宋福平[1]2003年在《苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究》文中认为cry1Ie1基因是我国鉴定分离并经国际命名的一种新型的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫晶体蛋白基因。该基因在Bt菌株中沉默，编码719个氨基酸组成的蛋白，对小菜蛾(Plutella xylostella)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)和大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)等害虫具有较高的杀虫活性。本研究通过PCR扩增的方法，以cry1Ie1全长基因为模板，分别得到不同末端缺失的基因片段，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达，得到6种末端缺失的蛋白。通过对小菜蛾和玉米螟生物测定确定Cry1Ie1蛋白对小菜蛾的最小活性区N端在45-104氨基酸位点之间，C端在633-648氨基酸位点之间。N端的45个氨基酸对于玉米螟的杀虫活性的是必需的，而C端活性区应在633-648氨基酸位点之间。最终明确1-648氨基酸对小菜蛾和玉米螟均与全长蛋白活性相当或略高。 在上述研究基础上，对编码Cry1Ie1蛋白1-648氨基酸的核酸序列进行的序列改造和密码子优化，使其能在植物中高效表达。经过优化人工合成的cry1Iem基因与原基因的同源性只有82.8％，而G+C含量也由原来cry1Ie1的37.04％提高为47.22％。原核表达的Cry1Iem蛋白与Cry1Ie1活性相当。 苏云金芽孢杆菌cry8类基因对叶甲科、金龟科等多种鞘翅目害虫均具有毒杀作用。，本研究建立了cry8类基因的鉴定体系，从我国分离的36株Bt菌株中鉴定出15株含有cry8类基因，主要分为两种类型，RFLP图谱分析表明以HBF-1为代表的3株含有cry8Ca基因，而以185菌株为代表的12株含有新型cry8基因，进一步克隆了185菌株该基因的部分序列，发现与已知cry8基因序列存在较大差异。 克隆了菌株HBF-1和H06菌株中cry8Ca基因，它们之间只存在1个氨基酸的差异，在Bt菌株无晶体突变株HD-73~-中获得高效表达，并对铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)幼虫蛴螬有较高的杀虫活性，在160μg／g土土壤浓度下，14天校正死亡率达68.3％。从Bt菌株185中克隆一种新型的cry8基因。该基因与已知cry8基因的同源性均低于78％，已在GenBank登录(AY329081)，并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry8Ea1基因。这是我国发现的第一个第二等级的Bt杀虫基因，杀虫活性的研究正在进行。
吴玉娥, 张杰, 曹景萍, 高继国, 黄大昉[2]2003年在《苏云金芽孢杆菌Cry1Ie1蛋白末端缺失的研究》文中研究表明通过PCR扩增法 ,以cry1Ie1全长基因为模板 ,分别得到不同末端缺失的基因片段 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)中诱导表达 ,得到 6种末端缺失蛋白。对小菜蛾生物测定结果表明 ,缺失蛋白IE6 5 9、IE6 5 6分别缺失了C末端 6 0个和 6 3个氨基酸残基 ,对小菜蛾的杀虫活性与Cry1Ie1全长蛋白相当 ;IE6 4 8、IE0 4 5分别缺失了C末端 71个氨基酸残基和N末端缺失 4 4个、C末端缺失 6 3个氨基酸残基 ,对小菜蛾的活性提高了 5 0 % ;IE6 33、IE10 5分别缺失了C末端 86个氨基酸残基和N末端缺失 10 4个、C末端 6 3个氨基酸残基 ,丧失了对小菜蛾的活性。试验明确Cry1Ie1蛋白的最小活性区N端在 4 5～ 10 4氨基酸位点之间 ,C端在 6 33～ 6 4 8氨基酸位点之间。
