崔国峰1 徐建伟1 王雁飞2
1青岛市第八人民医院肾脏内科 266100 2青岛大学附属医院肾脏内科266000
【摘要】目的 研究解耦连蛋白2（UCP2）在糖尿病大鼠肾脏中的表达，探讨线粒体氧化应激水平与UCP2表达的相关意义。方法 链脲佐菌素60mg/kg腹腔注射构建1型糖尿病大鼠模型，造模成功者为糖尿病组（D组 n=25），并设置健康对照组（C组 n=25）。结果 D组肾脏的病理改变于4周时变化不明显，8周及12周较C组明显加重；Western-blot显示D组4周、8周及12周肾脏中UCP2的表达逐渐升高，且明显高于同时间的C组（P<0.05）。结论 UCP2在糖尿病大鼠肾脏中表达的升高，表明线粒体氧化应激在糖尿病肾病的发展中起重要作用。
【关键词】糖尿病肾病；氧化应激；UCP2
The relationship of UCP2 and oxidative stress in the kidney of diabetic rats
Cui Guofeng1, Xu Jianwei1,Wang Yanfei2
1Qingdao Eighth People's Hospital of renal Department of Internal Medicine 266100
2Department of internal medicine, Affiliated Hospital of Qiingdao University 266000
【Abstract】Objective To investigate the expression of UCP2 and its mechanism with oxidative stress in the kidney of STZ induced diabetic rats. Method 50 rats were randomly divided into two groups: control group (group C n=25)and diabetic group (group D n=25).Rats in group D were given STZ (60mg/kg) by intraperitoneal injection to establish diabetic rat model. Result The pathological changes of the kidney in group D were not distinct at 4th weeks, but the pathological changes were much more serious than group C at 8th weeks and 12th weeks. The expression of UCP2 in group D were much higher than group C at 4th、8th and 12th weeks in Western-blot, the differences had statistical significance (P<0.05).Conclusion The expression of UCP2 increases in diabetic rat model, which indicates that mitochondrial may take part in the progression of diabetic nephropathy.
【Key words】diabetic nephropathy；oxidative stress；UCP2
目前随着生活质量的提高及饮食结构的改变糖尿病的发病率逐年升高，我国糖尿病的发病率位居世界第二，糖尿病肾病是糖尿病较严重的并发症之一，并且在我国已成为继慢性肾小球肾炎之外的引起终末期肾病的主要原因，部分西方国家糖尿病肾病则是引起终末期肾病的首要原因。目前大量研究表明氧化应激在糖尿病肾病的发生及发展中起重要作用。UCP2是解耦连蛋白家族中的成员，位于线粒体的内膜上，可以使呼吸链中氧化与磷酸化解耦连，从而减少活性氧产物（ROS）的产生。但目前为止尚未见关于UCP2在糖尿病肾脏中的表达。本实验通过研究糖尿病大鼠肾脏中UCP2的表达情况，评估线粒体的氧化应激水平，进一步探讨糖尿病肾病的发病机制。
一、材料与方法
1. 实验动物与主要试剂
6-8周清洁级，体质量为220-250g健康雄性Wistar大鼠，购自山东鲁抗实验动物中心，兔抗大鼠UCP2抗体（美国Santa Cruz公司），血糖试纸（美国强生），链脲佐菌素（美国sigma公司），辣根过氧化物酶标记二抗（美国Santa Cruz)。
2. 实验方法:
2.1 糖尿病大鼠模型的建立：50只体质量为220-250g的清洁级Wistar大鼠适应性喂养1周后，随机分为糖尿病组（D组 n=25）及健康对照组（C组 n=25）。用0.1mmol/L枸橼酸-枸橼酸纳缓冲液（PH4.5）将STZ配制成浓度为1%的溶液，给予大鼠STZ（60mg/kg）腹腔注射建立1型糖尿病大鼠模型，72小时后鼠尾静脉取血测血糖，血糖大于16.7mmol/L，并可维持1周者视为成功糖尿病大鼠模型。
2.2 标本采集：D组及C组大鼠分别于4周、8周及12周留取24小时尿，离心机1500r/min离心10min，取上清，放置于-80℃冰箱冻存。并于4周，8周及12周于D组及C组取8只大鼠给予5%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射，并于麻醉后开腹取双肾，去除肾表面包膜，将肾脏纵向剖开，取肾组织放于液氮中冻存，行Western-blot。
2.3 肾脏病理：肾组织固定，石蜡包埋后切片（2μm），PAS染色，光镜下观察各组大鼠4周、8周及12周的肾脏病理改变。
2.4 Western-blot检测肾脏中UCP2的表达：液氮中取出肾组织，充分研磨、裂解、离心，取上清液测定蛋白浓度，100℃加热5min，取40ug/lane上样，样本用15％Tris-Glycine胶电泳分离蛋白后，电泳转到PVDF膜上，将PVDF膜放于封闭液中1h，然后将膜移至一抗工作液中，与兔抗大鼠UCP2抗体(1：100) 4℃过夜，后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：2000)，室温孵育l小时后洗去二抗，应用ECL检测样本的免疫活性，曝光盒中曝光，x胶片显影，扫描胶片（美国UVP分析仪器），得出灰度值，用同样方法标记鼠单克隆抗体β-actin作为内参对照。
