李丽[1]2001年在《嗜盐微生物的分离、分类及应用研究》文中指出对采自渤海沿岸盐场和青海盐湖的80份样品进行了不同类群的嗜盐、耐盐微生物的分离，得到了73个菌株，其中包括20株细菌，51株放线菌及2株真菌。本实验对这些分离菌株进行了耐盐、耐碱测定；进行了形态、细胞化学分析；采用16S rDNA全序列分析等分类方法对其中一些中度嗜盐放线菌进行了系统发育研究；此外，本实验还对供试菌株的生理活性物质和降盐效果进行了研究。 研究发现，分离菌株多为中度嗜盐菌，生长最适NaCl浓度为5～10％，有的甚至可在饱和盐溶液中生长。其中的中度嗜盐放线菌多数耐碱性强，在pH值11.0的条件下生长良好。放线菌D1011和G2013是嗜盐嗜碱放线菌，盐度低于2％，pH值低于8.0即不生长。 对分离的放线菌和真菌进行了形态的电镜观察，除链霉菌属外，大多数菌株无法根据形态判定其种属，说明仅依靠形态特征进行分类是不准确的。测定了部分嗜盐放线菌的细胞壁氨基酸组分，发现本次实验分离的放线菌株多数含有meso-DAP，为稀有放线菌。 对5株菌（编号分别为D1013、D3115、D3116、D3414、D3615）进行了16SrDNA序列分析，结果表明D1013、D3115、D3414均属于拟诺卡氏菌属（Norcardiopsis），D1013是与N.antarctica关系最近的分类单元，D3115和D3414是与N.dassonvillei关系最近的分类单元。D3116属于链霉菌属（Streptomyces），是与S.griseus subsp.griseus关系最近的分类单元。 16S rDNA基因近乎全序列分析结果表明菌株D3615可能属于拟诺卡氏菌属，根据16S rDNA基因全序列分析构建了拟诺卡氏菌属的系统发育进化树，由系统发育树可以看出，菌株D3615属于拟诺卡氏菌属，且形成独立的分支，与拟诺卡氏菌属已描述的菌种的模式菌株的16S rDNA序列之间的差异数在20～61nt之间，差异较为明显。生理生化特性试验也发现其与拟诺卡氏菌属的其他菌株有一定差异。因此菌株D3615可能为拟诺卡氏菌属的一个新的分类单元。 摘 要 本实验还对分离所得嗜盐菌进行了应用研究。对两株放线菌所产生的生理活性物质进行了抗菌谱测定，发现两者均对革兰氏阳性细菌有很好的抑制作用，也可抑制部分真菌的生长，抗菌谱较广。最后对嗜盐微生物的降盐效果进行了研究，发现几乎所有嗜盐菌对培养液中NaCI含量减少都有一定的作用，降盐与耐盐性之间有一定的相关性，但不明显，降盐性与菌株特性也有密切关系。一些菌株的降盐率在20％以上，如果通过驯化、基因转移等技术处理，将可能高效用于高盐污水处理乃至海水淡化。
李艳华[2]2003年在《嗜盐与耐盐微生物的分离与系统分类》文中指出本文综述了嗜盐微生物的种类、嗜盐机理及嗜盐微生物的分类研究进展，同时介绍了多相分类所采用的技术方法，并对嗜盐微生物的研究意义进行了阐述。 从沧州盐场和黄骅港海水采集的35份样品进行了不同类群的嗜盐、耐盐微生物的分离，得到了48个菌株，其中包括46株放线菌及2株真菌。采用形态学、细胞化学、生理生化、DNA G+Cmol％及16S rDNA序列分析等多相分类的技术对所分离的部分放线菌进行了系统的分类研究。此外，本实验还对两株真菌进行了形态学、部分生理生化、DNA G+Cmol％及18S rDNA序列分析、生活史等多相分类的系统研究。 对分离放线菌形态的电镜观察表明：大多数菌株无法根据形态判定其种属。研究发现，分离的放线菌菌株多数为中度嗜盐菌，生长最适盐度为5％-10％。多数菌株嗜碱性强，在pH值8.0-9.0条件下生长良好。对部分放线菌的全细胞壁氨基酸组分的测定发现，多数菌株含有meso-DAP，为稀有放线菌。醌类分析结果表明多数菌株为MK-9(H_6)，MK-9(H_8)。菌株10001为MK-9(H_2)。生理生化结果说明嗜盐放线菌的碳源利用广泛，能利用17种碳源的绝大部分，均能产生淀粉酶和具有降解酪氨酸的活性。 对供试菌进行了DNA G+Cmol％及16S rDNA序列分析。测定的放线菌DNA G+Cmol％与其相应属DNA G+Cmol％相吻合。