王恒东１ 刘东璞２
（１双鸭山煤炭总医院２佳木斯大学基础医学院病理生理教研室）
【摘要】目的：探讨新活素对心力衰竭大鼠模型中白介素６（ＩＬ－６）以及Ｂ型尿钠肽（ＢＮＰ）表达的影响。方法：健康大鼠４０只随机分成四组：Ａ组（１０只，对照组）：正常饲养，不做任何处理；Ｂ、Ｃ、Ｄ组分别１０只为造型成功组，而后每日用生理盐水灌胃；每日卡托普利１５ｍｇ／ｋｇ灌胃；以及新活素１８μｇ／ｋｇ灌胃。饲养６０天后全部处死，对白介素６以及Ｂ型尿钠肽（ＢＮＰ）的表达水平进行血液及心肌组织免疫组织化学检测及相关统计分析。结果：心衰模型组与对照组比较，大鼠血清中白介素６以及ＢＮＰ水平明显升高，新活素组以及卡托普利组与心衰模型组相比较，血清中白介素６以及ＢＮＰ水平明显降低；免疫组化检测显示心衰模型组与对照组比较白介素６以及ＢＮＰ水平明显升高；新活素干预组及卡托普利干预组白介素６以及ＢＮＰ表达水平均较心衰模型组明显降低。结论：新活素和卡托普利一样能够有效改善心衰，减轻心衰症状，调节神经内分泌，改善预后。
【关键词】新活素；心力衰竭；白介素６；Ｂ型尿钠
【中图分类号】Ｒ２ 【文献标号】Ａ 【文章编号】２０９５－７１６５（２０１５）０７－０３７３－０２
慢性心力衰竭是大多数心血管疾病的终末阶段，临床上以肺循环和体循环淤血为主要特征［１－２］。慢性心力衰竭总体预后差，对轻、中度慢性心力衰竭的早期诊断及评价治疗效果可明显改善患者的预后［３］。心力衰竭过程中炎性细胞因子发挥了重要作用
［４］，“神经激素模式”是慢性心力衰竭主要的发病机制之一，同时炎性细胞因子的假设又进一步补充了其发病机制［５］。而新活素是自从在２００１年８月美国食品和药品管理局（ｆｏｏｄａｎｄｄｒｕｇｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ）批准ｒｈＢＮＰ药物奈西利肽用于治疗急性心力衰竭，２００５年欧洲心脏病学会将ｒｈＢＮＰ列入心衰的治疗指南，我国研发的ｒｈＢＮＰ（商品名：新活素）于２００５年１０月上市。多项大型临床研究已证实了应用ｒｈＢＮＰ治疗心力衰竭取得了良好的临床治疗效果。此实验应用新活素以及卡托普利对心力衰竭模型大鼠血清中细胞因子白介素６（ＩＬ－６）、以及ＢＮＰ水平进行检测，并探讨新活素在临床中应用的相关性。
１ 实验材料
１１ 主要实验药物：盐酸阿霉素（上海博麦德生物技术有限公司）；新活素（冻干重组人脑利钠肽）成都诺迪康生物制药有限公司；白介素６免疫组化试剂盒（上海彩佑实业有限公司）白介素６放免试剂盒（深圳新产业生物医学工程股份有限公司），卡托普利（海南普利制药股份有限公司，批准文号Ｈ４６０２０１２６）。
１２ 实验动物：体重为２３０－２８０克健康成熟ＳＤ大鼠４０只（雌雄不限）佳木斯大学动物实验中心提供
１３ 主要试剂与设备：ＦＡ２００４电子分型天平（杭州市精密电子科学仪器有限公司）；动物人工呼吸机ＭＯＤＥＬ（上海玉研科学仪器有限公司）泰盟ＢＬ－４２０Ｆ生物技能分析系统（四川省成都市精密仪器有限公司）；美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ单道可调式加样器；ＦＪ２ＯＯ８Ｇγ免疫计数器（安徽中科中法科学仪器有限公司）；ＣＭＩＳ型医学图像分析系统（重庆天海医疗设备有限公司）；Ｗ６ｍ－２恒温水浴箱（广州聚能生物科技有限公司）；ＹＤ－Ａ摊片机（上海精密仪器仪表有限公司）。
２ 实验方法
２１ 动物分组以及制作心衰模型：
选择体重为２３０－２８０克健康成年ＳＤ大鼠４０只随机分成四组：Ａ组（１０只，对照组）：正常饲养，不做任何处理；Ｂ组（１０只，心衰模型组）：于实验开始后第１、３天腹腔注射（ｉｐ）ＡＤＲ２ｍｇ／ｋｇ；第５、７天ｉｐＡＤＲ３ｍｇ／ｋｇ；第９、１１天ｉｐＡＤＲ１ｍｇ／ｋｇ；第１３、１５天ｉｐＡＤＲ４ｍｇ／ｋｇ，１６天累计用药量达２０ｍｇ／ｋｇ。末次给药２４小时后，随机提取模型大鼠２只，断头处死，取出心脏，制作常规病理切片，作心力衰竭判定（取材前１２小时禁食水，停药后２４小时称体重）。造模成功后每日用生理盐水灌胃；Ｃ组（１０只，卡托普利干预组）：同Ｂ组，造模成功后每日卡托普利１５ｍｇ／ｋｇ灌胃；Ｄ组（１０只，新活素干预组），造模成功后每日予以新活素１８μｇ／ｋｇ灌胃。Ｂ、Ｃ、Ｄ三组于实验的第６０天全部处死，取血及心脏组织做血清学及组织学检测。
