彭州同一医院 病理科 四川彭州 611930
【摘 要】目的：研究p63、 Ki-67在宫颈上皮内瘤变(CIN)、鳞状细胞癌中的表达及意义。方法：采用免疫组化分别检测宫颈上皮内瘤变30例、浸润性鳞状细胞癌67例中p63、Ki-67的表达，30例正常宫颈做对照。结果： p63的阳性率与CIN分级呈正比，但CIN与鳞状细胞癌阳性率差异无显著性。p63的表达与CIN分级无明显相关性。p63的表达与宫颈癌组织分化程度成正相关。Ki- 67 蛋白的表达在从子宫颈正常组织→上皮内瘤变→宫颈癌发展过程中呈逐渐上升的趋势。结论：p63在宫颈癌形成早期可能起促癌作用，且可能是鳞状上皮源性肿瘤的标记物。p63可能与细胞增殖有关。Ki- 67蛋白可能参与前宫颈癌的发生发展。因此，应用p63、Ki-67标记对宫颈癌前病变和宫颈癌诊断及判断预后有重要的临床意义。
【关键词】宫颈上皮内瘤变(CIN)；鳞状细胞癌；p63；Ki-67
【中图分类号】R737.33 【文献标识码】B 【文章编号】1764-8999（2015）7-0699-02
p63, ki - 67 in cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and squamous cell carcinoma in the expression and significance.
Wu Min
(Department of Pathology, Pengzhou harmonious hospital, china)
【abstract】Objective: to study the p63, ki - 67 in cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and squamous cell carcinoma in the expression and significance. Methods: immunohistochemical detected in 30 cases of cervical intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma in 67 cases of p63, the expression of Ki-67, 30 cases of normal cervix as control. Results: the positive rate of p63 and CIN grade higher than, but CIN there was no significant difference with the positive rate of squamous cell carcinoma. The expression of p63 and CIN grade has no obvious correlation. The expression of p63 and positively associated with the degree of cervical cancer tissue differentiation. Ki - 67 protein expression in normal tissue from the cervical to intraepithelial neoplasia, in the development of cervical cancer is gradually rising trend. Conclusion :p63 form promote cancer early may play a role in cervical cancer, and could be the original in the squamous tumor markers. p63 May be associated with cell proliferation.ki - 67 protein may participate in before the occurrence of cervical cancer development. Therefore, the application of p63, ki - 67 markers for cervical lesions and cervical cancer before the diagnosis and prognosis have important clinical significance.