吴玉娥[3]2003年在《苏云金芽孢杆菌Cry1Ie1末端缺失蛋白的研究》文中研究说明鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)是农业上的重要害虫，近年来小菜蛾在田间对化学农药的抗药性上升较快，而玉米螟属钻蛀型害虫，使用传统的方法已难以达到良好的防治效果。crylIel基因是一类新型苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白沉默基因，对小菜蛾、玉米螟显示了较高的杀虫活性。本试验进行了CrylIe蛋白末端缺失的研究，发现其最小活性区，为研究其杀虫作用机理奠定基础，同时为转基因植物和杀虫工程菌的构建提供理论依据。 根据crylIel基因的全长序列，设计了7对引物P001／P656、P001／P659、P001／P648、P001／P634、P045／P656、P105／P656、P045／P648，用于PCR扩增末端缺失的基因片段，以crylIel基因全长基因为模板，分别得到1968bp、1977bp、1944bp、1902bp、1833bp、1653bp、1812bp片段，插入载体pET-21b中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达获得7种缺失蛋白：IE656(C末端缺失63个氨基酸)、IE659(C末端缺失60个氨基酸)、IE648(C末端缺失71个氨基酸)、IE634(C末端缺失85个氨基酸)、IE045(N端缺失44个和C端缺失63个氨基酸)、IE105(N端缺失104个和C端缺失63个氨基酸)、IE045-648(N端缺失44个和C端缺失71个氨基酸)。 完成了上述7种蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟生物活性测定，结果表明IE656、IE659对亚洲玉米螟的活性与CrylIel全长蛋白相近。IE648对亚洲玉米螟活性与CrylIel全长蛋白相比提高了60％左右。IE045对亚洲玉米螟的活性与全长CrylIe蛋白相比有所降低，活性是其6.25％。IE105、IE634对玉米螟无活性。可以确定CrylIe蛋白对亚洲玉米螟活性区C末端在第634到648位氨基酸之间，N端的44个氨基酸对玉米螟的活性是必需的。 IE656、IE659对小菜蛾的活性与CrylIel全长蛋白相比稍有降低。IE648对小菜蛾的活性与CrylIel全长蛋白相比提高了30％左右。IE045对小菜蛾的活性与全长CrylIel蛋白相比提高约30％。IE105、IE634对小菜蛾无活性。可以确定CrylIe蛋白对小菜蛾活性区N末端在第45位氨基酸到104位之间，C末端在第634到648位氨基酸之间。两端缺失的IE045-648对小菜蛾的活性是CrylIe全长蛋白的10％。
宋萍[4]2012年在《苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌(Bt)是世界上研究最多应用范围最广的杀虫微生物,杀虫活性物质包括Cry和Cyt两大类蛋白,在害虫生物防治中发挥了重要作用,但是也暴露了一些弊端,如杀虫谱窄、昆虫易产生抗性等问题,所以进一步分离特异活性或者高活性的野生菌株,鉴定其基因型,为害虫防治提供更多的基因资源。本论文针对含有cry7类基因的苏云金芽胞杆菌野生菌株进行了鉴定和评价,从中筛选出了对马铃薯二十八星瓢虫特异活性的新菌株,针对这一新菌株生物学特性、蛋白型、基因型以及作用机理等方面进行了一系列的研究,主要内容和结果如下。1.利用醋酸钠筛选法并经基因型分析,从河北省土壤中分离筛选出了56株含有cry7基因的Bt菌株。在这些菌株中,10株菌同时含有cry7基因和其他cry基因,46株菌只含有单一cry7基因。大部分Bt菌株表达130kDa蛋白,仅有BQZ-12菌株产生80kDa和70kDa蛋白,BQZ-8菌株产生130kDa和80kDa蛋白。通过生物活性测定得到一株对马铃薯二十八星瓢虫幼虫具有特异杀虫活性野生菌Bt WZ-9。2. WZ-9菌株在胞晶分离期产生菱形伴胞晶体,蛋白分子量为130kDa,对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫的LC50值为0.209 mg/mL。基因型鉴定结果表明该菌只含有单一的cry7基因,序列分析显示该基因与cry7Ab1同源性达到99%,被Bt命名委员会命名为cry7Ab3(登录号ABX 24522)。3.为了明确Cry7Ab3蛋白的杀虫活性,从Bt WZ-9菌株中克隆了cry7Ab3基因,该基因在大肠杆菌BL21和Bt无晶体突变株HD73 cry-中都能正确表达130kDa蛋白,其表达产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫都具有较高毒力,LC50值分别为0.460 mg/mL和0.205 mg/mL,cry7Ab3基因在转Bt无晶体突变株HD73-Cry7Ab3中形成的晶体(0.86μm×1.23μm)比野生菌产生的晶体(0.73μm×1.00μm)略大一些。