高志荣[1]1988年在《牙源性上皮分化的单克隆抗体研究》文中认为炎症牙周组织中马拉赛氏上皮剩余增生形成囊肿，结合上皮根向增生形成牙周袋是尖周病和牙周病的重要病理过程。然而，对这些特殊上皮组织的结构蛋白的分布以及在增生过程中的变化目前却了解甚少。 近年来的分子生物学研究发现：人类上皮细胞骨架蛋白-细胞角蛋白有19种，其分布有显著的组织特异性，同时受解剖部位、发育期、分化程度和病理改变等因素的影响。因此，观察细胞角蛋白的变化已成为研究上皮分化的一种重要途径，并在一些情况下可辅助病理诊断。 本研究应用新近产生的一组抗细胞角蛋白特异性单克隆抗体，对1：尖周组织中的上皮剩余增生形成上皮条索以及囊肿衬里过程中的细胞角蛋白改变；2：牙囊中上皮组织和牙源性发育囊肿的细胞角蛋白分布特征；3：结合上皮、龈沟上皮和牙龈口腔上皮的抗原表现型进行了免疫组化检查。并且，初步应用冻干牙龈组织为抗原，通过细
包柳郁[2]2004年在《用人牙源性上皮和间充质细胞构建组织工程牙齿样结构的实验研究》文中研究说明牙周牙髓疾患、外伤以及先天、遗传性疾病常常导致牙齿缺失，严重影响咀嚼功能和颜面美容。义齿修复治疗是临床解决缺牙问题的常用方法，但义齿缺乏自然牙的感觉和形成能力，仅能有限地恢复咀嚼功能。如何利用人工方法设计和制造出具有生物学活性的牙齿，并用于修复缺牙，是国内外学者所追求的目标和着力研究的热点课题。但由于缺乏对牙齿组织结构和发育形成机制的透彻了解以及相关技术的支持，此领域的研究一直未能取得突破性进展。目前，国际上已有研究发现体外分离的人牙髓干细胞在裸鼠体内可形成牙本质牙髓复合体，但有关用体外培养的胚胎期人牙源性上皮和间充质细胞构建牙齿样结构的研究尚未见报道。 牙齿是一种多胚层起源的器官，是胚胎期的牙源性上皮和间充质在一系列信号分子组成的信号网络的严密调控下，发生复杂的交互式作用而形成的。其中，牙釉质是由牙胚发育早期的牙源性上皮细胞形成的，而牙本质牙髓复合体则是由其周围的牙源性间充质细胞所形成。牙源性上皮和间充质细胞属于胚胎期的细胞，具有较强的增殖活性和分化能力，二者之间的相互诱导作用对于牙齿发育意义重大。本研究将此理论与组织工程学思想相结合，模拟体内牙胚发育的生理机制，将体外培养的人牙源性上皮和间充质细胞作为种子细胞，接种于优选出的三维支架上，在免疫缺陷小鼠 第四军医大学博士学位论文体内建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的立体培养模型，以诱导形成含有釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构，并对其进行鉴定分析。目的在于为牙周牙髓疾患的治疗和缺失牙的修复提供新思路，并为牙齿的再生和应用研究奠定良好的实验基础，也为其他多胚层组织和器官的重建开辟新途径。本课题主要进行了如下几方面的研究:1.人牙源性上皮细胞和间充质细胞的体外培养 利用显微分离和酶消化技术分离人发育早期牙胚的牙源性上皮和间充质组织，组织块法分别培养牙源性上皮细胞及间充质细胞，多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化，倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，免疫荧光染色鉴定细胞来源。结果显示，原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好，但有少量间充质细胞混杂其中，经纯化后明显好转，上皮细胞呈片状生长，表达角蛋白及成釉蛋白。牙源性间充质细胞生长良好，状态稳定，表达波形丝蛋白。本实验成功建立了人牙源性上皮细胞和间充质细胞的体外培养体系，为牙齿组织工程研究提供了可靠的种子细胞来源。2.人牙源性间充质细胞向成牙本质细胞的诱导分化 应用bFGF+I GF一1或TGF一pl分别对培养早期的人牙源性间充质细胞进行平面定向诱导以及平面三维(以胶原凝胶为载体)联合诱导，观察诱导后细胞的形态学变化及其在胶原凝胶中的生长状况，采用免疫荧光染色和Rl飞PCR方法检测成牙本质细胞标志物—DSP蛋白和DSPP mRNA在诱导后细胞中的表达，并通过Von Kossa染色检测诱导后细胞的矿化能力。结果显示，诱导后部分细胞出现单侧较长的细胞突起，表达DSP蛋白和DsPP mRNA，体外连续培养可自发形成矿化结节，在平面和三维培养中均表现出较典型的成牙本质细胞的形态和功能特征，提示bFGF+I GF一1或TGF一pl可促进牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化，并可在三维培养体系中维持其分化表型不变。本实验为构建组织工程牙齿样结构提供了具有较强成牙能力的种子细胞。3.应用于构建组织工程牙齿样结构的支架材料的优选 将生长因子诱导后的人牙源性间充质细胞与胶原类材料、天然珊瑚、 4 第四军医大学博士学位论文陶瓷化骨以及collagraft复合材料相复合进行体外培养，采用扫描电镜和细胞计数法观察和比较细胞在各种三维支架中的生长、增殖情况。结果显示，细胞在胶原膜、陶瓷化骨和Collagraft复合材料表面伸展充分，生长良好，增殖活跃，细胞表面可见多数分泌颗粒，而天然珊瑚表面附着细胞很少，伸展不够充分，增殖也不明显。提示胶原膜、陶瓷化骨和Conagraft复合材料适宜牙源性间充质细胞的生长，但由于胶原膜无法为细胞生长提供矿物离子环境，而且坚韧性不高，因此本实验最终选择陶瓷化骨和Collagraft复合材料作为下一步构建组织工程牙齿样结构的支架材料。4.人牙源性间充质细胞体内立体培养模型的建立 将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于复合同种生长因子或未复合生长因子的陶瓷化骨和collagraft复合材料上，将细胞/支架复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型，并设立相应的对照组。4周和10周后取材，对移植物进行组织学观察和免疫组化染色。结果显示，10周的实验组标本中，植入的细胞在未复合生长因子的支架上形成了不太典型的牙本质和牙髓样组织，而在复合生长因子的支架上形成了较典型的牙本质牙髓复合体样结构，新生的牙本质样组织和其内侧出现极化的细胞均表达人DSP。对照组及4周标本中未观察到此现象。提示用人牙源性间充质细胞在裸鼠体?