【Key words】cervical intraepithelial neoplasia (CIN); squamous cell carcinoma ;p63;ki-67.
宫颈癌前病变和宫颈癌的形成与与人乳头状瘤病毒感染后基因发生改变，致使宫颈鳞状细胞正常发育和生长出现复杂的多阶段过程。随着肿瘤分子生物学研究的深入，目前认为，细胞凋亡和细胞增殖之间的平衡失调对肿瘤的发生发展起着基本作用。p53基因[1]作为重要的抑癌基因，被广泛而深入的研究，且一直作为一个独立的而不是某个家族的成员来看待。直至近几年，其同源基因p63、p73的发现[2]才使人们认识一个古老而庞大的超家族的存在，并且另两个基因更为复杂，在遗传和生长发育等方面中起着重要的作用[3]。p63对外胚层的分化发育、上皮干细胞稳定性的维持起重要作用，在肿瘤的发生、发展中也起着重要作用，既可以促进肿瘤形成也可以抑制肿瘤生长[4]。因此,研究p63在肿瘤发生发展中的作用具有十分重要的意义[5] ，不同来源的肿瘤存在显著的差异，p63在宫颈鳞状细胞癌中呈过表达，所以成为研究的热点[6],国内本研究旨在应用免疫组织化学方法检测宫颈癌前病变及鳞状细胞癌中p63蛋白，Ki-67的表达情况，并探讨它们与宫颈癌的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
收集本医院2009～2014年宫颈活检组织及全子宫切除标本2794例。患者术前均未经过任何治疗。用正常宫颈组织30例，宫颈上皮内瘤变(CIN) 30例：CINⅠ级15例，CINⅡ级9例，CINⅢ级6例；浸润性鳞状细胞癌67例，按分化程度分级：高分化19例，中分化39例，低分化9例。患者年龄在32-78岁之间，平均年龄为(49)岁。
1.2 方法
标本经福尔马林固定后，常规石蜡包埋，蜡块以4μm厚度连续切片,免疫组化技术采用Power Vision二步法重复，用PBS替代一抗作阴性对照。免疫组化Power VisionTM二步法：①脱蜡水化；②过氧化氢孵育；③预处理：胰酶消化10min后，组织切片微波修复，时间分别是20min；④一抗孵育37c3omin；⑤滴加羊抗鼠IgG抗体一HRP多聚体；⑥DAB显色。
p63、Ki-67试剂均为超敏SP试剂盒(福建迈新公司)， Power Vision试剂盒(福建迈新公司)， DAB试剂盒(福建迈新公司)。
1.3 结果判断 p63、Ki-67阳性染色为棕黄色或棕褐色，均定位于细胞核内，采用二级计分法，阳性细胞计数：<5%，0分；5-25%，1分；25-50%，2分；50-75%，3分；>75%，4分。染色强度分类：淡黄色，1分；黄或深黄色，2分；褐或棕褐色，3分。两者计分相乘大于1者为阳性[7]。
1.4 统计学处理 各组间阳性率的比较采用2检验，有序分级资料进行线性趋势检验并经统计软件SPSS17.0处理。
2 结果
p63、Ki-67在宫颈上皮内瘤变、鳞状细胞癌中的表达情况
p63蛋白呈明显的核阳性表达,主要位于宫颈外口移行带区鳞状上皮的基底细胞胞核中。在CIN中,p63的阳性细胞数随病理分级的增高而增加;在鳞状细胞癌癌巢中的表达率可高达95%,但着色强度基本一致。在各组中可观察到p63表达于鳞状上皮化生部位及宫颈腺体柱状上皮下增生的储备细胞。CINI中，p63表达在基底细胞中，散在表达于棘细胞层；CINⅡ中，p63除在基底细胞表达外，棘细胞层表达比CINⅠ级明显增多，而CINⅢ级几乎全层都有p63的表达，p63在C1N Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表达存在显著差异(P<0．05)。p63阳性细胞在高分化鳞癌中，主要呈灶性分布于癌巢，而在低分化鳞癌中散乱分布于癌巢，但p63表达的阳性率与宫颈癌分化程度无明显相关性。在正常对照组、CIN和鳞癌之间，存在显著差异(P<0．05)，相关分析证明(r =，p<0．05)，呈正相关。Ki-67在非肿瘤性宫颈鳞状上皮标本中限于基底及副基底层，在 CIN 病变中,核异型细胞呈强阳性表达,且伴随病变层次的增加而表达强度和面积增加。Ki- 67 在宫颈癌 、CIN、 正 常 组 织 中 阳 性 表 达 率 分 别 为 49.3% ( 33/67) 、43.3%( 13/30) 和 13.3% ( 4/30) , 阳性表达率差异有显著性( P < 0. 05)。
p63、Ki-67在宫颈鳞状细胞癌中的表达情况与临床病理参数的关系见表，阳性率分别为82.1%(55/67)、95.5%(64/67)，但p63、Ki-67的表达率与性别、年龄、肿瘤分化程度及临床分期不相关(p>0.05)。
表：宫颈鳞癌鳞状细胞癌p63、ki-67表达与临床病理参数的关系
