·综 述·
微生物膜应用于水中尸体PMI推断的前景展望
韩晗，刘卓鹰，郭娟娟，符晓亮，何静，郭亚东，蔡继峰
（中南大学基础医学院法医系，湖南 长沙 410013）
摘 要： 在法医病理学中，死亡时间推断一直是难点问题，而水中尸体的PMI推断至今仍缺乏有效方法。微生物膜是微生物在生长过程中附着于非生物或生物表面，由自身产生的胞外聚合物及其基质网包裹的具有三维结构的微生物群体。微生物群体在其发生发展过程中存在一系列的群落演替现象，这种附着在水中尸体表面的生物膜蕴含的微生物群落及其演替过程很可能成为推断水中尸体死亡时间的新依据。本文详细阐述了微生物膜的概念、分类、研究手段以及影响因素，并分析了其在水中尸体死亡时间推断中的应用前景，为该领域的研究提供新的思路。
关键词： 法医病理学；生物膜；死亡时间；溺死；综述
死亡时间（postmortem interval，PMI）是指受害者死亡至尸体被发现所经历的时间间隔[1]。在法医学中，PMI对于死亡事件的重建十分重要[2-3]。尸体的分解是一个依赖于非生物因素（温度、湿度）、生物因素（昆虫、微生物、脊椎动物的清除活动）以及个体内在特性的动态过程[4]。有研究结果[5]表明，生物因素在尸体腐败过程中起着极其重要的作用，并存在一定的时序性变化规律。在陆地上尸体分解过程中，WOLFF等[6]观察其变化并将腐败划分为新鲜期、肿胀期、腐败期、腐败进展期以及干化期5个阶段。而在水中，尸体分解过程与陆地差异较大，可分为沉没新鲜期、漂浮早期、漂浮腐败早期、漂浮腐败进展期以及沉没遗骸期5个阶段[7]。根据尸体是否漂浮于水面，将PMI分为尸体漂浮时间（postmortem floating interval，PMFI）和尸体水下时间（postmortem submersion interval，PMSI）。PMSI是指尸体进入水中（完全或部分沉没在水中）直到被发现的时间[8]。在实际案例中，水中尸体通常上浮后才被发现，经过长时间的浸泡，尸体高度腐败，并且因水体环境对尸体的影响，早期尸体现象不明显，使PMI的推断变得更加困难。水中尸体的腐败是个极为复杂的过程，是多种腐生菌与藻类相互作用的结果[9-11]。
其次，跨学科思维也是互联网时代教师需要具备的能力，主要是指以政府采购管理专业为基础，多角度，多专业领域来审视并解决问题，这是互联网思维的重要体现，传统学科分类会对跨学科思维带来很大的影响，很多教师只是具备自身专业领域的知识，政府采购管理专业，学生需要具备多个领域的专业知识，如政治、经济、金融、社会、工程学等学科的知识，因此，教师也要从提升学生的综合能力角度出发，加强自身多专业领域知识的掌握和了解，才能更好地引导学生。
1978年，COSTERTON提出了微生物膜（microbial biofilm）这一概念[12-13]。微生物膜是指微生物在生长过程中附着于非生物或生物表面，由自身产生的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）（主要为胞外多糖、蛋白和胞外DNA）及其基质网包裹的具有三维结构的微生物群体[14-15]。微生物膜在自然界中普遍存在，自然水体中生物膜根据微生物膜附着的基底类型可分为石生生物膜、植物生物膜以及腐生生物膜[16]。附着在尸体表面的微生物膜属于腐生生物膜，其中包含的微生物主要为异养微生物[16]，以尸体组织为营养。随着时间的推移，这类微生物将不断消耗营养基质，而营养基质的减少又使群落中的微生物组成发生改变[17]，即群落演替过程。因此，微生物膜的群落演替与水中尸体PMI密切相关[18]。近年来，通过微生物膜推断PMI的研究日益增多，展现出良好的应用前景。本文对目前研究进行总结，归纳微生物膜在水中尸体PMI推断中的应用及其影响因素，并分析其应用的可行性、局限性等问题。
1 微生物膜概述
1.1 微生物膜
1674年，Antonie van Leeuwenhoek通过显微镜从牙菌斑中观察到微生物，由此打开了微生物研究的大门[19]。此后，科学家对微生物进行了大量研究，研究方法主要针对单一菌种，因此人们对于细菌的认识也就仅限于单个菌种的特点。但是，微生物在自然界中无处不在，且98%的细菌均以群体的方式存在[14]。1972年，BAYSTON和PENNY观察到在霍尔特分流导管表面有多层细菌分布并形成膜状复合物。自1978年，COSTERTON在由呼吸机导管污染的细菌引发肺炎的研究中提出微生物膜的概念以来[12-13]，这一概念逐渐在国际各个领域得到认可。目前，微生物膜不仅应用于医学，在环境保护、食品、畜牧业等领域均有相关研究，并在某些领域发挥着至关重要的作用[10]。在法医学领域，BENBOW等[20]运用水中尸体表面微生物膜进行PMI推断的研究。