高玉好[3]1995年在《造釉细胞瘤组织发生的分子病理学研究》文中认为颌骨造釉细胞瘤是颌面部的常见肿瘤，呈侵袭性生长，可破坏周围骨组织，术后复发率较高(70％)，部分可恶性变甚至发生远处转移。其发生发展机理，目前还不清楚。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)是一种存在于正常骨及牙本质基质、体外可促进成骨性细胞及牙髓细胞增殖分化、体内可诱导骨及修复性牙本质形成的生长因子。免疫组织化学研究表明，正常人牙胚中的釉上皮(内釉细胞、造釉细胞、外釉细胞及中间层细胞等)、造牙本质细胞和牙髓间充质细胞中均含有程度不同的BMP。颌骨造釉细胞瘤属于牙源性肿瘤。BMP在颌骨造釉细胞瘤中的表达与分布目前还不太清楚。本研究利用免疫组织化学、BMP生物活性体内鉴定、核酸原位杂交、Southern blot、Northern blot、多聚酶链反应(PCR)及核酸多肽性分析(SSCP)等分子生物学方法，系统观察了颌骨造釉细胞瘤中BMP的表达与分布。此外，鉴于BMP属于转化生长因子β(TGF-β)家族，与表皮生长因子(EGF)有部分序列同源性，且部分生长因子或其受体本身就是癌基因，本研究还对比观察了TGF-β、EGF、EGF-R、C-erbB-2、neu、bcl-2、P~(53)及釉质蛋白(Amelogenin)等在颌骨造釉细胞瘤中的表达与分布。对照组包括正常牙胚、外周性造釉细胞瘤、颌骨牙源性鳞状细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、颅咽管瘤、颌骨纤维肉瘤、造釉细胞纤维瘤、牙瘤、牙本质瘤等。 本研究发现，免疫组化显示，牙胚中的造釉细胞、内釉上皮、中间层细胞及个别星网层细胞BMP阳性，其中以造釉细胞最为明显；牙髓中造牙本质细胞BMP阳性，牙髓细胞弱阳性。但40例颌骨造釉细胞瘤无一例BMP阳性。BMP cDNA原位杂交研究表明，牙胚中的内釉上皮、造釉细胞可见弱的杂交信号分布；而造釉细胞瘤中的上皮细胞中可观察到强的杂交信号，以滤泡周围细胞最为明显，星网层次之，鳞状化生上皮阳性
黄峰[4]2015年在《小鼠磨牙间充质成牙潜能的关键分子》文中指出小鼠磨牙是研究哺乳动物上皮与间充质之间相互作用机制的重要模型。牙发育依赖于来自外胚层的牙上皮和神经嵴来源的牙间充质之间的相互诱导和作用,这种作用是通过两者之间一系列交互而有序的旁分泌生长因子信号传导而实现的。这些信号分子能调控牙胚中基因的表达以及组织细胞的功能,决定牙间充质与牙上皮的牙向分化命运。牙器官的发育过程中,不同时期的牙胚组织还具备诱导牙齿发育潜能,通过特定的分泌型信号分子,可诱导非牙组织牙向分化。深入分析诱导牙齿发育潜能的关键分子组成,对利用干细胞及牙器官的发育原理进行牙齿再生的研究将具有重要的提示,可为干细胞牙向的定向分化提供理论基础。经典重组实验证明,在E9.5天,诱导成牙潜能存在于牙上皮之中,E12.5天之后诱导成牙潜能转移至牙间充质中。E13.5天的牙间充质能诱导E10.5天第二腮弓上皮(非牙源性上皮)发育成为牙齿。但利用这样的重组体系进行牙间充质的诱导成牙潜能的研究效率低下,需要同时收获两个不同时期的胚胎进行重组实验,而且E10.5天第二腮弓上皮较难分离。为了高效地开展牙间充质诱导成牙潜能的研究,本研究将探究在小鼠同期胚胎中是否存在其他的能被牙间充质诱导的非牙源性上皮组织,为牙间充质诱导成牙潜能的研究提供充足而方便制备的非牙源性上皮来源。以小鼠相同胚胎时期的头上皮组织、下颌上皮组织、肢芽上皮组织和背部上皮组织为非牙源性上皮来源,通过大量的重组实验,发现E14.5磨牙间充质组织与E14.5下颌上皮组织的重组组合成牙效率最高(61.9%)。进一步探究E14.5天下颌表皮组织与磨牙间充质组织重组体的发育模式,发现能完全模拟小鼠磨牙的发育模式,E14.5天下颌表皮组织能正常分化成为成釉组织,并分泌釉质。说明E14.5天下颌表皮组织完全可以替代E10.5天的第二腮弓上皮组织用于牙间充质的诱导成牙潜能研究,并具快捷方便性。近年来,干细胞在牙再生研究中的应用越来越广泛。已有研究报道诱导多能干细胞,表皮干细胞以及牙龈上皮干细胞都能够被间充质诱导牙向分化。在本实验室的前期研究中发现人的表皮干细胞也是可以作为一种非牙源性上皮的来源进行小鼠牙间充质的诱导成牙潜能研究,但是也存在成牙效率低下的不足。本研究将在此基础上,将不同比例的表皮干细胞与E13.5天小鼠牙间充质进行重组,探究成牙率最高的细胞比率。