王辉[1]2003年在《水稻条纹病毒NS3基因的分子变异及其抗血清的制备》文中研究说明水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表种，广泛分布于我国，给我国的水稻生产造成了严重损失。为了进一步研究RSV的分子变异及其基因组编码NS3蛋白的功能，本文通过RT-PCR及单链构象多态性分析(SSCP)并结合序列测定对我国水稻条纹病毒21个分离物NS3基因的分子变异进行了研究。 21个分离物的RNA3编码的NS3基因片断经RT-PCR扩增后均得到一段长约630bp左右的片断。通过测序结果以及这些分离物与已报道的云南Y、日本T、M的相比结果表明，这24个分离物长度均为636nt。根据核苷酸序列和氨基酸序列同源性，这些分离物可划分为两个组，第一组包括云南除昆明(KM)以外的所有分离物，包括云南保山(BSH)、沙坝(SHB)、大理(DL)、宜良(YL)、江川(JCH)、玉溪(YX)等共11个分离物，这11个分离物的NS3基因的核苷酸序列的同源性为95.2％—98.7％，其编码的氨基酸序列的同源率在95.3％—99.1％之间。其它的13个分离物可划分为第二组，主要包括来自福建、浙江、江苏、上海、北京、辽宁、河南的9个分离物，分别是叁明(SM)、浙江(ZJ)、大丰(DF)、嘉定(JD)、北黑(BH)、大洼(DW)、开封(KF)、原阳(YY)、原阳2(YY2)，云南Y分离物和日本T、M分离物与第二组的关系较近，划入第二组，有趣的是云南的KM分离物也被划入这一组中去。这一组的核苷酸序列同源率在96.2％—99.4％之间，编码的氨基酸序列的同源率在93.9％—100％之间。而在两个组之间，NS3基因仅有92.6％—95.9％的同源率，编码的氨基酸的同源率在90.6％—97.2％之间。 对2个分离物经RT-PCR、克隆后的30个阳性克隆白斑进行SSCP分析，结果表明，只存在两种带型，93％的克隆的SSCP带型一致，而只有接近6％的克隆白斑的SSCP带型有异，这说明了每一个分离物都有一个主要的序列变异类型。通过21个分离物以及这两个分离物的SSCP分析结果初步表明了RSV病毒符合准种结构特征分布。 构建了含RSV NS3基因的融合蛋白原核表达载体，并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中得到表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)福建农林大学硕士学位论文测定融合蛋白的分子量为49kDa。认怂stem blot印迹结果显示，GST-Ns3与RSV抗血清有很强的免疫反应，表明GST-Ns3具有天然状态下病毒蛋白的抗原性。制备了GST-Ns3抗血清，并应用此抗血清建立了RSV间接EUSA检测技术，检测灵敏度为lmg鲜重的病株叶片。
参考文献：
[1]. 水稻条纹病毒NS3基因的分子变异及其抗血清的制备[D]. 王辉. 福建农林大学. 2003