对11株放线菌进行了16S rDNA序列分析结果表明，菌株10001属于纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)，与其关系最近的Oerskovia，jenensis rDNA序列相似性为93.23％，其序列差异已在属水平，且与该科内的其他属不在同一分支，可能为新属。菌株10035属于链霉菌属(Streptomyces)，与其关系最近的菌株Streptomyces yunnanensis16S rDNA序列相似性为97.54％，可能是新种。菌株10002与N．lucentensis16S rDNA序列相似性为98.51％。菌株10010与N．lucentensis16S rDNA序列相似性为98.80％。菌株10001与菌株10010 16S rDNA序列相似性为99.58％，但菌株10010和菌株10002菌落颜色不同，且在细胞壁糖型、醌类及DNA G+Cmol％等方面有差异，可能为不同种。菌株10030与N．lucentensis16S rDNA序列相似性为98.94％。菌株10036与N． 摘要lueenrensis16s:DNA序列相似性为98.94%，菌株10030与菌株10036二者之间的165 rDNA序列相似性为100%，但在细胞壁糖型、酉昆类及DNAG+Cmol%等方面有差异，可能为不同物种。菌株10021与Nantarctical6S:DNA序列相似性为99.86%。菌株60002与Nanta理tieal6s rDNA序列相似，l生为99.72%，菌株10021与菌株60002 1 65 rDNA序列相似性为99.86%。菌株60006是与南极拟诺卡氏菌(Nantarctica)关系最近的分类单元。菌株1 0011、菌株10019均为拟诺卡氏菌属 (Nocardioptsis)的菌株。分类地位较接近的菌株需进行DNA一DNA杂交以确定它们是否为同一种。 对分离的一株真菌(’菌株05001)进行了形态学的电镜观察，发现抱子表面有突起，菌丝直径约为7一8;m.，其生长盐度范围为5一犯%，最适生长盐度为15一20%，是极端嗜盐菌，其生长最适pH值为7.0。DNAG十c mol%为65 .85%。系统树显示菌株05001属于Trichoeomaeea。。从1 85:DNAJ字列相似性来看，菌株05001与Trichoco阴acea。内的其他属系统进化关系较远，形成独立的分支，与爪哇青霉菌(E叩enseilliumjavanicum)185 rDNA序歹Ij相似性为98.91%，显示出最近的亲缘关系，但差异己在属水平，所以认为其为一新属，命名为链饱霉属(StrePtosP口romy)。在生活史试验中未发现有性阶段，故暂认为其为半知菌类，综合实验结果，该菌株命名为嗜盐链抱霉C助月叩tosPoromy halorhila gen·nov.sP·nov)。 另一株真菌菌株05002生长盐度范围为0一20%，最适生长盐度为0一5%，是耐盐菌。生长最适pH值为7.0。但其最适生长温度为4一10℃，属于低温菌。 通过上述多相分类的深入研究，确定了供试菌株的分类地位及系统发育关系。 菌株10001为纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)一新属，菌株10035为链霉菌属(凡尸印to恻ces)一新种，菌株1 0002和菌株1 00 10，菌株1 0036和菌株1 0030可能为拟诺卡氏菌属(肠cardiop:l’s)的新种。 菌株05001为Triehocomaceae的一新属，命名为链袍霉属(&尹印to胡oro呷)。该菌株命名为嗜盐链抱霉(￡介叩tosPoro呷halophila gen.nov.Sp.noV)。