通过不同细胞比例的实验,本研究发现人表皮干细胞与E13.5天小鼠牙间充质细胞的比例为1：9时,重组体具有最高的成牙率,达到92.6%,同时也能完全模拟牙齿的发育模式,人表皮干细胞也能分化成为成釉细胞,分泌釉质。本研究建立了一套高效的牙间充质诱导成牙潜能的体系,为后续的诱导成牙潜能的功能研究奠定了基础。许多生长因子在小鼠牙发育过程中各个阶段的表达模式已经得到了充分的研究。生长因子在不同组织的不同发育阶段的诱导成牙潜能中承担非常重要的作用。寻找成牙潜能的分子构成,是揭示成牙潜能的关键所在。本研究为了探究小鼠磨牙诱导成牙潜能的分子构成,首先通过体外器官培养体系,建立了小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能的丢失模型。将E14.5天的小鼠磨牙间充质体外分别培养24h,48h小时后,分别与非牙源性表皮重组,发现在培养24小时后,小鼠磨牙间充质诱导成牙能力大幅下降,成牙率仅为19.2%。而在培养48小时后,诱导成牙潜能完全则完全丧失。通过细胞染色发现,培养24小时和48小时后的牙间充质组织未发生坏死和凋亡,因此我们推测在牙间充质体外器官培养过程中,是由于某些基因的表达变化导致了诱导成牙潜能的丢失。本研究进一步利用RNA-Seq分析的方法,将体外培养Oh,24h,48h三个时间的E14.5小鼠磨牙间充质提取总RNA,进行RNA测序,通过系统生物信息学分析,筛选出基因表达量显著下调的基因有99个,同时基因表达量上调的基因有409个。通过GO功能富集分析,最显著富集的GO功能类别为oxygen binding、oxygen transport、oxygen transporter activity、organ development、 binding、cytosolic part、Multicellular organismal development。共富集包含39个基因,其中可能与诱导成牙潜能丢失相关的基因为Fgf3和Sfrp4。因此筛选得到Fgf3、Sfrp4作为诱导成牙潜能相关的候选关键分子。其中,Fgf3的表达水平随间充质组织在体外培养时间的增长而显著下调,Sfrp4在间充质组织在体外培养过程中显著上调。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因功能缺失技术和琼脂糖微球外源蛋白吸附手段,进一步探究Fgf3和Sfrp4是否是调控小鼠牙间充质诱导成牙潜能的关键信号分子。本研究首先选取了与牙齿发育相关的Msxl和Pax9作为阳性对照,筛选了组脱靶率低,敲除效果好的sgRNA。在细胞水平上建立了一套快速筛选sgRNA的方法,并在牙胚重组体系中建立了CRISPR/Cas9介导的慢病毒干扰表达体系。在E13.5天小鼠磨牙间充质细胞中沉默Msxl和Pax9的表达,不能诱导非牙源性的上皮细胞牙向分化,证明我们建立的CRISPR/Cas9介导的基因功能沉默体系有效可行。在E13.5天小鼠磨牙间充质细胞中沉默Fg/3的表达,与非牙源性的上皮细胞重组,探究Fgf3的功能缺失是否导致诱导成牙潜能的丧失,通过慢病毒感染小鼠牙间充质组织,并与非牙源性上皮组织重组。研究表明牙间充质细胞中Fgf3的表达缺失并不会明显下调诱导成牙潜能。在14.5磨牙间充质中敲除sFrp4后体外培养48h,与非牙源性上皮重组,未能挽救诱导成牙潜能。然而,本研究通过琼脂糖微球外源蛋白吸附手段,在E14.5天牙间充质组织中添加外源蛋白FGF3后,与非牙源性上皮组织重组,结果表明外源添加FGF3生长因子能显著挽救牙间充质丢失的诱导成牙潜能,成牙率达到43.8%。综上所述,本研究通过将小鼠磨牙间充质与同时期的不同非牙源性组织重组,以及不同比例人表皮干细胞与小鼠牙间充质细胞的重组,建立了简便研究牙间充质诱导成牙潜能的重组体发育模型。其中E14.5磨牙间充质与E14.5下颌上皮组织的重组成牙率达到61.9%,E13.5磨牙间充质细胞与人表皮干细胞的重组成牙率达到92.6%。利用小鼠牙间充质体外器官培养体系,建立了牙间充质诱导成牙潜能的丢失模型,发现小鼠E14.5磨牙间充质在体外培养24h诱导成牙潜能显著下降,48h后则完全丧失诱导成牙潜能。通过对诱导成牙潜能存在显著差异的间充质组织进行RNA-Seq分析,筛选出了牙间充质诱导成牙潜能的关键分子Fgf3和Sfrp4。最后通过基因的功能缺失和琼脂糖外源蛋白吸附手段,探究筛选得到的关键分子在小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能中的作用。成功建立由CRISPR/Cas9介导的慢病毒沉默体系,在磨牙间充质细胞中对Fgf3和Sfrp4分别进行功能沉默,对成牙潜能并无明显影响。而在已丢失诱导成牙潜能的间充质中添加外源蛋白FGF3,能够明显挽救诱导成牙潜能,证明Fgf3是小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能的关键分子。