2.5 统计学处理：数据以均数±标准差表示，计量资料符合正态分布采用单因素方差分析，组间两两比较应用Bonferroni检验，免疫组化染色积分采用非参数统计方法，显著性水平设为P<0.05，所有资料应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。
二、结果
1. 病理结果： D组4周时肾脏病理变化不明显，8周PAS染色可见肾小球体积增大，肾小球基底膜较C组增厚,12周时病理改变进一步加重.而C组大鼠肾脏在4周、8周及12周时未见上述病理改变。（图1）
2. Western-blot：4周，8周及12周的D组肾组织中UCP2的表达明显升高，并且随病程的延长其表达量逐渐升高，C组4周，8周及12周UCP2的表达量无明显增加，同时间D组与C组相比差别有统计学意义（P<0.05）。(图3)
三、讨论
线粒体是机体能量的主要来源，对于维持正常的生理活动起着重要作用，同时也是ROS的主要来源。UCP2是位于线粒体内膜上调节质子跨膜转运的载体蛋白。人类UCP2基因位于染色体11q13，其组织分布较广泛，脂肪组织中高表达，骨骼肌、胰岛、肝脏及肾脏等器官中均有表达。UCP2具有解耦连活性，可通过线粒体内膜质子跨膜转运引起质子经线粒体内膜的回漏增加，使合成线粒体跨膜电化学梯度降低，从而引起ATP的合成减少[1]，导致氧化与磷酸化过程解耦连，同时增加呼吸链中电子传递的速度，缩短半醌（QH-）存在的时间，防止电子由QH-传递给O2，从而减少ROS的生成。
孙静等研究发现瞬时受体蛋白γ1（TRPγ1）可以通过激活激活CAMP/PKA途径提高体外培养的内皮细胞中ROS的产生，并且可提高NO的水平，从而起到内皮细胞保护作用[2]，并且相关研究也发现UCP2可以减少血管内皮生长因子的表达，从而降低视网膜血管的通透性，减少新生血管的形成，并且可以抑制视网膜细胞的凋亡，从而起到视网膜保护作用[3]。目前针对UCP2在糖尿病肾脏中的表达及其作用的研究较少。
本实验发现在糖尿病大鼠肾脏中UCP2的表达较正常大鼠明显升高，且随着疾病时间的增加其表达也逐渐升高。机体血糖升高时氧化应激水平也随之升高，在ROS的作用下UCP2的表达开始增多。一方面UCP2表达增多后可通过“质子漏”机制降低线粒体内膜的跨膜电化学梯度，使电子的传递速度加快，减少了超氧阴离子的生成，从而使ROS的产生减少；另一方面高表达的UCP2可通过多种途径起到组织保护作用。Sanming等发现UCP2表达增多后可直接抑制ROS的产生，同时可抑制caspase9的活化及细胞色素C的释放从而抑制细胞凋亡，并且UCP2也可抑制抗凋亡基因Bcl-2表达的减少，以此抑制细胞凋亡[4]。
UCP2可以通过降低氧化应激水平，抑制细胞凋亡及炎症反应等途径起到糖尿病肾脏的保护作用。但与此同时胰岛细胞也有UCP2的表达，由甾醇调节因子结合蛋白1c(SREBP-1c)、过氧化物酶体增殖物受体γ（PPARγ）及PPARα调节其表达。高糖作用下可激活以上因子，使UCP2过表达，而UCP2是胰岛分泌的负性调节因子，可导致β细胞功能障碍，从而抑制葡萄糖刺激的胰岛素的分泌[5]，可导致血糖升高，而高血糖又引发氧化应激水平的升高。与此同时，过度表达的UCP2影响了线粒体正常呼吸链的氧化磷酸化过程，减少了ATP的生成，使得线粒体内的能量储备降低，从而导致肾脏抗急性损伤能力的下降，使糖尿病肾脏在肾毒性物质的作用下或急性肾缺血时更易发生急性肾损伤。
本研究发现UCP2可反映糖尿病肾脏的氧化应激水平，但其具体作用机制尚不明确，需进一步研究。
参考文献
[1] Charles Affouourtit,Martin Jastroch,Martin D,et al.Uncoupling protein-2 attenuates glucose-stimulated insulin secretion in INS-1E insulinoma cells by lowering mitochondrial reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 2011,50(5): 609–616.
[2] Jing Sun,Yunfei Pu,Peijian Wang et al. TRPV1-mediated UCP2 upregulation ameliorates hyperglycemia-induced endothelial dysfunction. Cardiovascular Diabetology 2013, 12:69.doi: 10.1186/1475-2840-12-69.
[3] Zheng Z，ChenH，KeG，el a1．Protective effect of perindopril on diabetic retinopathy is associated with decreased vascular endothelial growth factor-to-pigment epithelium-derived factor ratio：involvement of a mitochondria-reactive oxygen species pathway．Diabetes，2009，58(4)：954-964．
[4] Sanming Deng,Ye Yang,Yong Han,et al. UCP2 Inhibits ROS-Mediated Apoptosis in A549 under
Hypoxic Conditions. PLoS ONE 7(1): e30714. doi:10.1371/journal.pone.0030714.
[5] Li Y，MaedlerK，Shu L，ela1．UCP-2 and UCP-3 proteins are differentially regulated in pancreatic
Beta-cells．PLoS One，2008,3(1)：e1397-1403．
论文作者:崔国峰1,徐建伟1,王雁飞2
论文发表刊物:《医师在线》2015年10月第20期供稿
论文发表时间:2016/1/11
标签：肾脏论文; 线粒体论文; 糖尿病论文; 大鼠论文; 病理论文; 细胞论文; 蛋白论文; 《医师在线》2015年10月第20期供稿论文;