２２ 观察项目以及检测方法
２２１ 动物的生理习性（呼吸、进食饮水、毛色及活动以及排便情况）以及组织学变化，体重变化心脏重量以及其余大鼠重量比值以及心功能监测。
２２２ 生化检验及病理学：检查给药结束后，处死大鼠后取血样作ＢＮＰ及ＩＬ一６含量检测，均采用酶联免疫法测定，具体步骤按试剂盒说明书方法进行。最后放血处死大鼠，取左室心肌部分，以１Ｏ％ 甲醛固定，常规石蜡包埋，病理切片，ＨＥ染色，进行白介素６以及ＢＮＰ免疫组化染色过程，光镜观察。
２３ 所有实验数据应用ＳＰＳＳ１７０软件进行统计学分析，计量资料均以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，组间两两比较采用Ｆｉｓｈｅｒ测定分析，Ｐ＜００１为差异有统计学意义。
３ 实验结果
３１ 动物的生理习性以及组织学变化
３１１ 一般形态变化
Ａ组：无论在呼吸、进食饮水、毛色及活动以及排便情况均未发现异常；Ｂ、Ｃ、Ｄ组：在前四次注射阿霉素时均多少不等出现精神萎靡，呼吸急促，倦怠，不喜欢活动，行动缓慢，尿量减少，腹泻，脱毛现象明显，并且死亡三只，最终实验观察２５只。３
１２ 体重变化
Ａ组：大鼠体重明显增加，平均增加１６５±５０８ｇ，Ｂ组体重增加不明显约为１０４±２０１ｇ，Ｃ、Ｄ组大鼠明显增加，平均增加２０３±４０８ｇ。
四组之间比较，大鼠初始体重无明显差异，Ｂ、Ｃ、Ｄ组大鼠明显增加，与Ａ比较有明显差异，但Ｂ、Ｃ、Ｄ组无明显差异。
３１３ 心脏重量以及其余大鼠重量比值处死大鼠，Ａ组大鼠胸腔未见明显变化，Ｂ、Ｃ、Ｄ各组大鼠胸腔内可见多少不等胸水，而且可见不同程度的肺水肿，心脏明显增大，且心脏收缩乏力。各组大鼠体重结果（见表１）。
表１ 各组间大鼠体重以及心脏重量的比较（ｘ±ｓ）（单位：ｇ）
注：各组与对照组比较无明显差异，Ｐ＞００１；＃各组与对照组比较有显著性差异，Ｐ＜００１
３２ 各组大鼠心功能指标测定结果：
Ｂ组ＬＶＳＰ、ＬＶＥＤＰ、ＬＶ＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＬＶ－－ｄｐ／ｄｔｍａｘ水平明显升高，干预组Ｃ组及Ｄ组其水平均有下降，差别有显著性，Ｐ＜００１；Ｃ组及Ｄ组间差别无显著性Ｐ＞００１。见图１
图１ 大鼠心肌血流动力学指标变化
３３ 大鼠血清ＢＮＰ、ＩＬ－６含量及免疫组化测定Ｂ组中血清检测ＢＮＰ、ＩＬ－６水平含量明显高于Ａ、Ｃ及Ｄ组，差异显著（Ｐ＜００１），而Ｃ组与Ｄ组对比差异不显著（Ｐ＞００１），见表２。免疫组织化学染色阳性结果呈棕褐色，位于细胞浆及细胞膜，见图２。Ａ组阳性率１０００％，Ｂ组阳性率８７５０％，Ｃ组阳性率２５００％，Ｄ组阳性率３３３３％，Ｂ组与Ａ、Ｃ、Ｄ组比较差异显著Ｐ＜００１（Ｐ＝０００５４）；Ｃ组与Ｄ组间差别无显著性，Ｐ＞００１（Ｐ＝１０００），见表３。
表２各组大鼠血清检测ＢＮＰ和ＩＬ－６含量变化（ｘ±ｓ）（ｐｇ／ｍｌ）注：Ｆｉｓｈｅｒ测定结果：Ｂ组与Ａ、Ｃ、Ｄ组比较ＩＬ－６水平明显升高，差异显著Ｐ＜００１；＃Ｃ组及Ｄ组间差别无显著性，Ｐ＞００１（Ｐ＝１０００）。
图２各组大鼠血清心肌细胞ＩＬ－６免疫组化结果（Ａ强阳性Ｂ中等阳性Ｃ阴性）
４ 讨论
阿霉素是临床上常用的一种非特异性周期抗肿瘤化疗药物。因其具有心脏毒性用于建此模型。途径主要有经腹腔，静脉和冠脉内注射阿霉素。阿霉素诱导的心衰是剂量依赖性的，短期大量腹腔给药动物死亡率高，模型成功率低。目前多采用小剂量多次腹腔给药的方法，致死率明显减低，所以控制动物的死亡是我们该试验的关键所在，它的这种毒性反应严重程度与应用的累计剂量有关，关于其引起心脏毒性反应的机制，目前还不明确，有研究认为，Ａｄｒ慢性心脏损伤的机制与阿霉素形成大量自由基引起生物膜脂质过氧化反应有关。找到一种诱导成功率高，同时又能够降低动物死亡率的方法一直是我们的期待。在制作此动物心衰模型中死亡大鼠三只，我们主要观察到模型大鼠２５只。