微生物膜的形成主要经历黏附期、发展期和成熟期3个阶段[21]。微生物通过自身的鞭毛、纤毛等依附在固体基质上，随后通过自身产生少量的EPS，更紧密地与基质结合，随着黏附微生物的增加，EPS也随之增加，并逐渐形成一层水凝胶状物覆盖在微生物表面[22]，成为成熟稳定的三维结构[23]。在自然环境的作用下，有部分细胞从微生物膜中游离出来，吸附新的固体基质，并发生群落演替。
1.2 自然水体中微生物膜的分类
微生物膜的构成主要是固体基质、微生物以及胞外聚合物。在自然水体环境中（如江河、湖泊、池塘、溪流、沼泽、海洋等），根据其基质的不同，可以将其主要分为石生生物膜（epilithic）、植物生物膜（epixylic）[24]以及腐生生物膜（epinecrotic）[16]。石生生物膜主要附着在水体环境中的岩石等非有机物上，以自养的藻类为主，受光照条件影响较大。杨帆[25]对长春南湖中的微生物膜进行培养及研究，发现这类石生生物膜上藻类为优势种群，初期主要以硅藻为主，随后绿藻成为优势种群。另外，不同季节的微生物膜也有差异，夏季微生物种类会更为丰富，生物量更大。附着于植物表面的微生物膜称为植物生物膜，主要存在于水体环境中的落叶、树干或其他植物腐殖质上，有研究[26]显示，其微生物群落以细菌为主。HEMPEL等[27]对淡水和海水中不同植物以及同一植物不同部位上的微生物膜进行研究，发现不同流域以及同一植物不同部位上微生物膜有显著差异，而不同植物品种之间无显著差异。另外，植物生物膜的主要组成部分是α变形杆菌和海洋浮游细菌。与石生生物膜不一样的是，植物与微生物之间存在相互作用。植物中的有机成分可影响各种微生物的定植，反之，微生物膜中的微生物也会产生一些有利于植物生长或不利于其生长的化合物[28]。腐生生物膜是指附着在腐败生物上的微生物群落，在先前鲑鱼[29]、水禽[30]、老鼠[31]以及猪[16]尸体的研究中均有发现。腐生生物膜中的微生物与植物生物膜类似，异养型微生物在群落中起着重要的作用。
BENBOW等[20]通过高通量宏基因组测序技术对不同季节（夏季和冬季）水中尸体表面的微生物膜进行研究，结果表明，在尸体的腐败过程中，微生物膜中微生物相对丰度有显著变化，并且不同季节微生物组成也有差异。多项研究结果[16，20，43]显示，夏季和冬季的水中尸体上，变形菌门和厚壁菌门均为微生物膜中主要的菌门，且变形菌门相对丰度随时间推移不断下降，而厚壁菌门相对丰度不断上升，说明细菌相对丰度与PMI存在相关性，可通过检测某一种类微生物的相对丰度在演替过程中的动态变化来推断相应的PMI，但这种相关性仍需进一步探究。
1.3 微生物膜的研究技术
寄生于尸体上的微生物多属于异养生物，主要以尸体组织为营养，随着营养物质的减少，群落中的微生物种类也会发生相应的变化。死后尸体表面的微生物膜群落是存在演替规律的，因此，微生物膜可为PMI推断提供依据[22]。目前，有学者通过高通量宏基因组测序技术对陆地环境中的人、猪、小鼠等尸体群落演替过程进行研究，观察不同时间段出现在尸体上的群落，用以推断晚期 PMI[2，23]。
另外，在具体的细菌种属水平，DICKSON等[43]通过对海水中猪尸体头部的研究，发现在某个特定时间点会出现某种细菌。如秋天肉食杆菌属仅在第七天取样时被检测到，这说明微生物种类演替规律存在推断PMI的潜在价值。
将微生物膜应用于法医学中的优势主要在于：（1）微生物膜中微生物以尸体为营养物质，其种类和丰度会随尸体的理化性质改变而改变，与PMI有着密切联系。（2）微生物普遍存在于环境中，用微生物膜进行推断PMI易于操作，取材简便。（3）将微生物膜的微生物群落作为PMI的推断工具比研究单一的微生物更为科学。某种微生物的出现或消失并非只受尸体变化的影响，同时受到其他微生物的作用。若根据单一的微生物来推断PMI，误差较大，而微生物膜是研究一个微生物群体在尸体上的改变，即演替规律。演替在生态学中是指群落或者生态系统沿着一定的方向发生有规律、可预测的变化。并且群落演替是一个连续发生的稳健过程[16]，这使得PMI的推断更为准确。（4）微生物膜是一种有胞外聚合物包裹的三维结构的微生物群体，这层胞外聚合物稳定存在，能够有效阻挡环境变化带来的影响。这一特点能够保障在推断PMI时，尽量将其他因素的影响降到最低。
但是，微生物在陆地尸体上的群落演替过程会受到一些因素的影响而具有不确定性，如嗜尸性昆虫的出入影响尸体微生物的分布[3，42]。在水生环境中，微生物主要在微生物膜中富集，而漂浮于水中的密度较低[16]。因此，微生物膜的微生物群落演替及相对丰度变化是一种潜在的推断水中尸体PMI的方法[16]。