姜明[5]2007年在《新生鼠皮肤表皮细胞牙源性上皮方向分化的实验研究》文中提出牙齿的发生和发育是由上皮和间充质在一系列信号分子组成的信号网络的精确调控下完成的。因此牙齿的生物性再生至少需要两种细胞:上皮源性细胞和间充质源性细胞。目前牙源性间充质细胞的替代研究进展较快而且取得了可喜的成绩,例如成体的牙髓干细胞、骨髓基质细胞均被证明具有形成牙髓-牙本质复合体的功能。在寻找牙源性上皮细胞替代细胞方面虽然也进行了一些研究,如诱导胚胎时期口腔粘膜上皮或皮肤表皮以及成体骨髓来源的细胞向成釉细胞转化,但这些研究多建立在应用胚胎早期组织基础之上,以出生后组织为来源寻找替代细胞的研究进展有限。寻找能够向牙源性上皮方向分化的成体或出生后组织来源的细胞对解决牙齿再生研究中上皮源性种子细胞来源的瓶颈问题具有重要意义。本研究着重探讨出生后1d仔鼠的皮肤来源的表皮细胞向牙源性上皮方向分化以及参与牙齿发育的能力。本课题主要进行了以下几方面的研究:1.牙乳头间充质细胞对皮肤表皮细胞牙向分化的体外诱导研究(1)皮肤表皮细胞的体外培养与鉴定以出生1d的SD仔鼠背部皮肤为组织来源进行表皮细胞培养。采用胞外基质的黏附法对原代培养的表皮细胞进行筛选,对筛选细胞的增殖能力、细胞表型以及细胞周期的特性进行分析。结果表明所经传代培养所得到的细胞具有良好的生物学特性,能够表达表皮干细胞相对特异性标识物CK19、CK14;流式细胞周期分析显示所培养的细胞多数处于G0/G1期。上述检测结果表明本实验所培养的表皮细胞中未分化细胞的含量较多。(2)牙乳头间充质细胞的体外培养采用显微分离法分离出生后1d SD仔鼠下颌第一磨牙的牙乳头,免疫组织化学染色结果表明分离获得的牙乳头组织中没有牙源性上皮的残余。采用酶消化法进行牙乳头间充质细胞(DPMCs)的原代培养并对细胞的纯度、表型、增殖能力以及矿化能力等特性进行分析。结果表明分离培养的DPMCs没有上皮性标记物pan-CKs的表达,但却能够稳定的表达VIM,RT-PCR分析显示所培养的DPMCs没有牙源性上皮特异性基因AMGN、AMBN的表达。进一步检测结果表明DPMCs具有较强的增殖能力和矿化诱导液诱导后分泌矿化基质的能力。结果证明本研究所获得的DPMCs没有上皮细胞污染、具有较强增殖活性和矿化能力。(3)牙乳头间充质细胞对表皮细胞牙向分化的体外诱导研究通过分层培养建立牙乳头间充质细胞对表皮细胞牙向分化的体外诱导模型,以牙胚细胞条件培养液为辅助诱导液对表皮细胞进行牙向分化诱导。结果表明经过体外6d的培养,表皮细胞能够表达牙源性上皮标记物AMBN,AMGN基因。进一步免疫细胞化学染色分析表明这些细胞能够稳定表达CK14,从而说明在该诱导条件下表皮细胞能够向牙源性上皮方向分化而不是向角质细胞方向分化。该诱导方案的建立为寻找非牙源性上皮细胞替代牙源性上皮细胞的研究奠定了实验基础。2.牙乳头间充质细胞对皮肤表皮细胞牙向分化的体内诱导研究(1)表皮细胞与牙乳头间充质细胞相互作用诱导模式的筛选建立了间充质细胞团块与表皮皮片、间充质细胞与表皮细胞混合接种支架材料、间充质细胞团块与表皮细胞团块分层组合、间充质细胞与表皮细胞混合细胞团块4种不同的牙齿再生上皮-间充质间的重组方案,培养14d后的结果表明间充质与表皮细胞混合团块培养体系中可以观察到类牙齿样结构,而其他三组中均无此类结构的形成。本实验最终筛选间充质细胞与表皮细胞混合团块体内培养的方法作为皮肤表皮细胞与牙乳头间充质细胞相互作用的体内诱导模式。(2)牙乳头间充质细胞对表皮细胞牙向分化的体内诱导研究采用间充质细胞与表皮细胞/组织混合团块体内培养的重组方案,分别将出生1d仔鼠的表皮皮片/细胞与原代的DPMCs按1;2的体积比混合重组后形成细胞团块,同时设立单纯的皮肤表皮皮片、表皮细胞和单纯的牙乳头间充质组织、DPMCs移植作为阴性对照。体内培养14d后进行组织学、免疫组织化学分析,结构显示,表皮皮片与DPMCs的重组体中可见由釉质、成釉细胞、牙本质、前期牙本质已及成牙本质细胞构成的不规则的牙齿样结构,表皮细胞与DPMCs形成的重组体中可见具有一定牙冠形态的牙胚样结构。进一步免疫组织化学染色分析和PKH26荧光标记均显示釉质形成细胞为皮肤来源的细胞。