陈雷[3]2009年在《嗜盐微生物的多样性分析及其抗菌与抗肿瘤活性研究》文中研究说明开发可培养的嗜盐微生物并检测它们潜在的抗菌和抗肿瘤活性,从中发现新颖的化合物,将具有重要的理论意义和应用价值。对从山东省威海盐场采集的底泥和海水样品中存在的微生物进行了分离。测定了各种嗜盐菌株的生长特性,并依据其嗜盐特性进行了分类。通过形态观察和分子生物学方法对嗜盐菌株进行了分类鉴定和系统发育分析。对嗜盐菌株进行抑菌活性筛选,并测定嗜盐菌株的粗提取物对肿瘤细胞生长的抑制作用。从盐场样品中共分离到45株细菌、28株真菌和38株放线菌,都具有中度嗜盐特性。嗜盐细菌的系统发育分析表明,17个菌株属于厚壁菌门(Firmicutes),分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、动性球菌属(Planococcus)和盐水球菌属(Salinicoccus);其他28个菌株均属于γ-变形细菌纲(γ-Proteobacteria)的盐单胞菌属(Halomonas)。嗜盐真菌均属于真菌门(Eumycota)的半知菌亚门(Deuteromycotina),9个菌株属于曲霉属(Aspergillus),19个菌株属于青霉属(Penicillium)。嗜盐放线菌属于放线菌门(Actinobacteria),主要以链霉菌属(Streptomyces)为主。嗜盐细菌对革兰氏阳性菌、多种人病原真菌和植物病原真菌都表现出较强的抑制作用;嗜盐真菌对革兰氏阳性和阴性细菌都有明显的抑制作用。14株细菌、13株真菌和20株放线菌的粗提物对肿瘤细胞都表现出很强的抑制作用。结果表明,嗜盐微生物可作为发现新颖生物活性物质的潜在资源。
杨勇[4]2009年在《河西走廊地区嗜盐菌分类学研究》文中认为我们从甘肃河西走廊地区的高盐环境采集到样品,进行嗜盐微生物的分离和多相分类学研究。并对分离到的嗜盐菌菌株进行形态特征、培养特征观察和生理生化性质的测定,以及16S rRNA序列分析等多项分类技术对其进行系统的分类研究。采用分离用固体培养基对样品中的嗜盐微生物进行分离和筛选,先后两次共得到28个菌株,并对其中4个菌株做了更深入的研究。其中海球菌属(Marinococcus)的叁个菌株DH1、DH3、AF2均为革兰氏阳性球菌,好氧,有鞭毛,能运动,无内生孢子,最适生长温度为28℃,最适盐度为8%,过氧化氢酶阳性,氧化酶、脲酶、酯酶阴性,并且均不能水解淀粉、干酪素和明胶。AF2不能在没有NaCl的条件下生长,DH1和DH3可以;AF2的硝酸盐还原反应为阳性,DH1和DH3的为阴性;DH1在没有Mg~(2+)的条件下活力受到明显的影响,DH3在Mg~(2+)不存在的情况下活力受到轻微的影响,AF2则对Mg~(2+)不敏感;叁者在碳源利用和抗生素实验中也有较明显的差别。Lentibacillus属的菌株AK5为革兰氏阳性杆菌,大小为0.5-0.7×1.5-3.0μm,有鞭毛,能运动,不产芽孢,好氧,最适生长温度为37℃,生长NaCl浓度范围为0%-15%,过氧化氢酶和脲酶阳性,氧化酶阴性,能够水解淀粉和明胶,不能水解干酪素和纤维素,硝酸盐还原、甲基红实验及VP实验阳性,不产生H_2S和吲哚,对四环素、氯霉素、青霉素、利福平敏感,不能以果糖、蔗糖、肌糖、乙酰胺和糊精作为唯一碳源,不能利用果糖产酸。通过16S rRNA系统发育分析及生理生化特性的比较,菌株DH1、DH3、AF2可能为海球菌属潜在的新种,菌株AKS可能为Lentibacillus属潜在的新种。
张琦[5]2013年在《四川泡菜中嗜盐微生物的分离与鉴定》文中研究表明本文通过菌落形态特征、SSU rRNA(16S rRNA、18S rRNA)、ISR(26S rRNA D1/D2区系统发育、16S-23S rRNA ISR区间分析)和脂肪酸分析等分离鉴定四川泡菜盐卤中的嗜盐微生物，为解析盐卤中嗜盐菌在四川泡菜发酵过程中的生物学过程和四川泡菜风味的形成机理提供了前期基础。是广泛应用于所有生物进化关系研究的分子标识。从四川泡菜盐卤中分离获得54株嗜盐细菌。所有分离菌株皆为革兰氏阳性菌，其中ZQ1和ZQ4最适NaCl生长浓度为7%(w/v)，ZQ26最适NaCl生长浓度为12%(w/v)。其余51株菌的NaCl生长浓度范围为0%-20%(w/v)，最适生长浓度6%(w/v)，不产生吲哚，酪素水解、明胶液化、淀粉水解和马尿酸水解为阴性，过氧化氢酶和脂酶为阴性。16S rRNA序列分析表明：54株菌分别属于细菌域的Virgibacillus，Staphylococcus和Oceanobacillus属。