3 讨论
p63基因于1998年由Schmale等[8]首先报道,定位于染色体3q27～3q29,在人体组织中呈广泛而有选择性地表达,如肺、皮肤、骨骼、肌肉、乳腺、胸腺、淋巴细胞、神经组织、消化系统和泌尿生殖系统等,尤其在增生上皮组织的基底层,对于正常上皮的形成具有重要意义。在转录剪切后p63主要产生两大类异构体:具有经典转录激活DNA结合区和寡核苷酸化区的全长型p63异构体(TAp63)和缺少N端转录激活区的截短型p63异构体(ΔNp63)。其中,TAp63可与经典p53DNA结合位点结合,诱导细胞凋亡;ΔNp63不具有转录激活活性,以显性失活的方式抑制TAp63和p53依赖的靶基因的转录,不诱导凋亡[9] 。p63基因位于染色体3q27-3q29区，包含15个外显子,含有两个独立的启动子，第二个启动子位于下游30kb的一个内含子内。由于启动子的不同和剪切方式的不同，p63基因编码至少六种亚型的蛋白质,分子量不等，可分成两大类：从外显子1开始转录生成具有反式激活区的亚型称为TAp63；从另一个外显子3’启动子开始转录生成没有反式激活区的亚型称为ΔNp63。而根据C-末端的不同作如下分类：其中α亚型为全长的亚型，β亚型为在外显子12之后截断形成的亚型，γ亚型为剪切掉外显子11-14，而增加了外显子15后所形成的亚型。p63与p53在蛋白质结构上有很高的同源性：从N端到C端具有反式激活区(transactivation domain)、DNA结合区(DNA binding domain)和寡聚区(carboxy-oligomerization domain)，其氨基酸的同源性分别达22%、60%和37%。在DNA结合区p63与p53的同源性高达60%，提示p63和p53能够结合同一DNA位点，从而与同一靶基因结合，如p21、bax，然后在反式激活域(TA域)的作用下激活下游基因，诱导细胞周期阻滞或细胞凋亡，可能抑制肿瘤的发生，没有反式激活域的亚型(ΔNp63)则不能激活下游基因，可能以显性失活的方式促进肿瘤的发生[10]。因此，对肿瘤组织中p63蛋白能够维持上皮干细胞的稳定性，特别是在鳞状上皮，p63能够使基底干细胞向成熟上皮细胞的定向分化保持平衡，检测肿瘤组织p63的水平还可以提示肿瘤的发展和预后，Massion等[11]的研究认为p63的扩增只是早期现象，而侵袭性肿瘤并不再扩增或不表达，并且认为p63的扩增提示较好的预后。
总之，p63在鳞状细胞癌与其它类型的癌之间的表达的差异是显著的，是可以作为鉴别诊断的依据，更重要的是，p63与肺鳞状细胞癌的发生发展关系密切，其对于预防和治疗肿瘤有着非常重要的意义。
p63表达存在显著差异，呈正相关，这提示p63对宫颈癌的形成起促进作用，而非肿瘤抑制基因；p63的表达与CIN中鳞状细胞成熟度呈相反联系，也表明它对宫颈瘤样病变的分期是有用的；
p63在高级别病变中的鳞状细胞前体中表达，本文实验也证实它们都与相似的鳞状上皮细胞群起反应，p63在不典型增生的鳞状上皮细胞中表达率高。Ki-67在子宫颈癌组和 CIN 组明显高于正常宫颈上皮组, 差异具有显著性, 与文献结果较一致[12], Ki-67是存在于增殖细胞核基质内的一种核蛋白，与细胞增殖相关。Ki-67 参与细胞周期的调控网络, 理论上, 可作为诊断和预测肿瘤对治疗的敏感度及其结局等方面的标志物, 在肿瘤的分级、增生程度、预后的预测中均有一定的意义。研究表明，许多原癌基因的活化和抑癌基因的失活与增殖基因调控失常有关。本文研究发现，Ki-67在正常宫颈组织、宫颈炎及CINI中表达率低，CINⅡ、Ⅲ及浸润癌中显著升高，直至低分化癌达到高峰，提示Ki-67过表达是贯穿整个宫颈癌变过程中的。而p63在CINIII与鳞癌中表达差异无显著性(Hc=0．117，P>0．05)，且在鳞癌组织分化分级中的阳性表达率无明显差异，提示p63是宫颈肿瘤发生的早期。虽然p63与Ki-67表达不能完全一致，但p63阳性表达也位于高度增生潜能的细胞，在终末分化性细胞缺如，提示p63可能有促进癌细胞增殖去分化的作用。
据以上情况，在宫颈组织中，p63优先表达于鳞状上皮具有高度增生潜能的基底细胞，可能与细胞增殖有关。因此可以作为鳞状上皮源性肿瘤的标记物。p63在宫颈癌形成早期可能起促癌作用，并未作为肿瘤抑制基因，故其在肿瘤的发生和细胞凋亡中的作用还有待进一步的研究。Ki-67在非肿瘤性宫颈鳞状上皮标本中限于基底及副基底层，在 CIN 病变中,核异型细胞呈强阳性表达,且伴随病变层次的增加而表达强度和面积增加,能够比较好地显示瘤细胞在鳞状上皮中所占的比例,协助病变的分级以及对临床治疗以及预后提出客观的参考据,Ki-67可以作为一个反映病变程度和分级的敏感指标。Ki- 67 参与细胞周期的调控, 理论上, 可作为诊断和预测肿瘤对治疗的敏感度及其结局等方面的标志物, 在肿瘤的分级、增生程度、预后的预测中均有一定的意义。