本实验首次证明了来自出生后1d的SD仔鼠皮肤的表皮细胞在一定的诱导条件下能够向牙源性上皮方向转化,同时还证明了本研究中所采用的诱导方法能够有效的促进皮肤表皮细胞向牙源性上皮方向转化。(3)牙乳头间充质细胞对出生后不同时间点皮肤表皮牙向分化的体内诱导研究分别取出生后4d、7d的仔鼠的背部表皮,将其与出生1d的仔鼠的DPMCs混合制备成细胞团块,经体内培养后进行组织学观察。结果表明2组重组体中均无釉质样结构的形成。本实验表明在同1d仔鼠表皮相同的诱导条件下,4d及7d仔鼠的表皮不具备向牙源性上皮方向转化的能力。3.牙髓间充质对皮肤表皮细胞牙向分化的体内诱导研究(1)牙乳头间充质细胞与牙髓干细胞生物学行为及成牙本质能力的比较研究采用有酶消化法及有限稀释的方法进行大鼠牙髓干细胞(DPSCs)的原代培养,并将所获得的DPSCs与DPMCs进行增殖能力、体外矿化能力、体内形成牙本质能力的比较,结果显示DPSCs具有与DPMCs相似的增殖能力、矿化和形成牙本质的能力。(2)牙髓间充质对出生1天仔鼠皮肤表皮细胞牙向分化的体内诱导研究通过分别建立牙髓干细胞、牙髓中1/3、牙髓根尖1/3组织与出生1d仔鼠表皮细胞的重组体观察牙髓间充质对表皮来源细胞牙源性上皮方向分化的诱导能力。将上述重组体体内培养14d后组织学结果显示3组中均无牙釉质样结构的形成。本部分实验结果证明虽然牙髓间充质来源于牙胚间充质且具有同DPMCs相似的形成牙本质-牙髓复合体的能力,但在对非牙源性上皮牙向分化诱导能力方面存在较大差异。综上所述,本研究首次证明了出生后1d SD仔鼠皮肤来源的表皮细胞在出生后1d的SD仔鼠的DPMCs的诱导下能够向牙源性上皮方向分化。相同的诱导模式下,牙髓间充质的诱导不能使皮肤来源的表皮细胞实现牙向分化。本研究为牙齿再生研究走向临床奠定良好的实验基础,也为其他多胚层组织和器官的重建开辟新途径,为牙齿再生研究牙源性上皮提供了新的种子细胞来源。
于金华[6]2007年在《牙髓干细胞形成牙体组织能力及其制备嵌合体牙齿的实验研究》文中进行了进一步梳理牙齿组织工程中局部诱导微环境的建立主要是通过支架材料或单因子诱导的方式,来促进牙髓干细胞的分化。由于牙齿发育的微环境异常复杂,涉及到上皮-间充质相互作用以及多种基质成分、矿物离子、生长因子的参与,单纯依靠支架材料或某几种生长因子等非生理诱导方式局限性较明显,不能满足组织工程化牙齿的形态发生要求。本研究拟通过模拟牙髓干细胞的体内生长发育环境,以重组微环境的方式来调控牙髓干细胞的分化和形态发生,并在此基础上,尝试利用牙髓干细胞研制同种异体“嵌合体牙齿”,以期为组织工程化牙齿最终的临床应用探寻一条新的研究途径。所取得的主要研究结果如下:1组织工程化牙齿异位再生环境的筛选和验证比较了出生后4 d的封闭群SD仔鼠磨牙牙胚器官,在同种异体宿主体内不同部位的生长发育情况,结果表明肾被膜下的牙胚发育状况接近正常;进一步将相关的牙齿组织块移植至肾被膜下,同样生长发育良好;单独将牙乳头细胞团进行肾被膜下移植,可以形成牙尖样的牙本质牙髓复合体。另外,我们还比较了传代前、后的牙胚细胞团在肾被膜下构建组织工程化牙齿的可行性,结果表明:原代牙胚细胞团体内可发育成典型的牙胚样结构,而第二代牙胚细胞团仅形成极少量的釉质,覆盖在牙本质牙髓复合体表面。上述结果证实肾被膜下环境有利于牙胚及其相关组织、细胞的继续生长发育。在肾被膜下的生长环境中,出生后的牙乳头细胞、牙胚细胞可分别再现牙齿间充质、牙胚早期的发育模式,说明牙齿形态发生所需的遗传信息是储存在离散后的单个牙源性细胞中的。2牙胚细胞诱导牙髓干细胞分化的实验为了验证牙胚细胞所提供的发育微环境是否适合成体牙髓干细胞的增殖、分化,本实验通过三种不同的培养方式:牙胚细胞条件液、分层培养、混合培养,观察牙胚细胞对牙髓干细胞生物学活性的影响。结果显示:牙髓干细胞在与牙胚细胞条件液培养、分层培养的情况下,可向功能性成牙本质细胞谱系分化,诱导分化后的牙髓干细胞团移植至肾被膜下,形成了规则的牙本质牙髓复合体结构。而牙胚细胞与牙髓干细胞混合培养方式不能提供了良好的促增殖、促分化的诱导环境,以致诱导后的牙髓干细胞不能形成典型的牙本质牙髓复合体。上述结果提示牙胚细胞与牙髓干细胞非接触式培养时,所提供的可溶性信号分子,有利于牙髓干细胞的牙向分化、牙本质形成;而接触式培养条件下牙胚细胞分泌的胞外基质蛋白以及不溶性表面分子,可能对牙髓干细胞的增殖起抑制作用,进而影响了其牙向分化的可持续性。