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【摘要】 SAP能与体内运输胆固醇的HDL通过Ca2+依赖性结合，同时HDL被认为具有抗粥样硬化的作用，且SAP与HDL在体内呈负相关。目前的临床研究表明盐酸苄丝肼对于脑膜炎或合并脑动脉硬化的效果比较好，推测盐酸苄丝肼同样能够作用于血管的粥样硬化，故而对实验小鼠进行腹腔给药。本实验通过对小鼠胸主动脉血管切片的油红O染色来观察动脉血管壁的斑块情况，结合Q-PCR技术来检测SAP的mRNA在体内的转录水平以及运用ELISA法测定不同组别小鼠体内的SAP含量，结果表明，盐酸苄丝肼是可以下调SAP的基因转录寄表达。
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【关键词】 SAP；抗动脉粥样硬化；胆固醇
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）29-0102-02
1.油红O染色观察小鼠胸主动脉的斑块面积
2.Q-PCR法测定目的基因的mRNA水平
实验方法：
2.1 RNA的提取
2.2 总RNA浓度测定（1）取总RNA溶液1.5?l，用0.1%DEPC-H2O稀释至1.5ml（2）以0.1%DEPC-H2O作为空白对照，用微型分光光度计测定在260nm和280nm波长处的吸光度（OD260、OD280），根据OD260/OD280以判定RNA纯度（测定时需将RNA置于冰上）（3）根据下式计算RNA浓度，并用0.1%DEPC-H2O调整RNA浓度为1?g/?l。RNA浓度（?g/?l）＝OD260×40?g/ml×稀释倍数/1000。
2.3 逆转录反应
2.4 PCR反应（1）以逆转录后的cDNA为模板，用特异性的引物进行PCR扩增。在实验操作时，可以提前将正向引物和反向引物混合，分装冻存，用时直接取0.4?l即可。（2）上机操作打开仪器和电脑→点击SteponeSoftware→ExperimentName→SteponeplusInsfrument(96wells),△△Ct→SYBRGreenReagents→Standard(-2hourstocompletearun)
3.ELISA法定量测定小鼠血清中SAP含量
实验结果
3.1 小鼠胸主动脉油红O染色显微观察结果（200倍）
实验前期选取ApoE基因缺失小鼠作为实验对象，喂食高脂饲料进行造模，分组空白对照组和模型组，再根据腹腔注射盐酸苄丝肼药量的不同，分设低、中、高三组给药组。空白对照组的小鼠动脉血管切片，油红染色后显微镜下观察的结果比较清晰，在血管壁附近没有发现斑块的踪迹；模型组的小鼠动脉血管切片，显微镜下观察的通过同样比较明显，血管壁附近有一块较大的很明显的脱落型的斑块，这也表明造模比较成功。给药低剂量组的小鼠动脉血管切片，显微镜下不能发现向模型组那样大的斑块，但是血管壁上还是能够发现一些小的斑块的踪迹。给药中剂量组的小鼠动脉血管切片，血管壁上也能发现一些小的斑块。给药高剂量组的小鼠动脉血管切片，血管壁上零星能看见一些小斑块。由于斑块比较小，给药三组的切片染色结果其实相差不明显，没有表现出明显的梯度，都只能说明给药是能够减少斑块的形成，还不能说明某种剂量是治疗动脉粥样硬化的最佳剂量。
3.2 Q-PCR实验结果
荧光定量PCR的结果显示，不同组别的小鼠体内含有的血清淀粉样蛋白（SAP）的mRNA水平是不同的。其中空白对照组的SAP的mRNA的水平较低，符合预期。而模型组相较于空白对照组的水平明显升高。低剂量给药组的SAP的mRNA的水平也与模型组给药后，小鼠体内的SAP的mRNA的水平是明显降低的。高剂量给药组的mRNA水平相较于模型组反而上升了，说明可能高剂量给药对动脉粥样硬化的效果并不是很明显，反而低剂量给药组的治疗效果比较明显。Q-PCR的结果能表明盐酸苄丝肼是能抑制SAP的mRNA的水平。
3.3 ELISA实验结果
ELISA的结果显示，空白对照组结果符合预期，含量比较低。模型组的SAP含量明显升高，跟空白对照组形成超显著性差异。低剂量的SAP含量最低，高中剂量组次之，中剂量组相对高一点。表明动脉粥样硬化与体内SAP的含量存在一定的联系，但是给药三组的SAP含量并没有表现出一定的梯度性变化，都只能表明给药是有利于降低SAP的含量，可以抑制动脉粥样硬化。
4.实验讨论
前期试验通过给ApoE基因缺失的小鼠喂食高脂饲料建立模型组，给喂食后的小鼠同时腹腔注射不同含量的盐酸苄丝肼建立低、中、高三个组别，选取喂食正常饲料的小鼠作为空白对照组，最终建模成功。
首先对不同组别小鼠的胸主动脉血管切片进行油红O染色，判断出小鼠是否患有动脉粥样硬化以及盐酸苄丝肼是否产生抗动脉粥样硬化的作用。通过观察三组给药组能明显看出给药后，斑块变小的迹象，但是由于三组的斑块大小区别不明显，不能看出具体的给药趋势，只能知道给药后能够抑制动脉粥样硬化。然后，通过Q-PCR技术检测小鼠体内血清淀粉样蛋白P（SAP）的mRNA的水平。结果显示模型组相对于空白对照组有着显著性差异，并且给药后能看出mRNA水平的下降。但是三组给药组的水平的下降并没有表现出一定的趋势。再利用ELISA法测定小鼠体内SAP的含量，同样的，结果也表明模型组与空白对照组间存在显著性差异，同时三组给药组SAP含量都下降。Q-PCR以及ELISA的结果表明对小鼠腹腔注射盐酸苄丝肼是可以在一定程度上抑制动脉粥样硬化的产生，同时也证明了SAP的缺失抑制动脉粥样硬化的产生。
论文作者:刁曙荣
论文发表刊物:《医药前沿》2016年10月第29期
论文发表时间:2016/10/27
标签：小鼠论文; 给药论文; 动脉论文; 血管论文; 粥样论文; 盐酸论文; 剂量论文; 《医药前沿》2016年10月第29期论文;