这些结果证实了cry7Ab3基因编码蛋白发挥杀虫作用。4.为明确Cry7Ab3蛋白最短活性区序列,利用特异性引物分别克隆表达不同长度的cry7Ab3基因片段,E. coli Cry7Ab3-1(Met1-Phe657)、E. coli Cry7Ab3-2( Met1-Phe626 )、E. coli Cry7Ab3-3 ( Asn30-Phe657 )和E. coli Cry7Ab3-4(Lys87-Phe657),并测定了表达产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫的毒力。结果表明E. coli Cry7Ab3-1表达的75kDa蛋白毒力最高,LC50值为0.114mg/mL,可以确定Met1-Phe657为Cry7Ab3蛋白的最短活性区。5.分别利用胰蛋白酶和马铃薯二十八星瓢虫中肠蛋白酶液体外酶解130kDa的Cry7Ab3原毒素(质量比为100:1),均得到75kDa的酶解产物。与相同浓度的原毒素相比,75kDa的酶解产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫具有较高杀虫毒力。对马铃薯二十八星瓢虫幼虫中肠组织病理学研究表明,3龄幼虫取食Cry7Ab3原毒素蛋白3d后,中肠细胞严重破坏,细胞间出现明显孔洞,幼虫表现出活动缓慢,取食量下降的现象。取食5d后,中肠组织完全被破坏,幼虫开始死亡。通过Ligand blotting技术,检测到马铃薯二十八星瓢虫中肠BBMV上存在分子量为220kDa的Cry7Ab3毒素结合受体,经质谱分析鉴定该受体蛋白为钙粘蛋白。本论文创新之处在于发现了对马铃薯二十八星瓢虫幼虫特异活性的Cry7Ab3蛋白,构建了转cry7Ab3基因的Bt工程菌,明确了Cry7Ab3蛋白最短活性区为75kDa的Met1-Phe657蛋白片段以及Cry7Ab3毒素的作用靶标是马铃薯二十八星瓢虫幼虫中肠组织上的BBMV,初步确定了其在中肠BBMV上结合蛋白可能是钙粘蛋白。这些研究结果为更好地应用Cry7Ab3蛋白防治马铃薯二十八星瓢虫提供了理论基础。
谢雅晶, 冯纪年, 张存政, 王耘, 赵龙龙[5]2011年在《苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白cry2Ad2原核表达及其不同长度片段产物的杀虫活性》文中研究指明该研究采用NCBI蛋白分析软件对Cry2Ad2蛋白序列进行分析,采用PCR克隆获得3种不同长度的cry2Ad2及全长cry2Ad2基因片段,并将这些基因片段克隆到pET-26b载体上,构建重组质粒pET-Ad、pET-Ad1、pET-Ad2和pET-Ad3,再导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行细胞周质诱导表达,并采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾的毒力。Cry2Ad2蛋白的序列分析结果表明:全长的Cry2Ad2蛋白包含两个保守区域domain I(第53位～第264位氨基酸)和domainⅡ(第267位～第472位氨基酸),推测保守活性片段C端末端在N-端的第472位与第633位氨基酸之间。重组质粒pET-Ad、pET-Ad1、pET-Ad2和pET-Ad3在大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳验证分别含有约70 000、52 000、51 000和54 000的表达蛋白。生物活性初步测定结果表明:表达的Cry2Ad2、Cry2Ad2-1、Cry2Ad2-2及Cry2Ad2-3给药72 h后对小菜蛾都具有杀虫活性,其中蛋白Cry2Ad2、Cry2Ad2-2与Cry2Ad2-3对小菜蛾有较强的毒性,相同剂量致死率分别为64.35%、53.27%和61.66%,统计分析表明蛋白Cry2Ad2-1与Cry2Ad2-3的致死率与蛋白Cry2Ad2的致死率无显着差异,(P>0.05);蛋白Cry2Ad2-2对小菜蛾的毒力相对较低,相同剂量致死率为39.89%,蛋白Cry2Ad2-2的致死率与蛋白Cry2Ad2的致死率差异显着(P<0.05)。鉴此,初步推断Cry2Ad2蛋白对小菜蛾的活性区在第49位与第463位氨基酸之间。