菌株ZQ1、ZQ4与Virgibacillus halodenitrificans的16S rRNA基因序列相似性为99%；菌株ZQ26与Staphylococcus cohnii的相似性为99%，其余菌株与Oceanobacillus oncorhynchi在16S rRNA水平上相似性为98%-99%。作为优势菌的O.oncorhynchi在16S-23S rRNA ISR水平的分析进一步表明：51株O. oncorhynchi被分成五个亚类，这五个亚类的代表菌株ZQ30、ZQ35、ZQ36、ZQ42和ZQ52的全细胞脂肪酸的种类和含量皆存在差异。这一结果暗示了盐卤中的O. oncorhynchi菌在种内水平上已经发生了分化。从四川泡菜盐卤中分离获得34株嗜盐酵母菌。分离菌最适生长温度为25-28℃，NaCl生长范围为0%-12%（w/v），具膜，有假菌丝，产生子囊，不产生淀粉，尿素水解、醋酸产生、重氮基蓝B（DBB）为阴性，脲酶为阴性。18S rRNA序列分析表明：34株菌属于Pichia属，分离菌株的18S rRNA序列与Pichia manshurica的18S rRNA序列相似性达到99.22%以上。分离菌株的26S rRNA D1/D2区序列与P. manshurica的26SrRNA D1/D2区序列相似性达到99.90%以上，进一步证实了分离菌株为毕赤酵母属P.manshurica。而代表菌株P42、P43、P45、P5和P55菌株在脂肪酸种类和含量上均有差异。这一结果暗示了盐卤中的P. manshurica菌在种内水平上已经发生了分化。
张为艳[6]2015年在《新疆阿克苏盐矿嗜盐微生物多相分类和基因组研究》文中研究指明嗜盐微生物是一类生长最适盐浓度大于0.2M的微生物。从低盐度到高盐度甚至饱和盐度,都有相应的嗜盐微生物生长,故它们遍布于各种含盐环境中,如海洋、盐湖、盐矿、晒盐场、含盐土壤以及腌制食品中。新疆阿克苏地区盐矿极其古老,且该地区的气候干燥、土壤营养条件以及温度等环境因素极其恶劣。故在此极端环境下生存下来的嗜盐微生物具有独特的环境适应性,如对高盐、辐射以及干旱环境的耐受性。目前对阿克苏地区盐矿的嗜盐微生物的研究较少,对极端嗜盐古菌的研究更少,故很有必要对此环境中的嗜盐微生物资源进行研究,发现新的物种资源,并对其中具有特色的微生物进行基因组分析,发现新的基因资源,探索微生物极端环境耐受机制。为极端环境中嗜盐微生物资源的研究提供有用的素材和参考,同时也对研究生命起源早期的微生物与地球生命演化历史的研究具有重要意义。本研究主要以我国新疆阿克苏地区盐矿(温宿县盐矿、库车县盐矿和拜城县盐矿样品)样品作为研究材料,采用可培的微生物分离方法,获得了一些嗜盐微生物资源,包括嗜耐盐细菌和嗜盐古菌,其中有部分菌株为新的分类单元。并且根据多相分类学原则,采用传统的分类学、化学分类、基因组以及系统发育分析相结合的方法,对其中具有代表性的4株嗜盐古菌以及2株中度嗜盐细菌进行了研究。结果表明,这6个菌株代表了4个嗜盐古菌新种和2个中度嗜盐细菌新种：Halolamina salifodinae WSY15-H1T、Halolamina salina WSY15-H3T、Halopiger salifodinae KCY07-B2T、Halopelagius longus BC 12-B1T、 Aquibacillus salifodinae WSY08-1T、Bacillus salitolerans KC1T。迄今为止,Halolamina属共有4个种,Halopiger属共有3个种,Halopelagius属共有3个种,Aquibacillus属共有4个种,Bacillus属共有200多个种。本研究丰富了嗜盐微生物物种资源库,也将为后期的相关研究提供材料。在完成以上6株新种微生物鉴定的基础上,选取了其中一株分离自库车盐矿样品的嗜盐古菌新种菌株Hpg. salifodinae KCY07-B2T进行了全基因组测序和分析。基因组大小4.35 M,包括81个scaffolds, G+C含量为65.41%,总共预测到4,254个基因,其中4,204个编码蛋白基因、45个tRNA基因、1个16S rRNA基因、2个23S rRN A和2个5S rRNA。从基因组中分析其环境适应性机制,发现该菌株可能拥有两种高盐环境适应机制：菌株基因组中含有较为完整的吸收和合成甘氨酸甜菜碱相关的基因；也存在大量的基因编码与K+和Na+转运相关的蛋白体系。此外,基因组中还存在大量与抗高紫外辐射相关的基因,拥有多种DNA修复系统。使得该菌株在盐矿环境中能够得以生存。