3牙髓细胞对牙髓干细胞增殖分化的影响为验证来自成体牙髓细胞的微环境能否促进牙髓干细胞的增殖、分化,本实验采用酶消化法结合组织块法,获取原代牙髓细胞,与STRO-1+的牙髓干细胞以三种方式:条件液、分层培养、混合培养进行共培养。结果表明:缺少上皮信号的成体微环境不能有效地诱导牙髓干细胞的牙向分化和形态发生,但可明显促进其增殖活性。提示成体微环境中缺少促进牙髓干细胞牙向分化的启动信号,但成体微环境中生长因子、细胞外基质以及细胞表面分子等对牙髓干细胞的促增殖效应明显。4用牙髓干细胞制备嵌合体牙齿为进一步验证牙胚细胞的诱导作用是来自其中的上皮还是间充质成分,本实验将取自不同个体的大鼠切牙根尖蕾细胞、牙乳头细胞分别与STRO-1+牙髓干细胞复合形成细胞团重组体,肾被膜下移植,结果显示根尖蕾细胞-牙髓干细胞嵌合体在体内形成典型的牙冠样结构;牙乳头细胞-牙髓干细胞嵌合体形成的含骨样牙本质和牙本质牙髓复合体的结构中,PKH26标记的牙髓干细胞并未直接参与成牙本质细胞分化和牙本质形成,说明在牙胚细胞诱导牙髓干细胞牙向分化过程中,是牙源性上皮成分起了决定性作用。在与非牙源性STRO-1+骨髓基质干细胞嵌合成牙的比较研究中,我们发现:根尖蕾细胞能促进骨髓基质干细胞向成牙本质细胞谱系分化,但根尖蕾细胞-骨髓基质干细胞重组体在肾被膜下,仅发育成不典型的牙本质牙髓复合体,无釉质形成。提示在嵌合体牙齿研究中,牙源性成体干细胞比非牙源性成体干细胞更具有临床应用价值。当牙髓干细胞与根尖蕾细胞按不同比例进行体内重组时,我们发现:上皮细胞与牙髓干细胞的比例可影响嵌合体牙齿的形态发生,只有在1:1细胞比情况下,才会形成典型的牙冠样结构。综上所述,尽管不同的重组微环境对牙髓干细胞分化和形态发生的影响各不相同,但其规则的形态发生离不开牙源性上皮信号的诱导,从根本上讲,仍离不开上皮-间充质的相互作用。利用这一发现,本研究成功地用牙髓干细胞构建出嵌合体牙胚样结构。
刘皓, 姜建萍, 张娟娟, 潘智芳, 李孟杰[7]2017年在《FGF8辅助牙源性上皮诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞》文中指出目的:研究成纤维细胞生长因子8(FGF8)对成人牙髓干细胞(hDPSCs)定向分化为成牙本质细胞及牙髓组织的影响。方法:首先分离、克隆培养hDPSCs,通过流式细胞术检测细胞表面标志物鉴定hDPSCs;矿化液中添加50μg/L的FGF8诱导hDPSCs分化,通过real-time PCR检测分化后的细胞中牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)和核心结合因子α1(Cbfa-1)在mRNA水平的表达;E11.5小鼠牙源性上皮联合FGF8与hDPSCs细胞团重组,再将组织块种植于裸鼠肾囊膜下培养,通过DNA原位杂交鉴定成牙本质细胞及牙髓细胞的来源。结果:成功分离培养hDPSCs,其表面标志物CD29和CD90呈阳性表达;经FGF8诱导的hDPSCs形成较明显的矿化结节,并且牙本质特异性蛋白DSPP、BSP及Cbfa-1表达量上调;E11.5小鼠牙源性上皮联合FGF8可以诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞。结论:FGF8能够辅助牙源性上皮定向诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞,并形成牙本质及牙髓腔结构。
耿宁[8]2007年在《牙源性钙化囊肿临床病理和分子病理研究》文中研究表明目的研究牙源性钙化囊肿(calcifying odontogenic cyst; COC)的临床病理特点，探索在牙源性钙化囊肿病变中三个亚型，牙源性钙化囊性瘤、牙本质形成型影细胞瘤和牙源性影细胞癌中牙源性上皮的形成和分化特点，细胞的增殖活性，以及肿瘤恶性转变过程中相关因素的变化。材料1．收集44例资料完整的牙源性钙化囊肿石蜡包埋的组织块，包括了20例牙源性钙化囊性瘤、15例牙本质形成型影细胞瘤和9例牙源性影细胞癌。2．收集1例牙本质形成型影细胞瘤和1例牙源性影细胞癌的新鲜组织标本，低温冻存。方法1．通过对常规苏木素-伊红染色切片的观察，分析牙源性钙化囊肿三个亚型的临床病理特点。2．免疫组织化学方法分析牙源性钙化囊肿三个亚型的细胞角蛋白表达的差异。分析牙源性钙化囊肿三个亚型牙源性上皮细胞增殖活性的差异，以及和肿瘤生物学行为、预后的相关性。3．免疫组织化学、酶谱分析、逆转录-聚合酶链式反应分析在牙本质形成型影细胞瘤和牙源性影细胞癌中基质金属蛋白酶2、9、14和基质金属蛋白酶抑制剂1、2在转录和翻译水平表达的差异。