参考文献：
[1] Strano S，Rossi M，Fontemaggi G，et 01．From 063 to p53 ac㈣p73[J]．FEBs Lett，2001，490(3)：163—170．
[2] L'win MS，Kaelin WG Jr．Role of the nGamrer p53 family proteins in ma—lignancy[J]．Apoptosis，2001，6(1-2)：17—29．
[3] Yang A，Kaghad M，Wang Y，et 01．p63，a p53 homolog at 3q27-29，encodes multiple products with transactivating，death—inducing，and dominant—negative activities[JJ．Mol Cell，1998，2(3)：305-316．
[4] 王桂兰，陈莉，鄂群，等．病毒性肝炎、癌旁肝硬化和肝癌中Bcl．2、c-myc及p63表达[J]．I|临床与实验病理学杂志，2012，18(5)：489-492．
[5] Di Como CJ, Urist MJ, Babayan I, et al. p63 expression profiles in human normal and tumor tissues. Clin Cancer Res, 2002,8:494-501.
[6] Au NH, Gown AM, Cheang M, et al. P63 expression in lung carcinoma: a tissue microarray study of 408 cases. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2004,12:240-7.
[7] Hall PA, Campbell SJ, O'neill M, et al. Expression of the p53 homologue p63alpha and deltaNp63alpha in normal and neoplastic cells. Carcinogenesis, 2000,21:153-60.
[8] SCHMALE H,BAMBERGER C.A novel protein with strong homology to the tumor suppressor p53[J].Oncogene,1997,15(11):1363-1367.
[9] BENARD J,DOUC R S,AHOMADEGBE J C,et al.TP53 family members and human cancers[J].Hum Mutat,2003,21(3):182-191.
[10] Westfall MD, Pietenpol JA. p63: Molecular complexity in development and cancer. Carcinogenesis, 2004,25:857-64.）23van Bokhoven H, Brunner HG. Splitting p63. Am J Hum Genet, 2002,71:1-13.
[11] Massion PP, Taflan PM, Jamshedur Rahman SM, et al. Significance of p63 amplification and overexpression in lung cancer development and prognosis. Cancer Res, 2003,63:7113-21.
[12] Yang A，Kaghad M，Wang Y，et 01．p63，a p53 homolog at 3q27-29，encodes multiple products with transactivating，death—inducing，and dominant—negative activities[JJ．Mol Cell，1998，2(3)：305-316．
论文作者:吴敏
论文发表刊物:《中医学报》2015年7月
论文发表时间:2015/10/20
标签：细胞论文; 宫颈论文; 肿瘤论文; 宫颈癌论文; 基因论文; 阳性论文; 组织论文; 《中医学报》2015年7月论文;