检测。微流控芯片技术是把各基本操作步骤集成到一块几平方厘米的芯片上。
三、展望
随着基因工程技术在农业生产中的广泛应用，越来越多具有改良性状的转基因植物在全球范围内得到广泛种植，随之而来的转基因食品也迅猛发展，转基因产品的大规模商业化引起了对安全性问题的担忧。快速、准确、高通量的定量检测方法是保证转基因产品标签制度顺利实施的基础，因而，具备这些特点的实时荧光定量PCR 技术在转基因食品检测领域中的应用将会得到更大范围的普及。实时荧光定量PCR 技术虽然使转基因食品检测突破了从定性到定量的界限，实现了精确定量到绝对定量的转变，但随着全球生物技术的发展，新的转基因植物趋向于复合基因改造，如Smartstax是一种新型的复合性状生物技术玉米产品，这些性征以8 个基因为基础，是迄今最先进的获批的生物技术作物。同时，转基因食品的生产工艺也在逐渐改善和优化，食品加工过程原料中的转基因序列遭到严重破坏。这些都对实时荧光定量检测提出了更高的要求和标准。随着转基因植物品系的日益增多，许多新增的转基因品系的标准样品更难以获得，这在很大程度上限制了转基因生物研究和监管工作的发展。传统的颗粒或粉末标准样品一般只用于针对同一物种的转基因成分定量，而质粒标准品可以人为设计携带多个外源基因，实现定量检测的最佳途径是构建相应品系的质粒标准品。
总之，实时荧光定量PCR 技术使转基因食品的检测实现了从定性到定量的突破，实现了从精确定量到绝对定量的转变，并缩短了检测时间、提高了检测灵敏性和特异性，具有快速、准确、高通量的特点。对目前存在的问题进行深入研究，将为此技术在转基因食品中更大范围的应用奠定良好基础，并为保证转基因产品标签制度的顺利实施提供可靠的技术支持。
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论文作者:王淑芳
论文发表刊物:《基层建设》2017年第11期
论文发表时间:2017/8/17
标签：转基因论文; 定量论文; 技术论文; 荧光论文; 食品论文; 实时论文; 特异性论文; 《基层建设》2017年第11期论文;