ＩＬ－６在炎症反应中起核心调节作用，是炎症免疫反应的重要递质，而炎症反应是近年来备受关注的一种引起心血管疾病的危险因素。ＩＬ－６不仅具有抗炎作用也有抗炎活性。它不仅有免疫细胞以及免疫辅助细胞，包括单核细胞和巨噬细胞等产生，也可以有血管成分（血管平滑肌细胞）以及缺血心肌细胞。尤其引起广大临床内科医生兴趣的是它不仅参与炎性反应，而且也参与心脏代谢调节。
ＢＮＰ与心力衰竭钠尿肽系统钠尿肽（ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＰ）家族包含四种激素，Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ，它们都有一个由１７个氨基酸的二硫环状结构组成。当Ｂｏｌｄ及同事将心房细胞提取物注入大鼠后发现了利钠和血管舒张，证明了其重要性，这种分泌颗粒的产物就被命名为心房钠尿肽［６］。ＢＮＰ是心脏利钠肽的一种，具有扩张血管、利尿、利钠，抗增殖，抑制交感系统和肾素－血管紧张素系统活性，而在ＨＦ中两者是处于过度激活状态的。
脑钠素（ＢＮＰ）主要由左心室合成并分泌，是反映室壁张力和心室腔大小的敏感指标；心钠素（ＡＮＰ）主要由心房合成和分泌，容量负荷和心房肌张力增加是影响其释放的关键因素，包括利钠，舒张血管、抗增殖，抑制交感系统和肾素－血管紧张素系统活性，而在充血性心力衰竭中两者是处于过度激活状态的。
新活素（ｒｈＢＮＰ）是利用基因工程技术合成的与ＢＮＰ生物作用完全相同的重组产物，其在心力衰竭中的治疗过程中已经得到广大心血管专家的认可以及应用。目前已有文献表明了ｒｈＢＮＰ在冠心病中的应用。已有研究表明张桂娟研究表明ＰＧＩ２的含量与冠状动脉病变支数成反比，动脉硬化越严重，ＰＧＩ２合成越少，提示冠心病患者存在血管内皮细胞分泌血管活性物质的平衡失调［７］新活素（冻干重组人脑利钠肽）是一种粉针制剂，在心血管病急性心力衰竭指南已经明确推荐，ｒｈＢＮＰ在体内与Ａ型和Ｂ型受体结合，触发细胞内第二信使环鸟苷酸的激活，导致细胞内钙离子浓度降低，从而松弛血管平滑肌，扩张血管，降低肺嵌压，改善血流动力学，减少水钠潴留。
本研究证实了新活素对急性心力衰竭模型大鼠血清白介素６以及ＢＮＰ的测定也已经证实，使血清中二者浓度明显降低，起到了改善心功能的作用，对于各种不同原因引发的急性心力衰竭患者症状的改善，在此实验研究中，明确显示应用新活素后，心力衰竭症状改善，同时需要在临床工作中更进一步完善并继续观察新活素在治疗过程中可能出现的一些不良反应，以便更进一步优化并进一步探讨。本研究结果也显示可能与ｒｈＢＮＰ扩张血管，有研究表明对肝肾功能无影响，并能减轻肾脏后负荷及抑制ＲＡＡＳ系统的激活进而保护肾功能起到了重要作用；国内的多项研究［８－１０］也已经证实，ｒｈＢＮＰ能明显改善急性心力衰竭患者血流动力学及临床症状，这与新活素和体内ＢＮＰ具有完全相同的氨基酸排序，在体内有较好的生物效应相关，ＢＮＰ具有明显的扩张肾动脉功能，通过扩张肾系膜细胞和肾入球动脉及收缩肾出球动脉来改善ＧＦＲ。新活素在治疗心衰好转的同时，对肝脏功能具有一定的保护作用。
目前，ｒｈＢＮＰ已被列入ＡＣＣ／ＡＨＡ／ＥＳＣ对急性心力衰竭的治疗指南的新一代治疗药物［１１］，值得临床推广。
参考文献
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论文作者:王恒东１ 刘东璞２
论文发表刊物:《医师在线》2015年4月第7期供稿
论文发表时间:2015-6-25
标签：心力衰竭论文; 大鼠论文; 白介素论文; 心衰论文; 卡托普利论文; 模型论文; 血清论文; 《医师在线》2015年4月第7期供稿论文;