2 微生物膜的法医学应用前景
2.1 微生物膜在水中尸体的研究
微生物群落结构和多样性研究技术多种多样，包括传统培养分离法、群落水平生理学指纹法（community level physiological profiles，CLPP）、生物标记法以及现代分子生物学技术[32]。传统培养分离法主要是将样品置于培养基中培养，对其菌落进行计数并在显微镜下观察形态，根据其理化性质进行分类，但这类方法不能用于观察群落结构的动态变化。1991年，Garland和Mills提出一种酶分析方法即CLPP[33]。CLPP是一种基于微生物对不同碳源的利用能力来反映种群组成的方法，该方法检测简便且快速，因此得以广泛应用。Biology-Ecoplate是一种96孔微平板，31孔内含有培养基、氧化还原染料以及不同碳源，第32个孔为无碳源的对照孔，重复3次[34]，通过观察微生物与氧化还原染料的反应，对其进行检测及分析。然而，该技术所检测的对象有其局限性，仅适用于快速生长的微生物。另外，平板中加入的氧化还原染料四氮唑具有一定的生物毒性，可能影响检测结果。生物标记法是指对微生物中的生物标记物进行提取、纯化以及测定，来评估微生物群落结构。目前常用的有醌指纹法（quinones profiling）和脂肪酸谱图法，后者包括磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）和脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester，FAME）。
根据调查区前人1∶50 000矿产地质、化探、物探综合调查项目成果资料[2]、1∶25 000水系沉积物测量成果及初步查证成果的基础上，在避开已有主要矿权的基础上在调查区从北到南初步划分3处找矿靶区，拉窝西找矿靶区、哈日扎北找矿靶区及希望沟找矿靶区。
有意思的是我们还看到含有汉文化因素的碑，如老子雕像，汉人形象的老人雕像，在市中心广场还建有明显包含汉文化因素的长廊、牌楼，……
(2)随着钢管壁厚的增大，钢管混凝土短柱承载力逐渐增大。曲线刚开始斜率较大，在挠度为0.25 mm内，重合度高，承载力提高速度快。
现代分子生物技术，如聚合酶链反应变性凝胶梯度电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）等是现阶段能够较为精确分析微生物种群分布的技术[35]。目前，现代分子生物技术均是基于对16S RNA的检测分析。16S RNA是原核生物核糖体小亚基上的RNA，片段长度约1500bp。该RNA基因几乎存在于所有的细菌中，除了具有高度保守性之外，还存在可变区提供潜在的位点分析区域。DGGE可区分长度相同但序列不同的DNA片段，其原理是将扩增后等长DNA片段在含有DNA变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，序列不同的DNA在不同的变性浓度中解链变性、改变结构，从而影响其电泳的速度，在凝胶的不同位置停止[36]。该方法的优势在于重复性好，可同时检测大量样品，但DGGE受DNA提取效果影响较大，还受PCR扩增偏差的影响[37]。RFLP技术分为以rDNA为扩增对象的核糖体DNA扩增片段限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）以及用荧光标记引物的末端限制性片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）。该技术是利用某种限制性内切酶识别DNA片段上的特殊序列并进行切割，使DNA链被分割成长度不同的片段，经电泳后不同长度的片段停在不同的位置[32]，再将所得的结果与已知微生物DNA序列文库进行比对，确定种属。RFLP是一种自动化且高通量的测序技术，能够比较微生物群落结构间的差异。但其与DGGE类似，同样受DNA提取效果影响，也受PCR扩增偏差的影响[37]。而微生物膜中除了菌类之外，还包含各种藻类。对于藻类多样性及群落结构分布的研究技术主要是高通量测序，通过识别内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、18S rRNA、28S rRNA、叶绿体rbcL和线粒体cob等进行物种鉴定[11，38-40]。高通量测序是指同时对几百万到十亿条DNA分子进行测序，又称为下一代测序技术[41]。该技术可以在数百万个点上同时检测，因此该技术具有测序速度快、通量高的优点。但是，高通量测序技术的局限性是不容忽视的，其局限性在于后续数据分析工作量很大。另外，费用较高也限制了其广泛应用。