魏有霞[7]2007年在《茶卡盐湖抗菌活性物质产生菌的筛选及其生物学特性的研究》文中指出随着化学药物和抗生素的广泛使用，微生物的抗药性逐渐增强。与此同时，环境污染的加剧，社会和人文的变迁使人类的免疫力不断下降，新的致病菌和条件致病菌不断出现，这种微生物日益增强的抗药性和新致病菌的不断出现已成为一个严重的社会问题。要解决这一问题，最有效的办法就是加大力度，筛选开发新的抗生素。青海高原盐湖以其独特的生境条件已成为开发新抗生素的重要来源。本试验先后两次采集青海茶卡盐湖的底泥样品，然后用不同种类的培养基分离出了200个菌株，其中绝大多数是细菌。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母以及从辣椒枝和黄瓜叶中分离出的4种植物病原真菌作为指示菌，通过抗菌试验，筛选到抗菌活性物质产生菌12株。从实验结果来看，这12株抗菌活性物质产生菌株在拮抗病原菌株测定中，对病原菌有着较好的抑制作用。尤其在拮抗病原真菌的抗菌筛选中，这些抗生素产生菌株有着较强的抑菌效果，这为寻找广谱、高效、低毒的生物农药提供了优秀的拮抗菌种资源。另外，对这12株抗生素产生菌通过生物学特性和生理生化方面的初步研究，从而为开发青海高原盐湖微生物资源提供了科学的理论依据。
朱德锐[8]2014年在《青海湖嗜盐菌多样性与四氢嘧啶的生物合成机制研究》文中研究表明青海湖(Qinghai Lake或Blue Lake)是我国境内最大的内陆咸水湖,地处青藏高原东北隅,海拔3194m、面积4282.3km2,是国家级自然保护区,被国际重要湿地名录收录。青海湖是青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)生物多样性最丰富的宝库之一,水体与土壤中栖息有嗜盐、嗜冷和嗜碱等多种环境微生物,并且这些微生物具有典型的生理生化特点和特殊环境适应性。嗜盐微生物(Halophiles)是一类新型的极端环境微生物(Extremophiles)、因其应用广泛而颇受关注,如在嗜盐机理、嗜盐菌素(Halocin)、相溶物质(Compatible solute)、细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin)等基础研究；如在精细化工、环境生物治理、生物电子和医药工业等应用研究方面。鉴于高原地区生态环境的优势,针对青海湖嗜盐菌的生长特性、种群多样性、系统进化和相容溶质四氢嘧啶(Ectoine)合成机制的相关研究,具有重要的基础研究意义。同时,了解与掌握区域微生物的种群多样性,对于制定地区的自然保育政策,以及开展生物多样性保护与生物自然资源的应用开发,提供重要的参考依据。本论文系统综述了嗜盐细菌的生存环境、基本分类以及渗透压调节机制的研究现状,并重点讨论四氢嘧啶生物合成与分解代谢、合成转录调节机制、工业化生产菌株以及过量化生产策略的研究进展。通过分析青海湖嗜盐细菌的存在现状、生长优势种群、胞内四氢嘧啶的积聚与影响因素,以及解析四氢嘧啶生物合成ect操纵子的结构特征与调节模式等初步研究,获得了以下主要成果：1)本研究首次从青海湖水体中分离筛选嗜盐菌种资源,分析青海湖可培养嗜盐菌的种群多样性。利用OSM培养基(Oesterhelt-Stoeckenius medium)获得了35株青海湖嗜盐菌种质资源,并构建了青海湖嗜盐菌的种群系统发育树和确定其进化定位。青海湖嗜盐菌以中度嗜盐菌为主,约占62.9%；轻度嗜盐菌次之,约占22.9%；耐盐菌与非嗜盐菌分别占11.4%和2.9%。根据16S rRNA序列的系统发育,分析表明：Y-变形菌纲(y-Proteobacteria)菌株最多,约占68.6%；芽孢杆菌纲(Bacilli)次之,约占17.1%；放线菌纲(A ctinobacteridae)、α-变形菌纲(a-Proteobacteria)和散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)的类群才¨对较少。