结果1．牙源性钙化囊肿的三个亚型，牙源性钙化囊性瘤、牙本质形成型影细胞瘤和牙源性影细胞癌是相互独立的病变。牙源性钙化囊性瘤在组织学特点和生物学行为方面类似于牙源性囊肿。2．CK8、CK14、CK19和CK10的联合免疫组织化学染色，对COC的组织来源，鉴别诊断，病变的组织特点以及生物学特点等多方面都有一定的帮助。3．在COC中牙源性上皮的增殖活性较为复杂，很难将PCNA和Ki-67的表达强度和肿瘤的生物学行为和预后联系起来，并且PCNA阳性指数和Ki-67阳性指数之间并没有明确的相关性。4．在COC中TIMPs和MMPs之间存在着微妙的复杂的调控机制，以维持TIMPs和MMPs之间动态的平衡状态，而不是简单的抑制被抑制的关系。MMP-9和TIMP-1的表达和COC肿瘤的良恶状态有一定的相关性。结论牙源性上皮的复杂性导致了牙源性钙化囊肿组织学表现的多样和生物学行为的复杂。在影响牙源性钙化囊肿生物特点的因素中，细胞角蛋白表达的差异、基质金属蛋白酶及其抑制剂表达的差异可以为牙源性钙化囊肿的组织来源，行为特点的判断提供帮助。综上所述，对牙源性钙化囊肿的研究，可以为病变的来源、性质、行为特点的判断提供一定的帮助，但进一步深入的研究还需要追溯到参与牙源性上皮分化调控的相关因素。
白喜云[9]2007年在《表皮干细胞向牙上皮诱导分化的研究》文中研究说明研究背景：牙齿是一个特殊的器官，它由釉质、牙本质和牙髓组成。釉质位于最外层，是人体内最坚硬的组织。釉质包绕着另一层牙齿组织即牙本质。牙髓位于牙齿的中央，它包含有血管、神经以及其它的结缔组织。牙齿的发育开始于胚胎早期，两种不同的胚胎细胞——外胚层上皮源性的原始口腔上皮细胞和外胚层神经嵴源性的原始口腔间充质细胞相互作用指导牙齿的发育，决定它的结构、大小和类型。原始口腔上皮细胞分化成分泌釉质的成釉细胞，进而形成成釉器，最终形成釉质：原始口腔间充质细胞分化成分泌牙本质的成牙本质细胞，后来发育成为牙乳头和牙囊。最终，牙乳头形成牙本质和牙髓，牙囊形成牙骨质和其它附属组织。胚胎内部基因的激活控制着牙齿发育的整个程序。牙齿的替代在大多数非哺乳类脊椎动物遍及一生，而在大多数哺乳类脊椎动物只可替换一次。有些牙齿则完全没有被替换的可能，包括部分人类的牙齿和小鼠的牙齿。因此，如果这些牙齿受到腐蚀或者机械损伤，就可能造成永久性的不可修复的损伤。作为一门学科，组织工程学在15年前就已经诞生。她使用工程学的原理并结合人们对生物学的理解，运用生物科学的途径去再生新的组织。最近，随着牙齿发育生物学知识的积累、干细胞研究的发展、牙齿生物矿化原理理解的不断深入，结合组织工程方法和仿生学技术上的实践，为小孩或者成人牙齿萌出后成釉细胞的缺失以及牙齿釉质损伤的修复奠定了基础。虽然近年来的研究显示牙齿含有干细胞，然而受到细胞来源、增殖能力、分化潜能的限制，到目前为止不可能使用牙源性的干细胞来再生牙齿组织。因此，必须考虑一种新的具有可塑性的干细胞来源。已有研究证实，非牙源性的干细胞。比如骨髓源性干细胞，在适宜的环境下能够获得牙上皮细胞的特征。几十年前人们就已经证实皮肤组织内包含有表皮干细胞，它们负责表皮的修复和再生。最近，越来越多的研究表明表皮干细胞具有多向分化潜能和较强的可塑性，在适宜环境下可以分化成为多种类型细胞。皮肤和牙齿都是外胚层源性的器官，它们早期的发育都受到表皮—间充质交互作用机制的调节。所以，我们假设在适宜的环境下皮肤来源的表皮干细胞可能分化成为牙上皮，能够成为成釉细胞的一种来源。研究目的：本实验研究目的在于建立一种有效地传导胞间信号的诱导体系，将表皮干细胞诱导成为具有牙上皮特征的组织，实现组织工程化釉质的再生。研究方法：本研究在分离表皮干细胞的基础上，从体内诱导和体外诱导两个途径对表皮干细胞分化为牙上皮的可行性进行了研究。1)大鼠表皮干细胞的分离、培养与鉴定：使用鼠尾胶原快速黏附法分离新生大鼠的表皮干细胞，在无血清培养基(K-SFM)中进行培养。通过以下方法对表皮干细胞进行鉴定：记录生长情况，制作细胞生长曲线；免疫组化方法检测CK-19以及整合素-β1表达情况；流式细胞仪测定细胞周期；肾被膜下诱导观察分化情况。2)牙乳头组织诱导表皮干细胞分化及其结果鉴定：新生大鼠牙胚使用胰酶和胶原酶(1：1)处理后分离为牙上皮和牙乳头两部分。将分离后的牙乳头直接与PKH26标记的表皮干细胞重组作为实验组一。将牙上皮继续消化为单细胞，然后与PKH26标记过的表皮干细胞混合。将混合物的细胞成分离心处理，再与牙乳头重组作为试验组二。