束长龙[6]2013年在《苏云金芽胞杆菌资源多样性分析与杀虫基因发掘》文中研究指明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt），革兰氏阳性细菌，在芽胞形成期可产生具有杀虫活性的伴胞晶体。Bt晶体主要由cry基因编码的杀虫晶体蛋白组成，在害虫的防治中具有重要作用，有巨大的商业价值，因此发掘新基因并进行知识产权保护是Bt资源研究的重要内容。知识产权作为综合竞争力的重要体现，而目前我国在Bt杀虫基因资源的知识产权方面处于劣势，大部分Bt杀虫基因的专利权掌握在西方各大型农业生物技术企业手中，我国掌握的Bt新的基因发明专利不足60项。高通量测序技术的发展为发掘杀虫基因提供了新思路，成为国内外发掘Bt杀虫基因的主要手段。但是测序价格较高，Bt资源库中存在的冗余菌株会造成较大的资金浪费，目前尚没有便捷的方法去除重复菌株。因此，迫切需要建立可以快速分析比较大量样品的方法，来排除重复菌株，进一步提高杀虫基因发掘效率。本论文在分离1500株Bt菌株的基础上，进一步建立了菌株多样性分析方法，对菌株多样性进行研究，去除冗余菌株，对其中90株菌株进行了杀虫基因测序筛选，主要结果如下：Bt菌株分离与鉴定：杀虫活性评估结果显示多数菌株对鳞翅目害虫有较高活性，1500株测试菌株中，对棉铃虫有活性的菌株有1346株，对玉米螟有活性菌株有813株，而对叶甲类害虫大猿叶甲有活性的菌株较少，只有42株；镜检结果显示不同菌株产生的晶体形状、大小、种类有较大差异，晶体种类主要为菱形，部分为球形和不规则的晶体形状；杀虫晶体蛋白图谱显示大部分菌株表达了130kD蛋白，部分菌株还表达了100Kd、60kD蛋白，具有典型Bt杀虫晶体蛋白的特征；质粒图谱显示不同菌株质粒图谱条带数量和大小都有所不同，并且有部分菌株图谱相似，说明资源库中有冗余菌株。建立Bt菌株多样性分析方法：首先，设计了可以扩增多个基因家族的兼并引物，fastPCR软件分析结果显示该引物可以对超过30种的杀虫基因家族进行较好的扩增，PCR实验检测显示，该引物可以扩增出预期条带但是条带较弱。进一步通过增加侧翼特异序列的办法对兼并引物进行改良，改良后的引物显着提高了扩增效率。同时，还对引物浓度与退火温度进行了优化，利用72个不同血清型的标准菌对优化后的PCR体系进行了评估，结果显示95%以上的菌株都可以获得预期条带；利用含有多个基因的HD12菌株评估了优化后体系对多个基因同时扩增的能力，结果显示优化后的PCR可以从HD12获得9种不同的RFLP类型。这些结果说明优化后的PCR体系具备了cry基因指纹图谱的基本要求。此外，本论文还对Bt基因组提取方法进行了改良，改良后的方法可以提取并获得质量均一的基因组DNA。用改良的PCR体系对Bt基因组进行扩增，并用HinfI对PCR产物进行消化，利用LabChip GX电泳系统进行分析，获得了888个菌株的RFLP图谱。进一步对电泳图谱进行数字化、计算相似性、构建系统发生树分析。结果显示，该方法可以有效分析菌株多样性，去除冗余菌株，获得可用于进一步基因发掘的菌株。90株Bt菌株杀虫基因测序筛选：利用高通量测序技术分析了90株不同的Bt菌株的序列，进一步通过SOAPdenovo软件拼接、GeneMark基因预测、模式杀虫基因数据库及专利数据库blast比对，最终获得全新杀虫基因21个。总之，本论文建立菌株多样性研究方法，解决了冗余菌株会造成资金的浪费的问题，最终完成了“菌株分离去除冗余基因测序筛选”这一杀虫基因高通量发掘平台的构建，为提升我国在Bt资源发掘中的竞争力提供了重要保障。
参考文献：
[1]. 苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究[D]. 宋福平. 中国农业科学院. 2003
[2]. 苏云金芽孢杆菌Cry1Ie1蛋白末端缺失的研究[J]. 吴玉娥, 张杰, 曹景萍, 高继国, 黄大昉. 植物保护. 2003
[3]. 苏云金芽孢杆菌Cry1Ie1末端缺失蛋白的研究[D]. 吴玉娥. 东北农业大学. 2003
[4]. 苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究[D]. 宋萍. 河北农业大学. 2012
[5]. 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白cry2Ad2原核表达及其不同长度片段产物的杀虫活性[J]. 谢雅晶, 冯纪年, 张存政, 王耘, 赵龙龙. 江苏农业学报. 2011
[6]. 苏云金芽胞杆菌资源多样性分析与杀虫基因发掘[D]. 束长龙. 东北农业大学. 2013