这些嗜盐菌分属于14个属,其中以海洋螺菌目盐单胞菌属(Halomonas)为优势种群,共计10株。Halomonas作为嗜盐机理与相溶物质Ectoine工业生产的模式生物,已被广泛应用。基于16SrRNA序列同源性分析、16S-23S rRNAISR-RFLP分析和菌体总蛋白SDS-PAGE谱带比较,我们初步认定10株青海湖盐单胞菌可分为7个种进化分支单元,存在潜在的新种。2)以优势中度嗜盐菌为材料,研究了相容溶质四氢嘧啶的积聚量与积聚影响条件。采用80%乙醇法抽提胞内四氢嘧啶,HPLC分析表明：大多数青海湖中度嗜盐菌胞内积聚四氢嘧啶,并初步获得5株具有四氢嘧啶高产潜力的野生菌株。以青海湖H. ventosae QHL5为材料,在Na+、K+、Mg2+、pH和温度等不同因素的影响作用下,利用HPLC分析QHL5胞内的四氢嘧啶生物积聚量。在优化条件下,QHL5积聚四氢嘧啶的最大浓度为379.6士8.26mg/L,达到167.1士3.64mg/g细胞干重。3)利用染色体步移技术,成功地克隆并表达四氢嘧啶的合成ectABC基因簇,构建了青海湖优势嗜盐菌四氢嘧啶合成基因簇物理图谱。青海湖盐单胞菌Halomonas sp. QHL1的ectABC操纵子全长序列3580bp,结构基因ectA(579bp)、 ectB(1269bp)与ectC(390bp)串联排列,ectA与ectB间隔109bp, ectB与ectC间隔91bp, ectA上游调控序列635bp。基于生物信息学预测分析知：两个启动子(67o与838因子控制)和若干未知功能的保守模序存在于QHL1的ect操纵子上游。4)利用分子克隆技术,构建了四氢嘧啶异源生物合成工程菌株(以Kcoli为宿主)。成功实现了ectA、ectB与ectC基因的异源表达,并构建了重组ectABC基因工程菌(Kcoli BL21/pET-28a (+)-ectABC),分析了耐盐能力。重组ectABC基因工程菌与对照Kcoli BL21相比,具有较高的盐耐受能力,但胞内四氢嘧啶合成量却偏低,尚需深入研究。重组嗜盐工程菌的耐盐能力和四氢嘧啶合成量的研究,为后续的开发和利用奠定了良好的基础,并提供了一定的技术支持。
梁华忠[9]2012年在《宏基因组文库高通量筛选古盐井中嗜盐微生物耐盐基因》文中研究表明耐盐工程菌的选育一直是生物耐盐工程研究的重点和热点。随着生物技术的发展，通过DNA重组和转基因技术向微生物体中导入耐盐基因，已成为提高微生物耐盐胁迫的重要途径。因此，耐盐基因材料的筛选对耐盐基因工程育种就显得尤为重要。盐生生物是耐盐基因筛选的重要对象。盐井作为一种特殊的人造高盐环境，其间分布着大量的嗜盐微生物。在漫长的高盐胁迫过程中，嗜盐微生物逐渐形成了一套高效的感应和传导盐胁迫的信号系统，并能特异性地表达一些基因以响应环境的盐胁迫。其中，耐盐蛋白是嗜盐微生物外排钠离子、降低盐害、提高耐盐特性的一种关键性输出系统，耐盐蛋白的有无及其活性的高低与嗜盐微生物的耐盐特性密切相关。因此，本研究利用宏基因组文库从盐井中筛选耐盐基因，以期为耐盐工程菌的选育提供基因材料。在本研究中，向采集的盐卤样品中加入1％的酪氨酸，在30℃、150r/min光照培养14~30天以富集菌体，然后提取总DNA，用Mbo I酶切后胶回收1~10kbp片段与Bam HI酶切并去磷酸化的载体pUC18连接后，电转化入耐盐基因缺陷菌株E.coli KNabc，构建宏基因组文库。以0.2mol/L NaCl为筛选因子筛选耐盐基因。实验中筛选到了98个耐盐克隆子，其包含的外源DNA片段主要集中在1~2kbp，其包含的耐盐基因编码的蛋白分别属于AdoMet_MTases superfamily、AAT-I superfamily、PMSR superfamily、OM-channelssuperfamily和ArsB/NhaD permease superfamily蛋白家族，其中编码蛋白属于ArsB/NhaDsuperfamily蛋白家族的基因（accession：JN168102）为ArsB膜转运蛋白基因，命名为K-ArsB，含有该基因的耐盐克隆子命名为E.coli K-ArsB，该基因编码蛋白命名为K-ArsB。