两种重组体在饱和湿度的CO2培养箱内培养48小时，随后移植入成年SD大鼠肾被膜下。在重组体植入后两周或者三周时，收集移植体。将移植体制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察荧光表达情况，结合H&E染色结果分析组织学变化。使用免疫组化的方法检测CK-14在重组体的表达。完整的全牙胚、单独的牙上皮以及单独的牙乳头分别作为对照组。3)牙胚细胞及其条件培养基诱导表皮干细胞分化及其结果鉴定：分离并培养新生大鼠第一磨牙全牙胚细胞，生长至60～70％汇合时，将其与表皮干细胞共培养进行诱导分化；或者采集全牙胚细胞的培养液，直接对表皮干细胞进行诱导分化。光镜下观察细胞形态变化，使用RT-PCR检测成釉蛋白(AMBN)和釉原蛋白(AMGN)mRNA的表达。牙上皮细胞和表皮干细胞分别做为对照组。研究结果：1)鼠尾胶原黏附法能够成功的分离表皮干细胞，这些细胞在K-SFM中能够良好扩增。CK-19以及整合素-β1免疫组化试验结果呈阳性。细胞周期分析81.2％的细胞在G_0/G_1期，显示细胞慢周期性。移植到肾被膜后能够分化，展现表皮样结构。说明分离到的细胞具有表皮干细胞特征。2)表皮干细胞与牙上皮细胞混合后再与牙乳头组织构建的重组体在肾被膜环境下能够良好的发育，具有正常牙齿的硬度和色泽。组织学分析显示重组体内有牙齿样的结构形成，其内部有明显的类釉质结构。类釉质结构能够释放PKH26的红色荧光，同时免疫组化显示CK-14呈阳性表达。说明表皮干细胞参与了类釉质结构的形成。但是，将单一的表皮干细胞与牙乳头重组时，没有齿样结构形成。3)与新生大鼠第一磨牙全牙胚细胞共培养后的表皮干细胞出现形态学的变化，细胞的形态变得更长，部分细胞呈簇状生长。免疫组化显示这些细胞中CK-14呈现阳性表达，显示细胞已经发生分化。AMBN mRNA和AMGN mRNA表达呈弱阳性。说明表皮干细胞在共培养状态下具有向牙上皮细胞分化的倾向。而使用牙胚细胞条件培养基诱导的试验组，细胞形态出现微弱的变化，在培养60h时细胞出现明显凋亡。结论：1)新生大鼠表皮干细胞具有一定的可塑性，在适宜诱导条件下可以分化形成类釉质结构。2)新生大鼠的牙乳头包含有一系列的信号分子，它们可以诱导表皮干细胞牙向分化。3)表皮干细胞与全牙胚细胞共培养时，能够诱导表皮干细胞向牙上皮细胞分化。
江宏兵, 田卫东, 刘来奎, 徐艳[10]2007年在《鼠切牙根端牙源性上皮细胞的体外培养及生物学特征》文中研究指明目的:体外分离培养鼠切牙根端上皮细胞并观察其体外生物学特征。方法:体视显微解剖获取大鼠下颌切牙根端组织,组织块贴壁法培养分离牙源性上皮细胞,形态学结合免疫细胞化学观察其体外生物学特征。结果:牙源性上皮细胞自切牙唇侧颈环处迁出,呈圆形或方形的典型上皮细胞形态,Brdu标记显示其较强的体外增殖活力,上皮干细胞标记分子P63强阳性表达;随着传代,细胞趋向终末分化,碱性磷酸酶染色阳性。结论:鼠切牙唇侧颈环处可能存在牙源性上皮干细胞或前体细胞,为进一步研究牙源性上皮分化和牙组织工程提供细胞来源。
参考文献：
[1]. 牙源性上皮分化的单克隆抗体研究[D]. 高志荣. 第四军医大学. 1988
[2]. 用人牙源性上皮和间充质细胞构建组织工程牙齿样结构的实验研究[D]. 包柳郁. 第四军医大学. 2004
[3]. 造釉细胞瘤组织发生的分子病理学研究[D]. 高玉好. 第四军医大学. 1995
[4]. 小鼠磨牙间充质成牙潜能的关键分子[D]. 黄峰. 福建师范大学. 2015
[5]. 新生鼠皮肤表皮细胞牙源性上皮方向分化的实验研究[D]. 姜明. 第四军医大学. 2007
[6]. 牙髓干细胞形成牙体组织能力及其制备嵌合体牙齿的实验研究[D]. 于金华. 第四军医大学. 2007
[7]. FGF8辅助牙源性上皮诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞[J]. 刘皓, 姜建萍, 张娟娟, 潘智芳, 李孟杰. 中国病理生理杂志. 2017
[8]. 牙源性钙化囊肿临床病理和分子病理研究[D]. 耿宁. 四川大学. 2007
[9]. 表皮干细胞向牙上皮诱导分化的研究[D]. 白喜云. 西南大学. 2007
[10]. 鼠切牙根端牙源性上皮细胞的体外培养及生物学特征[J]. 江宏兵, 田卫东, 刘来奎, 徐艳. 实用口腔医学杂志. 2007
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