林秀坤[1]1996年在《新抗癌抗生素C1027肽的基因工程修饰研究》文中研究指明大分子多肽类抗肿瘤抗生素是当前医学、化学及分子生物学领域的研究热点。C1027是由链霉菌Streptomyces globisporus C1027产生的一种新的大分子多肽类抗肿瘤抗生素，C1027分子由一个蛋白与一个发色团两部分构成，蛋白部分含110个氨基酸，分子量为10500 Da；发色团含典型的烯二炔结构，分子量850Da。C1027可引起DNA的单链断裂及双链断裂，对肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，是迄今已报道的抗肿瘤活性最强的多肽类抗生素。但C1027属于大分子蛋白类，应用于人体可能存在免疫反应，降低C1027的分子量将具有重要的临床价值；C1027是肿瘤导向治疗的理想“弹头”药物，C1027与单抗Fab段偶联，偶联物对肿瘤细胞具有特异性的杀伤作用，进一步降低C1027的分子量，对获得更为有效的小型化“弹头”药物具有十分重要的意义。 本研究用基因工程方法制备截去C-末端16个氨基酸的C1027蛋白，克隆了编码C1027蛋白部分N-末端94个氨基酸的基因片段，Apo-C1027(94)基因；在变铅青链霉菌S．lividans TK54中表达，对表达蛋白进行分离纯化，与C1027发色团组装，获得重建分子C1027(94)，并测定了重建分子的抗肿瘤作用。 以C1027产生菌总DNA为模板，采用PCR技术扩增，获得编码Apo-C1027缺失C-末端16个氨基酸的区段及上游区信号肽序列，Apo-C1027(94)基因。采用TA克隆技术将Apo-C1027(94)基因插入到大肠杆菌质粒pUC18，构建成克隆载体pUC1027，核苷酸序列分析表明，插入片段与已知序列完全一致。把Apo-C1027(94)基因克隆至链霉菌高效表达载体pIJ459红霉素抗性基因启动子下游、构建成表达质粒pIJ1027。以酶联免疫吸附法(ELISA)测定了工程菌菌体内及培养液中Apo-C1027(94)的表达量，发现Apo-C1027(94)主要分泌于培养液，84小时分泌量最高、最高表达量为1.6 mg／L。工程菌经84小时培养、离心收集培养液，经硫酸铵盐析，羟基磷灰石吸附，Sephadex G-50凝胶过滤及DEAE-纤维素离子交换层析等步骤，获得较高纯度的Apo-C1027(94)蛋白。SDS-PAGE分析呈单一区带，分子量9 kDa左右，与理论值相近。ELISA及Western blot分析表明，所纯化的蛋白与抗C1027单克隆抗体F9有明显的免疫反应。表明所纯化的蛋白为Apo-C1027 N-末端94个氨基酸的片段，即Apo-C1027(94)。 我们研究了Apo-C1027(94)与C1027发色团的组装特性。Apo-C1027(94)
李顺强[2]1999年在《重组融合蛋白及联合基因转染阻断肿瘤侵袭与转移的研究》文中研究指明在肿瘤的侵袭与转移中，穿透基底膜和新血管生成是两个关键环节，基底膜是肿瘤细胞必需突破的屏障。Ⅳ型胶原酶降解Ⅳ型胶原，破坏基底膜完整性，促进肿瘤转移。新生血管为肿瘤细胞提供营养和转移通道，分泌大量Ⅳ型胶原酶的增殖型血管内皮细胞是血管生成的关键因素，抑制Ⅳ型胶原酶即可抑制血管生成，因此，Ⅳ胶原酶抑制剂在抗肿瘤药物研究中有重要意义。单抗导向药物对肿瘤细胞有选择性杀伤作用，但完整的单抗载体分子量大，难以进入实体瘤深部，因而限制了其应用。基因工程单链抗体在一定程度上克服了这一缺点。在国家自然科学基金资助下，我室研制了一株特异性抗Ⅳ型胶原酶单抗3D6，实验证明该单抗能抑制Ⅳ型胶原酶活性，其单链抗体scFv-M97基本保留了原亲本抗体的特点，为进一步制备以Ⅳ型胶原酶为靶点的导向药物奠定了基础。高效“弹头”药物是导向治疗实用化的重要条件，新抗癌抗生素C1027是高效“弹头”的最佳候选药物之一。C1027对体外培养的癌细胞有极强的杀伤作用，并能以bFGF受体为靶点，抑制血管生成。其分子由发色团和肽链两部分组成，发色团是活性成份，肽链对发色团起保护作用，两者以非共价键结合，可拆分与重建。重建后的C1027分子同样具有天然C1027的高度活性。上述特点为通过基因工程技术研制新型高效导向药物提供了重要依据。本研究以Ⅳ型胶原酶为靶点，制备兼具强烈杀伤肿瘤细胞活性和阻断侵袭转移作用的新型小型化导向药物。 运用基因工程技术，构建了特异性单链抗体—C1027肽融合基因，两者由Linker(Gly4Ser)及NcoI酶切位点相连，既可减少两个蛋白质分子间相互影响，又便于亚克隆。DNA序列分析证实融合基因长1083bp，编码361个氨基酸，开放读码框正确。融合蛋白在大肠杆菌中获得较好表达，分子量约37kDa。凝胶薄层扫描显示外源蛋白约占总蛋白的8％，融合蛋白以可溶状态分布于细菌的周间质中，通过亲和层析，获得了较高纯度的
参考文献：
[1]. 新抗癌抗生素C1027肽的基因工程修饰研究[D]. 林秀坤. 中国协和医科大学. 1996
[2]. 重组融合蛋白及联合基因转染阻断肿瘤侵袭与转移的研究[D]. 李顺强. 中国协和医科大学. 1999