对筛选到的耐盐基因K-ArsB进行生物信息学分析，结果表明：K-ArsB包含1个长993bp的开放阅读框，编码330个氨基酸，其转录起始密码子为ATG、转录的终止密码子为TAG、-10区保守序列为GTTAAT、-35区保守序列为TTGAT、SD序列为AGGAGG；PSIPRED分析表明，K-ArsB编码的氨基酸多数以α螺旋形成二级结构，少数以无规卷曲形成二级结构，没有β折叠；K-ArsB编码的蛋白质的理论等电点为pH7.02，平均分子量为34999.81Da，属于ArsB/NhaD permease superfamily蛋白家族，与数据库中Klebsiella sp. MS92-3的ArsB (accession: ZP_08303599)相似性为95%，Escherichiahermannii NBRC105704的ArsB (ZP_09808970)相似性为94%，Escherichia sp. TW09308的ArsB(ZP_09461528)相似性为89%， Serratia proteamaculans568(accession:YP_001478619)和Yersinia frederiksenii ATCC33641(accession: ZP04631221)的ArsB相似性为87%，该蛋白整合到细胞膜上，存在着9个跨膜区域，具有转运钠盐、砷酸盐、硫酸盐、亚锑酸盐以及有机阴离子通过生物膜的功能，在维持细胞内外的渗透压平衡中起到重要作用。通过对含有ArsB膜转运蛋白基因K-ArsB的耐盐克隆子E.coli K-ArsB进行SDS-PAGE凝胶电泳和盐碱耐受性实验发现，K-ArsB编码一种分子量约为35KD的蛋白质，能显着提高E.coli KNabc对NaCl和碱性pH的耐受能力，是一个良好的耐盐基因。本研究对于理解古盐井中嗜盐微生物的嗜盐机制，开发古盐井中的基因资源及寻找新的耐盐基因具有重要意义。
龙启福[10]2012年在《青海湖可培养嗜盐菌种群分子进化差异分析》文中研究说明目的嗜盐菌（Halophile）是一类能够在高盐极端环境下生存、生长的微生物，多分布于海洋、盐湖、盐场以及腌制品等环境中。嗜盐菌具有特殊的生理结构和代谢机制，对维持生态平衡具有重要意义。青海湖，位于青藏高原东北部，是我国最大的内陆咸水湖，含盐度约为6%，湖中嗜盐菌种类丰富，特殊的生态环境使青海湖嗜盐菌长期生存在高盐、低压、缺氧环境中。目前针对青海湖嗜盐菌嗜盐特性、生理生化特性、种群多样性、分子进化和耐盐机制的研究以及盐单胞菌属菌株种间多样性的分析，鲜见报道。本研究旨在通过微生物富集、分离、纯化获得青海湖可培养嗜盐菌种质资源，研究其耐盐特性；通过16S rDNA序列分析构建系统发育树，研究青海湖可培养嗜盐菌的种群进化关系；通过PCR扩增青海湖中10株盐单胞菌属菌株16S rDNA序列和16S-23S间隔序列，采用测序、Blast对比以及RFLP等方法分析这10株嗜盐菌的序列差异，并结合SDS-PAGE技术方法研究其全菌体蛋白的种间差异，以期了解青海湖嗜盐菌菌种资源的分布状况，为后续应用开发奠定坚实的基础。方法采集青海湖不同区域水样20份，采用RM培养基（不同盐度），筛选分离、纯化培养获得嗜盐菌种质资源；在RM固体培养基上观察菌落形态，采用革兰氏染色法在光镜下观察菌体形态特征；采用不同NaCl浓度梯度的RM培养液，对纯化菌株进行耐盐度测定，依据嗜盐菌分类标准初步进行分类；采用单因素实验，测定不同温度、pH值和Mg2+浓度对其生长的影响；参照细菌鉴定手册测定不同碳源、不同氮源对各菌株生长影响的试验；利用微生物生理生化鉴定测试项目，初步鉴定中度嗜盐菌，并进行种属定位分析。提取青海湖可培养嗜盐菌菌株总DNA，以总DNA为模板扩增16S rDNA片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化回收并测序，并将序列提交至NCBI数据库。基于16S rDNA序列，采用MAGE4.0软件构建系统进化树，并进行16SrDNA RFLP分析、16S-23S rDNA ISR分析和全菌体蛋白SDS-PAGE分析，确定其种间分子进化差异和系统学分类单元。