2.2 微生物膜应用于法医学中的优势
2014年，医院党委提出了建设无纸化医院的构想，责成有关科室对无纸化项目进行了可行性论证工作，通过研究国家法律法规、相关政策要求，确立了法律依据。对实施厂家及实施医院进行多次参观考察，确立了技术可行性。
3 微生物膜应用于法医学的影响因素
3.1 温度
尸体周围的各种环境因素都能影响尸体内、外细菌群落多样性，从而影响尸体腐解的整个过程[4]。在陆地尸体中，环境温度对尸体的腐解过程影响最大。多项研究均在夏季或者冬季进行，结果显示，在相同的PMI细菌的相对丰度会有所差异。在温度高的环境中，尸体分解速度更快。BENBOW等[20]研究发现在夏季尸体完全分解需要21d左右，但在冬季需要42d左右。因此，高温环境中尸体进入腐败阶段比低温环境中更快，微生物膜中微生物群落演替会在死后发生较早。在实际PMI推断中，需考虑环境温度因素，根据相应的模型进行推断。
3.2 水体理化因素
不同水体的理化性质会影响水中尸体微生物种类[44]。水质的参考因素主要包括溶氧度、pH值、电导率、水温、总固体溶解度、氧化还原电位和盐度等。LANG等[16]利用核糖体间隔基因分析技术对两个不同水域的家猪尸体微生物膜进行研究，发现其演替受水体环境的影响。当不同水域的理化因素明显不同时，附着在尸体表面的微生物膜的组成也会有所差异。由此可见，水体的理化性质在微生物膜形成过程中发挥着自然选择的作用，根据适者生存的原则，微生物的种类有着明显差异。如海水中的含盐量比较高，存在于陆地动物体表的微生物在高盐高渗透压的环境中会迅速死亡[8]。在很短的时间内，微生物膜的组成就会由陆地微生物为主转变为海水中的耐盐微生物为主，这使海水中尸体微生物膜的演替与淡水存在极大的差别。
3.3 昆虫
在影响微生物的分布的因素中，嗜尸性昆虫也起着至关重要的作用。陆地环境中，随着腐败不断发展，尸体被微生物不断分解，腐败尸体释放出挥发性化合物（volatile compound，VOC），吸引各种昆虫或者节肢动物在尸体取食、产卵并繁殖[45]。然而，在尸体上这些昆虫幼虫的生长发育可通过直接或间接的竞争破坏已建立的微生物群落[46]。如丝光绿蝇在消耗尸体组织的同时会产生某种分泌物，影响微生物种类的演替，这种改变在丽蝇的清创治疗案例中得到证明[47-48]。昆虫在到达尸体前自身携带多种微生物，如家蝇携带有100多种致病菌[49-50]，这些微生物可成为尸体上的外源性微生物群落，并影响尸体上本来的微生物群落分布。水体环境中，水生昆虫虽不能直接取食尸体，但仍可以尸体为基质或栖息场所。尸体漂浮时，嗜尸性蝇类也有可能在暴露于水面上的尸体部位产卵、繁殖等[51]。因此，陆地环境中昆虫对微生物的影响同样适用于水中环境。
3.4 藻-菌共生演替
在水中环境，藻类与菌类的关系表现为复杂的共生、协同、竞争关系。菌类通过分解水体环境中的物质产生某些物质，抑制或者促进藻类的生长，同时，藻类也会通过光合作用释放有机质提供给异养菌群，这种循环体系称为“藻-菌”共生演替现象[52]。根据菌类产生的物质对藻类的作用，可将其分为促生菌和抑生菌。不论是促生菌还是抑生菌都会改变同一环境下的藻类行为，MITSUTANI等[53]的研究结果发现，假单胞菌能够分泌一种活性酶抑制藻类的生长。另外，有研究[54]证实，与藻类相关的菌类均为特定的菌群。因此，当菌群种类发生改变时，藻类也会通过营养依赖或者信号转导等作用[54]随之发生变化，反之亦然。在水中尸体微生物膜中，同样存在这种藻-菌共生演替现象。在微生物膜的研究中，不能仅限于菌群的演替，还需要对藻菌共生演替进行研究。
3.5 其他
除上述因素外，取材部位也是一个不容忽视的影响因素。有研究[43]分析猪尸体头部细菌群落演替发现，虽然大多微生物种类普遍存在于各种组织，但在脸颊（普通皮肤）、口鼻处（温暖湿润的隐蔽部位皮肤）和伤口处（大量肌肉组织和脂肪组织暴露的地方）获取的部分微生物的种类会有所差异。因此，取样时应注意不同部位微生物膜存在差异，可在PMI推断过程中造成影响。死亡原因也是影响尸体上微生物群落分布的一个重要因素，在今后的研究中值得探讨。另外，死者的衣着状态（或尸体表面是否存在包裹物）、河岸土地的使用情况以及水体流速等都可以直接影响尸体表面的微生物膜菌群，继而可能影响其在法医学中的应用。在目前研究中，尚未深入探讨这些影响因素，但这些因素是实际工作中不可避免的，也是推断PMI必须综合考虑的。