结果从20份青海湖水样分离出青海湖嗜盐微生物种质资源35株，其中细菌34株，真菌1株。在菌落形态特征上，圆形或椭圆形占88.57%，颜色以白色或乳白色居多，其中因天然色素存在于一些菌体中，菌落呈红色、橙红色、黄色或淡蓝色，约占40%。在显微形态上多为长杆或短杆状，约占80%，球形或弧形约占14.28%，丝状约占5.7%，革兰氏阴性菌占74.28%。通过耐盐梯度实验，35株青海湖嗜盐菌以中度嗜盐菌为主，约占62.85%，轻度嗜盐菌约占22.85%，非嗜盐菌与耐盐菌约占14.28%，未分离出边界和极端嗜盐菌，据此确定中度嗜盐菌为青海湖嗜盐菌生长优势种群类型。从初步分离获取的22株中度嗜盐微生物中，选择最适生长盐度范围较宽泛的典型菌株15株，进行生长特性研究，结果表明青海湖中度嗜盐微生物能在10~45℃生长温度范围生长，其中一些菌株甚至能在5℃生长，此与青海湖地处高原地区环境有关。22株中度嗜盐菌能在pH为5.5~11的范围内生长，且最适pH均大于7.5，此与地区盐碱化环境密切相关，具有嗜盐兼嗜碱的特性。因菌种属性的差异，中度嗜盐菌对Mg2+的生长需求不同，耐受程度亦不同，最大浓度达到1.6mol/L。碳氮源利用实验结果显示，大多数青海湖中度嗜盐菌能以果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、海藻糖和纤维二糖作为碳源生长；其它碳源利用，因菌株差异而不同。在氮源利用方面，大多数菌株能利用酵母抽提物、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钾、硝酸钠和硝酸钙进行生长，不能在亚硝酸钠中生长。通过提取细菌基因组DNA和16S rDNA测序，构建系统发育树，得出青海湖可培养嗜盐菌的种群发育主要有4个进化分支单元，分别为γ-变形菌纲、厚壁菌门、放线菌门和α-变形菌纲，隶属于14个不同的属类群。基于16S rDNA分析得出35株青海湖嗜盐菌中有10株菌株同属于γ-变形菌纲海洋螺菌目盐单胞菌科盐单胞菌属，为革兰氏阴性菌，属中度嗜盐菌范畴(盐度范围0.4～3.5mol/L，最适盐度0.5～2.0mol/L)，但形态特征和生长特性具有明显的差异。通过对10株盐单胞菌属菌株进行16S-23S rDNA ISR多态性分析、全菌体蛋白SDS-PAGE分析和16SrDNA分析，可初步确定10株菌株可分7个种进化分支单元，证实10株盐单胞菌属菌株在种间分子水平差异具有高度的一致性，同时验证了分子表型特性的多相研究对种单元初分类具有重要意义。结论立足高原地区生态环境的优势，本研究首次分离了35株青海湖嗜盐菌株，并对其进行了的16S rDNA基因序列同源性，初步分析了青海湖可培养嗜盐菌的种群多样性，为后期获得和利用相关耐盐基因提供了基础，也为将嗜盐菌应用于农业抗盐碱化工程、高盐污水处理系统提供理论支持。
参考文献：
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[2]. 嗜盐与耐盐微生物的分离与系统分类[D]. 李艳华. 河北大学. 2003
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[4]. 河西走廊地区嗜盐菌分类学研究[D]. 杨勇. 兰州大学. 2009
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[6]. 新疆阿克苏盐矿嗜盐微生物多相分类和基因组研究[D]. 张为艳. 浙江大学. 2015
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[8]. 青海湖嗜盐菌多样性与四氢嘧啶的生物合成机制研究[D]. 朱德锐. 华中师范大学. 2014
[9]. 宏基因组文库高通量筛选古盐井中嗜盐微生物耐盐基因[D]. 梁华忠. 西华大学. 2012
[10]. 青海湖可培养嗜盐菌种群分子进化差异分析[D]. 龙启福. 青海大学. 2012
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