微生物膜作为微生物的重要存在形式，广泛分布于人体、医疗设备和水体中，与尸体的腐败和死亡时间密切相关。近年来，微生物膜在法医学方面的应用，尤其在PMI推断方面的研究日益增加，宏基因组测序等技术的发展和普及也为微生物膜的研究提供了支持。但是，应用微生物膜推断PMI缺少足够的数据基础和统一的数学模型。如何将不同的影响因素进行归纳总结，并在影响因素相同或相似的情况下，探究合适的推断方法也将成为进一步研究的方向之一。当然，每一种PMI推断方法都有其局限性，不可能做到绝对的精确，微生物膜也不例外。在未来的研究中，可将微生物膜与生态学结合运用，使PMI推断更为准确。
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Prospects of Application of Microbial Biofilm to Estimate PMI of Corpses in Water
HAN Han,LIU Zhuo-ying,GUO Juan-juan,FU Xiao-liang,HE Jing,GUO Ya-dong,CAI Ji-feng
（Department of Forensic Medicine,College of Basic Medicine,Central South University,Changsha 410013,China ）
Abstract： In forensic pathology,the estimation of postmortem interval（PMI） has always been a difficult issue,and there is still lack of effective methods to estimate PMI of corpses in water.Microbial biofilm refers to the microbial population attached to non-biological or biological surfaces by microorganisms during microbial growth,that has a three-dimensional structure,surrounded by extracellular polymers and matrix networks created by itself.A series of community succession phenomena of microorganisms occur during the occurrence and development of microbial population.The microbial community and its succession process of this kind of biofilm attached to the surface of a corpse in water may become a new basis for estimation of the PMI of corpses in water.This review elucidates on the concept,classification,research methods,and influencing factors of biofilm and analyzes its application prospects in PMI estimation of corpses in water,which would provide new ideas for the researches in this field.
Keywords： forensic pathology;biofilms;postmortem interval;drowning;review
中图分类号： DF795.1
文献标志码： A
doi： 10.12116/j.issn.1004-5619.2019.05.016
文章编号： 1004-5619（2019）05-0596-06
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（81373249，81571855）
作者简介： 韩晗（1994—），女，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：583538543@qq.com
通信作者： 蔡继峰，男，教授，博士研究生导师，主要从事法医昆虫学、法医微生物学、法医临床学、法医病理学研究；E-mail：cjf_jifeng@163.com
（收稿日期： 2018-02-09）
（本文编辑：邹冬华）